MST4表達對MHCC97H肝癌細胞細胞因子、ERK蛋白、p-ERK蛋白表達的影響及其意義

MST4表達關于MHCC97HERK蛋白、p-ERK蛋白表達的影響及其意義趙小麗;高鵬;劉俊華;周鳳蕊;王佳樂;李廣明【摘要】目的MHCC97H肝癌細胞中絲氨酸/4/(MST4的表達與細胞因子、ERK蛋白、p-ERK蛋白表達的關系及其意義方法:將MHCC97H肝癌細胞培養(yǎng)至關于數(shù)生長期后接種于96孔板上培養(yǎng),分為空白組、高表達組(MST4轉染高表達)、低表達組(MST4轉染采用法檢測各組共培養(yǎng)24h后的MST4蛋白表達水平采用ELISA法檢測各組培養(yǎng)24h后上清液中白細胞介素-2(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-、趨化因子-2(CCL2),采用法檢測各組的細胞外信號調節(jié)激酶、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶(p-ERK)蛋白的表達,采用MTT實驗檢測3組腫瘤細胞的增殖能力采用Transwell 移能力結果高表達組的MST4蛋白表達顯著高于空白組和低表達(P＜0.05);空白組和低表達組的MST4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);高表達組的上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2水平均顯著高于空白組和低表達組(P＜0.05);空白組和低表達組的上清液中IL-6、、TNF-α、CCL2水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);空白組、高表達組和低表達組的ERK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);高表達組的p-ERK蛋白顯著高于空白組和低表達組(P＜0.05);空白組和低表達組的p-ERK蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);高表達組的MTT實驗吸光度值、Transwell 實驗MHCC97H肝癌細胞遷移數(shù)目高于空白組和低表達組(P＜0.05);空白組和低表達組的MTT實驗吸光度值、Transwell實驗MHCC97H肝癌細胞遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05).結論肝癌細胞中MST4高表達,將會激活p-ERK蛋白表達從而提高細胞因子的表達提高MHCC97H肝癌細胞的增殖、侵襲能力.【期刊名稱】《天津醫(yī)科大學學報》【年(卷),期】2019(025)002【總頁數(shù)】4頁(P124-127)【關鍵詞】MHCC97H肝癌細胞;絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4;增殖;侵襲遷移【作者】趙小麗;高鵬;劉俊華;周鳳蕊;王佳樂;李廣明【作者單位】鄭州市第六人民醫(yī)院肝病五科,鄭州450000;鄭州市第六人民醫(yī)院肝病五科450000鄭州市第六人民醫(yī)院肝病五科450000鄭州市第六人民醫(yī)院肝病五科450000鄭州市第六人民醫(yī)院肝病五科450000鄭州市第六人民醫(yī)院肝病五科,鄭州450000【正文語種】中文【中圖分類】R735.7肝癌在我國惡性腫瘤的發(fā)病率中居于高位，不管目前臨床具有放療、化療及手術等多種有效方法，但由于原發(fā)性肝癌早期臨床癥狀較為隱匿，確診時患者多存在肝癌細胞轉移并且多處于晚期，手術治療的效果顯著降低，而由于放療、化療較大的毒副作用在臨床使用受限[1]。因此，探尋肝癌的侵襲、轉移機制關于制訂有效的治療方案具有重要意義。研究[2-3]提示絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4/（mammalian4 ，MST4）關于肝癌的預后不良具有提示作用并且可加速腫瘤細胞的侵襲、生長及轉移，還可調節(jié)炎性細胞因子而介導肝癌的轉移和侵襲，而肝癌細胞上皮間質mesechymal ，EMT）轉化可被MST4激活，進而增加肝癌嚴重程度[4]。因此，本研究深入探討了MHCC97H肝癌細胞中MST4的表達與癌細胞增殖、侵襲遷移的關系，旨在為肝癌的轉移、侵襲機制提供新的思路。材料與方法MHCC97H 肝癌細胞MHCC97H 學院教研室；實驗所用質粒均由南京建成生物研究所提供。實驗藥品、儀器胎牛血清及MEM培養(yǎng)液購于美國公司；MST4（1：500）、ETA消化液（0.02%）及胰蛋白酶（0.25%）購于美國Proteintech 公司；Western試劑盒及細胞核蛋白、總蛋白試劑盒購于公司；白細胞介素-2（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、趨化因子-2（CCL2）ELISA試劑盒及Transwell 小室試劑盒均購于南京建成生物研究所；大鼠ERK及大鼠抗人磷酸化ERK多克隆抗體均購于美國上?？