蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)藥物2講課教案

蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)藥物2一.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.一級結(jié)構(gòu)不同，生物學功能不同一級結(jié)構(gòu)指氨基酸種類數(shù)量以及排列順序，一級結(jié)構(gòu)的差異可表現(xiàn)為生物學活性的不同，如p64，加壓素與催產(chǎn)素。都是9個氨基酸，但只有3位和8位兩個氨基酸不同：加壓素：Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly催產(chǎn)素：Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly加壓素能促進血管收縮，升高血壓，促進腎小管對水的重吸收，表現(xiàn)為抗利尿的功能。催產(chǎn)素能刺激子宮平滑肌收縮，表現(xiàn)為催產(chǎn)的功能。2.一級結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵部分相同，其功能也相同如促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）是39肽激素，其1-24位氨基酸是活性所必須的關(guān)鍵部分，切去其后的25-39位氨基酸后的片斷仍具有全部活性。不同動物來源的ACTH，表現(xiàn)出相同的生化功能，其氨基酸順序差異主要在25-33位（種族差異）。31-AA33-AA 人 Ser Glu 豬 Leu Glu 牛 Ser Gln

啟示：化學合成ACTH時，只需要合成其活性所必須的關(guān)鍵部位。3、一級結(jié)構(gòu)關(guān)鍵部分的變化，其生物學活性也改變。實驗表明，多肽鏈中重要的氨基酸變化，其生物學活性也發(fā)生改變。有些關(guān)鍵氨基酸變化可使活性增加，如腦啡肽；而有些關(guān)鍵氨基酸變化可使活性大大降低，如促黃體生成釋放素。4、一級結(jié)構(gòu)的變化與疾病的關(guān)系最常見，最經(jīng)典的例子使1949年美國科學家L.Pauling提出的鐮狀細胞貧血癥（sicklecellanemia），在美國黑人中流行的一種致命的血液疾病Hbs。Hb是由兩種異型亞基α與β構(gòu)成的四聚體（α2β2）正常人Hb為α2β2與輔基共同構(gòu)成，紅細胞（RBC）呈盤狀。而Hbs僅僅是因為β鏈中6位的Glu突變?yōu)閂al而導致RBC呈鐮刀狀，產(chǎn)生溶血性貧血癥。鐮刀狀紅細胞性貧血鐮刀狀紅細胞性貧血:β亞基N端的第6號氨基酸殘基發(fā)生了變異，Glu→Val,這種變異來源于基因上遺傳信息的突變。正常DNA……TGTGGGCTTCTTTTT

mRNA……ACACCC

GAA

GAAAAAHbAN端蘇脯谷谷賴異常DNA……TGTGGGCATCTTTTT

mRNA……ACACCC

GUA

GAAAAAHbs蘇脯纈谷賴

分子?。≒auling）：蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病鐮刀型紅細胞貧血二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

肌紅蛋白（myoglobin,Mb）血紅蛋白（hemoglubin,Hb）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系

蛋白質(zhì)生物學活性（生物學功能）與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，空間結(jié)構(gòu)的變化往往會影響其生物學功能，表現(xiàn)在兩個方面：1）、蛋白質(zhì)變性，生物學活性喪失（后邊重點內(nèi)容）。2）、蛋白質(zhì)前體活化以及酶原的激活（酶的化學中講述）。1、蛋白質(zhì)前體的活化

許多蛋白質(zhì)前體并無活性或活性很低。在一定條件下，才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛刑囟?gòu)象的蛋白質(zhì)而表現(xiàn)其活性。如胰島素前體胰島素原，經(jīng)水解酶切，除去部分氨基酸（C肽，31個氨基酸）并在A鏈（21個氨基酸）和B鏈（30個氨基酸）兩條肽鏈之間形成兩對二硫鍵，在A肽鏈上形成另一對鏈內(nèi)二硫鍵，使胰島素分子具有特定的空間結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)其完整的生物活性。詳見下頁的兩張圖：2、蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象

