人類(lèi)細(xì)胞質(zhì)RNA提取、RT-PCR的原理、方法、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用

RNA2023/1/131精品ppt2023/1/13◆人類(lèi)細(xì)胞質(zhì)RNA提取◆RT-PCR的原理、方法◆瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用主要內(nèi)容2精品ppt

人類(lèi)細(xì)胞質(zhì)RNA提取3精品ppt2023/1/13電泳PCR提取總RNA合成cDNA第一鏈4精品ppt2023/1/13真核細(xì)胞RNA的種類(lèi)真核細(xì)胞總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3'端均有一多聚A(PolyA)尾巴。5精品ppt2023/1/13實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

RNA實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以建立一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備RNA很重要。6精品ppt2023/1/13常用的RNA酶抑制劑

1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合，進(jìn)而使RNA酶失活，有高致癌性。（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段使用）2、異硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同時(shí)也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。（合成cDNA階段使用）7精品ppt2023/1/13實(shí)驗(yàn)原理Trizol試劑盒是一種苯酚與異硫氰酸胍(GTC)的混合物，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA進(jìn)入水相，離心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白質(zhì)保留在有機(jī)相中。轉(zhuǎn)移水相，加入異丙醇沉淀RNA，從而得到純化的總RNA。8精品ppt2023/1/13

提取RNA

（一）、準(zhǔn)備試劑氯仿異丙醇75℅乙醇無(wú)RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過(guò)的水配制)

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提取RNA

（二）、操作步驟取材:用生理鹽水漱口后，含生理鹽水約2~3min，用15ml離心管（4000rpm5min）收集細(xì)胞(同管多次離心)，棄上清

沉淀中加入1mlTRIzol，旋渦震蕩10s重懸沉淀，加樣槍打勻溶液后轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管，15~30℃放置5min

加入0.2ml氯仿，用手搖晃15s，15~30℃放置5min

12000rpm離心15min10精品ppt2023/1/13

提取RNA

（二）、操作步驟小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlEp管，加入等體積的異丙醇，15~30℃放置10min

12000rpm離心15min，小心去上清，加入1ml70%乙醇，震蕩數(shù)秒，8000rpm離心5min

小心去上清，室溫干燥5min，加入10ulDEPC水，打勻

55℃水浴10分鐘助溶11精品ppt2023/1/13

提取RNA

（三）、注意事項(xiàng)1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。2、有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。3、所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。4、配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌。5、操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。12精品ppt2023/1/13

提取RNA

（三）、注意事項(xiàng)6、設(shè)置RNA操作專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專(zhuān)用。7、防止RNA酶污染（1）RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等（2）嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染。（3）最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶；而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。13精品ppt2023/1/13

RNA保存溶解在無(wú)RNase的水或TE中，在-70℃或更低溫度中保存時(shí)間在一年以內(nèi)，但避免反復(fù)凍融，應(yīng)分裝保存。從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需溶解在去離子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使用RNA時(shí)，可以加入NaAc至終濃度0.3M，12000×g離心5分鐘，70%乙醇洗滌后再用無(wú)RNase的水或TE溶解。14精品pptRT-PCR的原理、方法15精品ppt2023/1/13實(shí)驗(yàn)原理1、單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制。2、PCR技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)分三步：變性，退火，延伸。3、逆轉(zhuǎn)錄酶?？梢砸訰NA為模板合成cDNA第一條鏈，或者以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA。principedoesmatter

可見(jiàn)，RT-PCR是一種將cDNA合成與PCR技術(shù)結(jié)合分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。16精品pptRNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNase降解RNA

單鏈DNADNA聚合酶cDNART-PCRTaq酶17精品ppt2023/1/131、引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。2、引物設(shè)計(jì)原則的把握：（1）引物長(zhǎng)度:一般為15～30bp（2）堿基分布（3）3‘端要求（4）引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)（5）引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)（6）同源序列

（7）5’端無(wú)嚴(yán)格限制

操作步驟

（一）引物設(shè)計(jì)18精品ppt2023/1/13

操作步驟

（二）RNA的提取19精品ppt2023/1/13

操作步驟

（二）RNA的提取20精品ppt2023/1/13（1）兩步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成a常用的反應(yīng)體系10×RT反應(yīng)緩沖液2uldNTPMixture（各10mM）2ulRNAaseinhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)181ul逆轉(zhuǎn)錄酶1ul總RNA0.5~1ugDEPC－free水補(bǔ)足體系至20ul21精品ppt2023/1/13（1）兩步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成b操作在發(fā)給每人一份的已制備分裝的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管里加入8ul總RNA溶液

