GFP綠色熒光蛋白的應用前景

GFP綠色熒光蛋白的應用前景1、熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)及其作用機理2、GFP在生物領(lǐng)域的最新應用進展3、GFP在動物營養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域的研究和應用GFP應用具體應用作為轉(zhuǎn)基因植物和動物的篩選標記用于定位標記跟蹤觀察微生物發(fā)育機理研究用于細胞篩選用于免疫學2、GFP在生物領(lǐng)域的最新應用進展2.1顯像技術(shù)2.2示蹤技術(shù)2.4生物光學感受器2.5篩選技術(shù)2.3報告基因2.6抗體生產(chǎn)2.1顯像技術(shù)由于熒光蛋白有多種顏色，且穩(wěn)定、無毒，所以熒光蛋白可使得動物體內(nèi)復雜的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可視化。Livet等用多種不同顏色的熒光蛋白對神經(jīng)系統(tǒng)進行了基因標記，使得我們能夠觀察到大腦的集成線路圖，可以直觀地看到神經(jīng)細胞以及細胞間的相互作用。圖6中五彩繽紛的色彩形象地展現(xiàn)了復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡。另外，熒光蛋白還可用于生物發(fā)育領(lǐng)域，能夠形象的觀察生物體的器官組織結(jié)構(gòu)的變化，隨著發(fā)育學研究的深入，熒光蛋白必將成為強有力的工具。Wan等發(fā)現(xiàn)用GFP標記斑馬魚的胰臟，可以清楚地觀察到胰臟外分泌部位的發(fā)育（圖７）。2.2示蹤技術(shù)一般的熒光染料標記的微生物，由于其生長快、分裂多，染料可在短時間內(nèi)被稀釋，所以不能實時準確地觀察微生物侵入活體動物以及細胞的過程。近年發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白可用于示蹤流行性病毒對活體細胞的感染，流行性病毒可被實時監(jiān)控，借助于這一新技術(shù)，我們可以更深入地研究其感染方式。Zhao等發(fā)現(xiàn)用GFP標記細菌，可以詳細地對細菌的入侵進行時空檢測，以確定細菌特異性的感染部位以及傳染源的空間位移。GFP克服了一般熒光染料所帶有的缺陷，GFP必將會進一步地取代一般的熒光染料，有效地幫助學術(shù)研究者觀察分析細菌、病毒的感染方式。2.3報告基因由于熒光蛋白發(fā)光團的形成不具物種專一性，可發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光，所以轉(zhuǎn)入宿主細胞后的熒光蛋白基因很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是理想的報告基因。熒光蛋白作為報告基因，可顯示生物體１個或多個基因的表達的狀況，并可對活體細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)運動和細胞元件間的互作進行實時熒光顯像，且直觀、準確。Gregor等構(gòu)建了bicoid（一種成形素）與GFP的融合蛋白，通過直接光漂白和間接對bicoid擴散常數(shù)的估測，使研究者能直接地觀察到bicoid輸送的實時影像，幫助研究者更好地了解bicoid成形素梯度的穩(wěn)定性和核動態(tài)。2.4生物光學感受器熒光蛋白由于其獨特的光信號轉(zhuǎn)導機制，適于用作活細胞內(nèi)的光學感受器?，F(xiàn)在許多研究者將具有信號轉(zhuǎn)導功能的分子識別位點結(jié)合到熒光蛋白分子上來設(shè)計成生物感受器。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用GFP感受器可以檢測多種分子（如核酸、激素）的表達狀況，甚至可以檢測活體細胞中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，其潛在應用前景極為廣闊。Taniguchi等構(gòu)建了一種黃色熒光蛋白融合庫（YFPfusionlibrary）作為單分子感受器，可以有效用于分析大腸桿菌單細胞中蛋白質(zhì)和mRNA表達水平的關(guān)系。2.5篩選技術(shù)利用GFP可顯色的特點，我們還可對需要的物質(zhì)進行篩選和純化。比如增強型GFP（enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP）融合蛋白可被熒光激活細胞分選術(shù)（FACS）有效地篩選，生產(chǎn)出穩(wěn)定的人類糖皮質(zhì)激素受體配體結(jié)合域（humanglucocorticoidreceporligand-bindingdomain，hGRLBD）。不僅如此，GFP還可用于檢驗玉米胚乳和胚芽提取物的篩選和純化重組蛋白的效力。GFP篩選技術(shù)已在生命科學的多個領(lǐng)域得到了廣泛應用和認可。2.6抗體生產(chǎn)由于新型病毒的鑒別特征有限，使得傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法不能被有效運用，生產(chǎn)抗體便遇到了極大的困難，而GFP的發(fā)現(xiàn)及其在分子生物學中的應用解決了這一難題。Steela等將新型的病毒—葫蘆黃發(fā)育遲緩癥病毒（cucurbityellowstuntingdisordervirus，YSDV）外殼蛋白植入GFP基因，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，再將農(nóng)桿菌接入本生煙用于生產(chǎn)該病毒，然后再用GFP純化的重組蛋白－CYSDV便可制備多克隆免疫抗體。快速靈活的GFP抗體生產(chǎn)技術(shù)在應對新型流行性病毒、及時控制疫情等方面必定會發(fā)揮巨大的作用。