一些蛋白質(zhì)由于受到某些因素的影響，其一級結(jié)構(gòu)不變而空間構(gòu)象發(fā)生一定的變化，導致其生物學功能的改變，稱蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象或別構(gòu)現(xiàn)象（allostericeffect）。變構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物學功能的一種普遍而又重要的現(xiàn)象，也是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物學功能極有效的方法。舉例如下：Hb通過其變構(gòu)作用來達到其結(jié)合氧和釋放氧的能力。血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)Hb的主要功能之一是體內(nèi)氧的運輸。它與氧氣的結(jié)合的飽和度隨著氧分壓的升高而增加，但不是直線關(guān)系，而是呈S型曲線。意義：曲線上部比較平坦，pO2由100mmHg降至80mmHg時，pO2下降少，所以，當血液經(jīng)pO2高的肺時，即使pO2有相當大改變，也不影響肺部Hb與氧氣結(jié)合功能。但S型曲線中段坡度較大，意味著組織中pO2稍微有下降就可引起HbO2的解離明顯增加，保證組織的氧供應(yīng)。Hb的氧飽和曲線三．蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與生物進化

從p62表3-8可見與人類親緣關(guān)系越近，其氨基酸差異越小，如黑猩猩，與人類氨基酸的差異為零，而酵母則與人類氨基酸差異為44。這也從另一方面揭示，當一種藥推向臨床時，選用的臨床前藥理實驗動物與人類親緣性越近越好。

物種間越接近，一級結(jié)構(gòu)越相似，空間結(jié)構(gòu)和功能也相似。

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，其理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化一部分與氨基酸相似，如兩性電離、等電點、呈色反應(yīng)等。也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、膠體性質(zhì)、變性等。蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點蛋白質(zhì)的等電點（pI）蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。在電場中，如果蛋白質(zhì)分子所帶正電荷多于負電荷，凈電荷為正，則向負電極移動，反之，凈電荷為負，向正極移動，這種泳動現(xiàn)象稱電泳。蛋白質(zhì)在等電點PH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象，利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進行分離純化。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)這是蛋白質(zhì)特有的性質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子量頗大，介于一萬到百萬之間，故其分子的大小已達到膠粒1～100nm范圍之內(nèi)。因此蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的性質(zhì)。蛋白質(zhì)溶液在一定條件下相當穩(wěn)定，穩(wěn)定該親水膠體的因素是：水化膜、電荷。+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)三、蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)在適當?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)的沉淀分為可逆沉淀和不可逆沉淀。(三)蛋白質(zhì)的沉淀和變性1、蛋白質(zhì)的沉淀水化膜沉淀蛋白質(zhì)的方法(1)鹽析:加入電解質(zhì)，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的現(xiàn)象.實質(zhì)：破壞蛋白質(zhì)分子的水化膜和中和其所帶的電荷。鹽析濃度:鹽析時所需電解質(zhì)的最小濃度.常用鹽析電解質(zhì):

(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl分段鹽析:利用不同蛋白質(zhì)鹽析濃度不同分分離蛋白質(zhì)的方法特點：鹽析法沉淀的蛋白質(zhì)沒有變性，去鹽后活性恢復(fù)。沉淀蛋白質(zhì)的方法(2)有機溶劑沉淀:加入極性有機溶劑，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的現(xiàn)象.實質(zhì)：破壞蛋白質(zhì)水化膜。特點：低濃度、低溫、短時間蛋白質(zhì)不變質(zhì).(3)重金屬鹽沉淀:pH>pI時沉淀蛋白質(zhì)的方法(4)生物堿試劑沉淀:

pH<pI時(5)蛋白質(zhì)互相沉淀:抗體—抗原反應(yīng)1、可逆沉淀在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。2、不可逆沉淀在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。四、蛋白質(zhì)的變性天然蛋白質(zhì)因受物理或化學因素的影響，分子構(gòu)象發(fā)生變化，致使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學功能隨之發(fā)生變化，但一級結(jié)構(gòu)未遭破壞，這種現(xiàn)象稱為變性作用。變性后的蛋白質(zhì)稱為變性蛋白。導致蛋白質(zhì)變性的因素：熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。類型：不可逆變性、可逆變性（可復(fù)性）蛋白質(zhì)的變性天然蛋白質(zhì)在某些物理、化學因素的作用下，喪失其生物活性，改變其理化性質(zhì)的現(xiàn)象。物理因素：加熱、高壓、攪拌、X-射線、紫外線、超聲波化學因素：強酸、強堿、脲、重金屬鹽、有機溶劑、生物堿等實質(zhì)：破壞副鍵，改變其構(gòu)象

