分子生物學實驗七

分子生物學實驗實驗七限制性內切酶酶切質粒DNA

1第3周分子生物學實驗儀器設備簡介和實驗有關內容介紹第4周從植物組織提取DNA第5周從動物組織提取DNA第7周原核細胞質粒DNA的提取第8周核酸的瓊脂糖凝膠電泳第9周紫外吸收測定核酸含量第10周限制性內切酶酶切質粒DNA第11周凝膠電泳回收和純化DNA片段第12周細菌感受態(tài)的制備第13周質粒DNA的轉化第14周目的基因的PCR擴增與檢測第15周原核蛋白質SDS電泳第17周考試21、實驗原理

限制性內切酶或限制性核酸內切酶（RestrictionEnzymeorRestrictionEndonuclease,簡稱RE）是一類能夠識別雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶，并在此特異位點將雙鏈DNA切斷。限制性內切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，也稱細菌性酶。限制性內切酶是細菌為防范外源DNA而產生的一類酶，它可識別DNA雙鏈上的特異性位點，以內切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵，并從該點將DNA分子切斷，產生DNA片段的5為P，3為OH,而宿主內的DNA則因它的一些特異性位點常常由于其中的一個堿基的甲基化被保護起來,使此位點不再成為限制酶的底物。限制性內切酶是基因工程技術中不可缺少的工具，也稱為工具酶。

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限制性內切酶的高度特異性與反應條件有關。每種酶都要求最適合的反應條件，如緩沖液和甘油濃度等，當這些條件改變時，某些酶的識別序列將改變。限制性內切酶多保存在甘油之中，商品酶制劑一般含有50%的甘油，它起著穩(wěn)定酶活性的作用。而在酶反應體系中，甘油量太大會抑制酶的活性。為此，要求一般酶甘油制劑的使用量應小于反應體系體積的10%。例如反應體積為20l時，使用的酶制劑不可大于2l。

一般限制性內切酶的反應緩沖液要求有三種基本物質：Tris-Hcl（pH7.5）、MgCl2和NaCl。不同酶需要這三種物質在緩沖液中的濃度各不相同。DTT（二硫蘇代糖）或用-巰基乙醇，主要起保護酶活性的作用。4反應體系中限制性內切酶的用量與如下兩方面有關系：（1）DNA的分子量：酶切相同重量的DNA，分子量大的，分子數(shù)就少，所以使用的酶量就少些，因而酶用量與DNA的分子量成反比。（2）酶切位點的多少：在DNA分子中切口多的酶，因每個切口都需要酶作用，因而酶的用量就相對多些，切口少的酶則用量就相對少些，所以酶用量與DNA分子上的切口數(shù)成正比。52、限制性內切酶消化質粒DNA的反應本實驗用BamHI和HindIII酶“切割”質粒pMD18-T-kfNHX。已知pMD18-T-kfNHX質粒上只1個BamHI和HindIII酶切口，kfNHX的堿基序列長為約1700bp,被酶切后，出現(xiàn)兩條帶在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中可以觀察到。63、材料與儀器

3.1質粒：根據具體情況而定；3.2限制性核酸內切酶BamHI和HindIII；3.3微量加樣器；3.4EP管；3.5水浴鍋或37C培養(yǎng)箱；3.6電泳設備；3.7凝膠成像系統(tǒng)

4、試劑與配制20ul反應體系：10×Kbuffer2μl，BamHI0.5μl，HindIII

0.5μl,sample:根據質粒樣品的濃度加8μl，加水補足20μl37C反應3-4小時。0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，照相貯存75、思考題：1.影響酶切結果的主要因素有哪些，請正確分析你的實驗結果。2.限制性內切酶可用于分子生物學的哪些方面？8圖1.ＲＴ-ＰＣＲ擴增產物的凝膠電泳圖譜Fig.1AmplificationofKfNHXbyRT-PCR