党巧锕荆焕备^氧化物酶標記羊抗大鼠美國B公司；酶標儀購于美國GE公司。（10）MEN5%CO2條件培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，31MHCC97H96孔板上培養(yǎng)，分為空白組、高表達組（MST4轉染高表達）、低表達組（MST4轉染）。ELISA24h后上清液中白細胞介素-2（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子TNF-α）、趨化因子-2（CCL2）。采用法檢測各組的、p-ERK的表達情況，提取總蛋白后，取20g總蛋白行SSPAGE電泳，常規(guī)轉膜后5%脫脂奶粉2h室溫封閉，訣別加入大鼠ERK及大鼠抗人磷酸化ERK一抗，次日常規(guī)洗膜后加入辣根過氧化物酶標記羊抗大鼠，室溫1h孵育，暗室曝光顯色。采用MTT實驗檢測3組腫瘤細胞的增殖能力。取關于數(shù)生長期MHCC97H肝癌細胞，接種于96孔板，每孔約2000個，每組設5個平行孔，5%CO2、條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞貼壁后每孔加入5MTT10μL，37℃4h 培養(yǎng)基后每孔加150μLMSO，振蕩后酶標儀（492nm 波長）檢測吸光度。采用Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲遷移能力。轉染的MHCC97H肝癌細胞48h培養(yǎng)后消化，取1×105 個細胞于滅菌EP管（1.5mL），細胞重懸后具體操作依據(jù)Transwell小室試劑盒說明書，24h常規(guī)培養(yǎng)后取出小室，乙醇（95%）固定，結晶紫染色后取5個視野200倍顯微鏡下觀察侵襲情況并且計數(shù)。SPSS16.0版本，數(shù)據(jù)表述采用±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用單因素方差分析法，組間比較采用LS-t試驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果3組細胞MST4MST4蛋白表達顯著高于空白組和低表達組（P＜0.05）；空白組和低表達組的MST4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.051）。13MST4蛋白表達水平比較（±s，相關于表達強度）Tab1ofMST4of3of（±s，）與高表達比較*P＜0.05組別IL-6/（pL）FP空白組0.109±0.053*51.3920.000 高表達組0.778±0.180 0.117±0.059*3IL-6、、TNF-α、CCL2水平均顯著高于空白組和低表達組（P＜0.05）；空白組和低表達組的上清液中IL-6、、TNF、CCL2水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。23組細胞的上清液中細胞因子水平比較（±s）Tab2ofthesupernatantofthreeof（±s）與高表達比較*P＜0.05組別IL-6（pL）IL-1β（pL）TNFpL）CCL2（pL）44.7±12.0*41.6±11.3*28.5±6.9*38.3±11.2*高表達組143.8±39.5182.5±28.0395.6±55.3190.5±44.0 低表達組40.0±10.5*36.8±9.3*27.0±6.3*37.0±9.8*F31.69244.52896.41752.004P0.0000.0000.0000.0003組細胞中的、p-ERKERK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高表達組的p-ERK蛋白顯著高于空白組和低表達組（P＜0.05），空白組和低表達組的p-ERK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3，圖1）。33、p-ERK蛋白表達情況（±s）Tab3ofERK,P-ERKthreeof（±s）與高表達比較*P＜0.05組別ERK（相關于表達強度）p-ERK（相關于表達強度）空白組0.831±0.1170.269±0.105*高表達組 0.859±0.1330.622±0.145 低表達組0.840±0.1080.280±0.086*F2.25935.598P0.1770.000圖1法檢測結果13組細胞的MTTMTT實驗吸光度值高于空白組和低表達組（P＜0.05）；空白組和低表達組的MTT實驗吸光度值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表4）。