變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。表現(xiàn)：物理性質(zhì)：旋光度改變、粘度和表面張力增大，溶解度降低，失去結(jié)晶性化學性質(zhì)：易被水解，易發(fā)生化學反應(yīng)。如天然乳球蛋白能與12個2,4-二硝基氟苯反應(yīng)，變性后可以增至31個。生物活性：變性蛋白質(zhì)可以部分或全部失去生物活性。蛋白質(zhì)的變性作用變性條件：物理因素：干燥、加熱、高壓、振蕩或攪拌、紫外線、X射線、超聲等等。化學因素：強酸、強堿、尿素、重金屬鹽、生物堿試劑（三氯乙酸、乙醇等等）。變性后的特點：①喪失生物活性②溶解度降低③易被水解（對水解酶的抵抗力減弱）。變性作用的利用：①消毒、殺菌、點豆腐等；②排毒（重金屬鹽中毒的急救）；③腫瘤的治療（放療殺死癌細胞）；變性作用的防治：①種子的貯存；②人體衰老（緩慢變性）；③防止紫外光灼傷皮膚。4．蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

（1）縮二脲反應(yīng)蛋白質(zhì)與新配置的堿性硫酸銅溶液反應(yīng)，呈紫色，稱為縮二脲反應(yīng)。（2）蛋白黃反應(yīng)蛋白質(zhì)中含有苯環(huán)的氨基酸，遇濃硝酸發(fā)生硝化反應(yīng)而生成黃色硝基化合物的反應(yīng)稱為蛋白黃反應(yīng)。（3）米勒反應(yīng)蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基遇到硝酸汞的硝酸溶液。（4）茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)與稀的茚三酮溶液共熱，即呈現(xiàn)藍色。六.蛋白質(zhì)的紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強的吸收。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒定。七.蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)：

兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的復(fù)合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣的反應(yīng)肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深受蛋白質(zhì)特異性影響小蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度

2.米倫氏反應(yīng)酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色3.乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸4.坂口反應(yīng)精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)）精氨酸與α-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸定量測定精氨酸5.福林試劑反應(yīng)酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸與雙縮脲法結(jié)合Lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍和磷鎢藍混合物靈敏度提高100倍6.茚三酮反應(yīng)靈敏度差7.黃蛋白反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)生成黃色化合物指甲、皮膚、毛發(fā)8.考馬斯亮藍G-250本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍色與蛋白的親和力強，靈敏度高11000微克/毫升鹽析（saltprecipitation）：中性鹽（硫酸銨等），分段鹽析有機試劑沉淀：乙醇、丙酮，低溫免疫沉淀：抗原-抗體電泳（electrophoresis）：pI，分子量的大小

透析（dialysis）：半透膜層析（chromatography）：離子交換層析、親和層析、凝膠柱層析離心、超速離心（ultracentrifugation）：沉降系數(shù)S蛋白質(zhì)的分離和純化電泳（electrophoresis）雙向凝膠電泳技術(shù)透析技術(shù)生命在于運動層析chromatography

凝膠柱層析

離子交換層析親和層析超速離心掌握蛋白質(zhì)的元素組成、基本組成單位，氨基酸成肽的連接方式；熟悉氨基酸的通式與結(jié)構(gòu)特點；氨基酸三字母英文縮寫。GSH由哪三個氨基酸殘基組成？有何生理功能？蛋白質(zhì)1~4級結(jié)構(gòu)的定義及維系這些結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用鍵？蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基本形式？并試述α-螺旋的結(jié)構(gòu)特點。何謂蛋白質(zhì)的變性？蛋白質(zhì)變性后理化性質(zhì)有何改變？蛋白質(zhì)變性在醫(yī)學上的應(yīng)用。蛋白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定的因素、鹽析、等電點及定量方法舉例說明蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)。復(fù)習要點異硫氰酸苯酯第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離