0.2mlEp管，迷你離心機(jī)離心數(shù)秒，放置PCR儀中42℃30min（合成cDNA第一鏈）85℃5min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）↓↓22精品ppt2023/1/13（2）一步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成

在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在同一管內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)勢(shì)：在處理大量樣品時(shí)易于操作；減少殘余污染；可以得到更高的靈敏度。缺點(diǎn)：無(wú)法優(yōu)化反應(yīng)條件；一旦失敗，必須重新提取總RNA。

23精品ppt2023/1/13（2）一步法RT-PCR

操作步驟

（三）cNDA合成·0.1-1ug總RNA200一500umol/L的dNTP(每種)0.5umol／L基因特異引物（上下游）200UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶1×Taq聚合酶緩沖液0.5-15mmol／LMgCI21mmo1／LDTT1.5UTaq聚臺(tái)酶終體積為50ul。24精品ppt2023/1/13（1）50ulPCR體系的組成（即一步法）：

操作步驟

（四）PCR擴(kuò)增25精品ppt2023/1/13（2）PCR反應(yīng)過(guò)程：

操作步驟

（四）PCR擴(kuò)增26精品ppt2023/1/13（1）引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下2℃變化尋找最佳退火溫度。（2）此外Mg2＋濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2mM左右。（3）引物和模板的量等。

操作步驟

（五）PCR條件的優(yōu)化27精品ppt2023/1/13

根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長(zhǎng)度產(chǎn)物所需凝膠濃度）。

取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10V/cm電泳45－60min。成像系統(tǒng)成像分析。

操作步驟

（六）產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定

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瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用29精品ppt2023/1/13實(shí)驗(yàn)原理1、瓊脂糖為鏈狀多糖→繩狀瓊脂糖束→大網(wǎng)孔型凝膠——分離、鑒定、純化DNA2、影響DNA遷移率的因素：DNA分子的大小、構(gòu)象，凝膠濃度，電壓，電泳緩沖液的組成principedoesmatter瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%線狀DNA大小/kb

0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.0

30-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.0530精品ppt2023/1/13染色和照相電泳

樣品的制備與加樣選擇電泳類(lèi)型選擇電泳緩沖體系瓊脂糖凝膠的制備31精品ppt2023/1/13選擇電泳類(lèi)型用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。

STEPSdoesmatter32精品ppt2023/1/13選擇緩沖液系統(tǒng)

常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。

STEPSdoesmatter33精品ppt2023/1/13凝膠的制備以稀釋的電泳緩沖液為溶劑，用微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。

STEPSdoesmatter34精品ppt2023/1/13樣品配制與加樣

DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。

STEPSdoesmatter35精品ppt2023/1/13電泳

在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。因此為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。

STEPSdoesmatter36精品ppt2023/1/13染色與照相

常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

STEPSdoesmatter37精品ppt38精品ppt2023/1/13

結(jié)果分析

（一）、影響瓊脂糖凝膠電泳的因素DNA分子的大小：實(shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比；瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大39精品ppt2023/1/13

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ唠娪緯r(shí)ladder扭曲配膠的緩沖液與電泳的緩沖液不是同時(shí)配制。同時(shí)配制，電泳緩沖液高出膠的1-2mm即可。電泳時(shí)電壓過(guò)高電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm。40精品ppt2023/1/13

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ逥NA帶缺尖DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。分子大小相近的DNA帶不易分辨增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確凝膠濃度DNA變性電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上個(gè)分析。41精品ppt2023/1/13

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ邘趸驘o(wú)DNA帶DNA上樣量不夠增加DNA上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高，上樣量可適當(dāng)降低。DNA降解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免核酸酶污染。DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。EB染色的DNA所用光源不合適應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm）的紫外光源。42精品ppt2023/1/13

結(jié)果分析

（二）、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ叱霈F(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶酶量多或者酶的質(zhì)量差，dNTP濃度高，Mg2+濃度高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)多。減少酶量或更換酶，減少dNTP濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度，增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。不規(guī)則DNA帶遷移電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度<30℃，巨大DNA鏈電泳， 溫度<15℃，檢查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換。DNA變性電泳前勿加熱，用20mMNaCl