表43組細胞的MTT實驗檢測結果（±s）Tab4ofMTTassaythreeof（±s）與高表達比較*P＜0.05組別MHCC97H 肝癌細胞（光度值）FP空白組0.206±0.077*25.8260. 000高表達組0.375±0.083低表達組0.214±0.069*3組細胞的TranswellTranswellMHCC97H肝癌細胞遷移數(shù)目高于空白組和低表達組（P＜0.05）；空白組和低表達組的Transwell實驗MHCC97H肝癌細胞遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表5）。表53組細胞的Transwell實驗檢測結果（±s）Tab5Transwelltestofthreeof（±s）與高表達比較*P＜0.05組別MHCC97H 肝癌胞（細胞數(shù)）FP空白組88.3±14.6*35.1740.000 高表達組308.6±47.2低表達組92.0±18.6*討論肝癌是指起源于肝間葉組織和肝臟上皮細胞的惡性腫瘤，肝癌患者早期臨床癥狀多隱匿，被診斷時已多為晚期并且伴有乏力、消瘦、肝區(qū)疼痛及肝大等臨床癥狀，臨床治療困難[5-6]。此外，肝癌細胞極易出現(xiàn)轉移、浸潤，這給肝癌的根治造成了嚴重障礙。因此，研究肝癌癌細胞侵襲、轉移的相關機制并且探尋靈敏、準確克制肝癌轉移的治療靶點及方法關于改善和提高肝癌患者預后意義顯著。MST4屬于機體的重要激酶，可參與細胞骨架的形態(tài)形成、重排、細胞分化及凋亡等多種細胞活動，可促進細胞的轉化及生長[7-8MST4蛋白表達顯著高于空白組和低表達組；空白組和低表達組的MST4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義。文獻[9-10MST4的高表達具有高度相關性，這也與本研究結果一致。研究[11-12證實腫瘤的轉移及侵襲進程與炎癥因子具有密切聯(lián)系，炎癥因子可激活腫瘤細胞及炎癥細胞，關于克制免疫介導的腫瘤監(jiān)視作用顯著。IL-6、、TNF-α、CCL2均為重要的促癌炎癥因子，認為上述炎癥因子的分泌失調可促進肝癌的早期發(fā)生及進展[13]。本研究結果顯示，高表達組的上清液中IL-6、、TNF-α、CCL2水平均顯著高于空白組和低表達組；而空白組和低表達組的上清液中IL-6、、TNF-α、CCL2水平差異無統(tǒng)計學意義。上述結果提示，肝癌細[14證實，肝癌模型小鼠機體TNF-α表達水平鮮明升高，這也與本研究參與細胞生長、分化、修復和免疫進程。而慢性病大多為炎癥因子參與的病理生理進程，腫瘤的發(fā)生均是由于一個長期的慢性炎癥刺激而導致的。故而，MST4可能是經過調控IL-6、TNF-α、CCL2等炎癥因子的分泌而影響腫瘤組織的病理發(fā)展。本研究結果顯示，空白組、高表達組和低表達組的ERK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；高表達組的p-ERKp-ERK蛋白差異無統(tǒng)計學意義。上述結果提示，MHCC97HMST4高表達，將會激活p-ERK蛋白表達，從而提高細胞因子的表達，促進肝癌細胞的增殖和侵襲。MST4可經過MAPKEMT肝癌細胞轉化，關于肝癌的預后不良具有顯著的提示作用。ERKMAPK家族最重要的蛋白激酶，其磷酸化后形成p-ERK才能成為具有活性的蛋白激酶，進而調節(jié)囊括細胞分化、增殖、衰老及凋亡等多種細胞調節(jié)作用，并且調節(jié)炎癥因子的分泌及產生[15。增殖及侵襲實驗結果顯示，高表達組的MTT實驗吸光度值、Transwell實驗MHCC97H肝癌細胞遷移數(shù)目高于空白組和低表達組；空白組和低表達組的MTT實驗吸光度值、TranswellMHCC97H肝癌細胞遷移數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義。MHCC97HMST4高表達與癌細胞的遷移具有密切聯(lián)系，與上述研究結果一致。綜上所述，MHCC97H肝癌細胞中MST4高表達，將會激活p-ERK蛋白表達，從而提高細胞因子的表達，提高MHCC97H肝癌細胞的增殖和侵襲能力。參考文獻：【相關文獻】黃靜怡,廖錦堂肝癌分化程度與臨床因素的關系探究湖南師范大學學報（醫(yī)學版（2）：55張志楊，朱磊，賈平，等.柯里拉京關于肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響[J].中國實驗方劑學雜志，J（3）：88張思，劉元林，李雪，等.順鉑經過克制轉移克制基因-細胞外信號調節(jié)激酶及絲氨酸/蘇氨酸激酶激活克制HeLa細胞增殖[J].梁彥玲，崔付超，姬廣森.原發(fā)性肝癌患者行肝癌介入化療栓塞術的可行性及安全性研究癌癥進展，2018，16（7）：858吳愛兵，黎明春，麥宗炯，等