一．蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)提取的步驟：1）、材料選擇2）、細胞粉碎3）、提取二．蛋白質(zhì)的分離純化（一）根據(jù)溶解度不同的分離純化方法（二）根據(jù)分子大小不同的分離純化方法（三）根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法（四）根據(jù)配基特異性的分離純化方法（一）根據(jù)溶解度不同的分離純化方法1）、等電點沉淀法蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小，容易發(fā)生沉淀，但沉淀不完全。在等電點處再加鹽，沉淀完全。2）、鹽析沉淀法中性鹽對蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性有顯著影響，且鹽析沉淀的蛋白質(zhì)一般保持天然構(gòu)象而不變性制備具有生物學活性的蛋白質(zhì)如酶，激素等。3）、低溫有機溶劑沉淀法：有機溶劑破壞水化膜使蛋白質(zhì)沉淀，如用冷乙醇從血清中分離制備人體蛋白和球蛋白。4）、溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響溫度提高，雖然蛋白質(zhì)溶解度增加但是容易變性所以低溫操作。（二）根據(jù)分子大小不同的分離純化方法1）、透析和超濾法：透析利用蛋白質(zhì)大分子不可透過半透膜的性質(zhì)（膠體性質(zhì)）。常用于蛋白質(zhì)脫鹽，但是需要的時間長。超濾法（ultrafiltration）利用超濾膜在一定壓力或離心力作用下，大分子物質(zhì)被截留而小分子物質(zhì)則被濾出。常用于蛋白質(zhì)濃縮，脫鹽。方便快速，大容量。2）、分子排阻層析：（molecular-exclusionchromatography）利用分子篩性質(zhì)來分離蛋白質(zhì)，常用的凝膠有a）葡聚糖凝膠；b）聚丙烯酰胺凝膠；c）瓊脂糖凝膠。3）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）（三）根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法1）、電泳法：帶電荷的蛋白質(zhì)分子在電泳場中根據(jù)其電荷量和形狀不同而被分離分離的蛋白量少。（如PAGE電泳，上樣量少）2）、離子交換層析：利用蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)，使其結(jié)合在離子交換劑上，最后再將結(jié)合的目標蛋白洗脫下來，用于大量制備濃縮。但有的樹脂較貴，如DEAE，100g/400-600元（四）根據(jù)配基特異性的分離純化方法親和層析（affinitychromatography）：又稱選擇層析，功能層析等。蛋白質(zhì)與其相對應(yīng)的化合物（稱為配基）具有特異結(jié)合的能力，即親和力。這種親和力具有下列重要特性：a）、高度特異性；b）、可逆性三．蛋白質(zhì)的純度鑒定和含量測定（一）、蛋白質(zhì)純度的鑒定1）、層析法“層析純”2）、電泳法“電泳純”如SDS3）、免疫化學法“免疫純”（二）、蛋白質(zhì)的含量測定1）、凱氏定氮法（Kjedahl法）：測定基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)含N量均大約為16%。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃硫酸消化，其中的氨轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，經(jīng)強堿堿化放出氨，通過水蒸汽蒸餾法蒸出并以硼酸液吸收。最后用標準硫酸溶液滴定，測出釋放的氨含量，并計算樣品中的氮素含量，再乘以6.25即為樣品中蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法是測定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，也是藥典規(guī)定的方法。2）、福林-酚試劑法（Lowry法）原理：蛋白質(zhì)與福林-酚試劑呈色反應(yīng)（實質(zhì)上是蛋白質(zhì)分子中含酚基的Tyr）與試劑的顯色反應(yīng)。應(yīng)用最廣泛，靈敏度在ng級。3）、雙縮脲法：堿性環(huán)境下，銅離子與雙縮脲的亞酰胺鍵反應(yīng)生成紫紅