3、GFP在動物營養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域的研究和應用2.1顯像技術(shù)2.2示蹤技術(shù)2.4生物光學感受器2.5篩選技術(shù)2.3報告基因2.6抗體生產(chǎn)3.1益生菌在動物胃腸道中的動態(tài)檢測GFP在生物學方面的技術(shù)開發(fā)和應用推廣，必然推動動物營養(yǎng)學研究的發(fā)展?，F(xiàn)在GFP已經(jīng)應用于飼用益生菌的動態(tài)監(jiān)測，并且表現(xiàn)出了良好的研究和應用前景。利用GFP示蹤技術(shù)，可以直觀地觀察到GFP重組菌在腸道黏膜中的定植、在局部區(qū)域的繁殖以及擴散到整個腸道的過程，使整個動態(tài)過程可視化，這對研究益生菌的益生機制提供了有力的技術(shù)。這些研究成果為深入地探索微生態(tài)制劑的作用機制提供了依據(jù)，同時進一步證實了GFP作為新的基因報告在微生物動態(tài)檢測方面有著廣泛的應用前景。3.2營養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道內(nèi)的動態(tài)觀察邊慧慧等首次采用帶有GFP質(zhì)粒的大腸桿菌作為蛋白質(zhì)指示劑，簡單、直觀、形象地指示了魚類攝食飼料后不同時間食糜蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)的分布狀況。同時，利用GFP還可以通過測定黏膜上皮細胞、組織的熒光強度初步估計蛋白質(zhì)的消化吸收情況。采用GFP觀測營養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道內(nèi)的流通與變化，使得抽象的營養(yǎng)消化與吸收變得清晰、具體。3.3飼料原料的改良由于GFP熒光的產(chǎn)生無需輔助因子和底物，可在活細胞或組織中進行熒光檢測，不會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生毒害，所以GFP已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中已經(jīng)成為了一個非常有效的報告基因。提高飼用植物中的含硫氨基酸水平是動物營養(yǎng)研究者們關(guān)注的一個焦點，因為含硫氨基酸對奶制品、羊毛產(chǎn)量及肉類都有重要的影響，關(guān)寧等將玉米醇溶蛋白（γ-zein，有含硫氨基酸的蛋白質(zhì)）基因和玉米醇溶蛋白和菜豆球蛋白的融合基因（ｚ-eoli）分別與植物表達載體pCABIA1302的GFP報告基因融合，通過遺傳轉(zhuǎn)化研究了γ-zein和ｚ-eoli基因在洋蔥表皮細胞和煙草中的表達情況，并驗證所構(gòu)建植物表達載體的正確性，為研究三葉草、紫花苜蓿等豆科牧草營養(yǎng)品質(zhì)改良奠定了良好的基礎(chǔ)。所以利用GFP檢測營養(yǎng)成分的分布和含量將成為分析飼料原料改良效果的有力工具。3.4水生環(huán)境檢測人類的生產(chǎn)、生活活動對環(huán)境的影響逐漸增強，環(huán)境日益受到來自生產(chǎn)、生活的廢棄物的污染，水質(zhì)的污染就是一個較為嚴重的問題，污染物大多是來自工業(yè)廢物和污水。被污染的水質(zhì)對魚體的影響通常表現(xiàn)出生殖機能障礙、雄性魚體雌性化等。目前，人們已經(jīng)將生物作為生物傳感器的敏感元件來檢測污染水平。研究發(fā)現(xiàn)可通過將GFP基因重組到可與水中污染物發(fā)生反應的啟動子中。有研究表明，GFP作為報告基因能夠被用來作為轉(zhuǎn)基因有機體連續(xù)的定性生物傳感器測定水中污染物的水平，并在消除酶或特異性蛋白質(zhì)試驗時，提供快速而有效的結(jié)果。3.5酶活測定Malik等發(fā)現(xiàn)利用eGFP作為底物，通過測定熒光強度可以測定豬的胃蛋白酶的活性。這種方法有助于準確、直觀測定動物腸道內(nèi)容物消化酶的體外消化能力。3.6營養(yǎng)代謝研究礦物質(zhì)元素—鐵是動物和人健康生長不可或缺的。鐵不僅僅是血紅蛋白和肌紅蛋白的原料，而且還作為多種酶的成分和激活劑參與機體內(nèi)的物質(zhì)代謝。所以研究分析鐵離子在細胞內(nèi)的代謝狀態(tài)將有助于確定飼料中的鐵添加量以及探討鐵離子作為營養(yǎng)元素的分子作用機制。Henderson等通過將鐵離子反應原件（ironresponsiveelement，IRE）重組到GFP質(zhì)粒中，發(fā)現(xiàn)可以檢測活細胞中鐵離子調(diào)節(jié)蛋白（ironregulatoryprotein，IRP）的活力，確定鐵離子在細胞內(nèi)的狀態(tài)。例如：如果細胞內(nèi)的鐵離子的濃度減少了，那么細胞內(nèi)的熒光蛋白的含量就減少了，說明IRP結(jié)合到了IRE上，并阻斷了蛋白質(zhì)翻譯。這為準確分析外源及內(nèi)源刺激對鐵離子代謝的影響提供了動態(tài)檢測技術(shù)。

此外，GFP還被用于時空檢測分析磷脂酰纖維醇的代謝與細胞內(nèi)的鈣離子的水平的相關(guān)性、維生素Ｅ轉(zhuǎn)運蛋白對維生素Ｅ的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)、高氯酸鹽在甲狀腺細胞中的累積以及測定胰島素樣生長因子Ⅰ、游離脂肪酸的含量等。GFP在代謝方面的推廣應用必然帶動動物分子營養(yǎng)學的研究?，F(xiàn)代成像系統(tǒng)的完善將為動物營養(yǎng)分子代謝的研究提供有力的工具。熒光蛋白基因?qū)⒆鳛閳蟾婊驅(qū)⒃趧游餇I養(yǎng)成分代謝、酶類活性測定、蛋白質(zhì)分子動態(tài)檢測等方面呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。熒光蛋白使得變幻無窮的大自然生物現(xiàn)象可視化，這無疑是一大奇跡。熒光蛋白可用于時空監(jiān)控生物體內(nèi)的各種生物現(xiàn)象，例如基