GFP綠色熒光蛋白的應(yīng)用前景

GFP綠色熒光蛋白的應(yīng)用前景1、熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)理2、GFP在生物領(lǐng)域的最新應(yīng)用進(jìn)展3、GFP在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用GFP應(yīng)用具體應(yīng)用作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記用于定位標(biāo)記跟蹤觀察微生物發(fā)育機(jī)理研究用于細(xì)胞篩選用于免疫學(xué)2、GFP在生物領(lǐng)域的最新應(yīng)用進(jìn)展2.1顯像技術(shù)2.2示蹤技術(shù)2.4生物光學(xué)感受器2.5篩選技術(shù)2.3報(bào)告基因2.6抗體生產(chǎn)2.1顯像技術(shù)由于熒光蛋白有多種顏色，且穩(wěn)定、無(wú)毒，所以熒光蛋白可使得動(dòng)物體內(nèi)復(fù)雜的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可視化。Livet等用多種不同顏色的熒光蛋白對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了基因標(biāo)記，使得我們能夠觀察到大腦的集成線路圖，可以直觀地看到神經(jīng)細(xì)胞以及細(xì)胞間的相互作用。圖6中五彩繽紛的色彩形象地展現(xiàn)了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。另外，熒光蛋白還可用于生物發(fā)育領(lǐng)域，能夠形象的觀察生物體的器官組織結(jié)構(gòu)的變化，隨著發(fā)育學(xué)研究的深入，熒光蛋白必將成為強(qiáng)有力的工具。Wan等發(fā)現(xiàn)用GFP標(biāo)記斑馬魚(yú)的胰臟，可以清楚地觀察到胰臟外分泌部位的發(fā)育（圖７）。2.2示蹤技術(shù)一般的熒光染料標(biāo)記的微生物，由于其生長(zhǎng)快、分裂多，染料可在短時(shí)間內(nèi)被稀釋?zhuān)圆荒軐?shí)時(shí)準(zhǔn)確地觀察微生物侵入活體動(dòng)物以及細(xì)胞的過(guò)程。近年發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白可用于示蹤流行性病毒對(duì)活體細(xì)胞的感染，流行性病毒可被實(shí)時(shí)監(jiān)控，借助于這一新技術(shù)，我們可以更深入地研究其感染方式。Zhao等發(fā)現(xiàn)用GFP標(biāo)記細(xì)菌，可以詳細(xì)地對(duì)細(xì)菌的入侵進(jìn)行時(shí)空檢測(cè)，以確定細(xì)菌特異性的感染部位以及傳染源的空間位移。GFP克服了一般熒光染料所帶有的缺陷，GFP必將會(huì)進(jìn)一步地取代一般的熒光染料，有效地幫助學(xué)術(shù)研究者觀察分析細(xì)菌、病毒的感染方式。2.3報(bào)告基因由于熒光蛋白發(fā)光團(tuán)的形成不具物種專(zhuān)一性，可發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光，所以轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后的熒光蛋白基因很穩(wěn)定，對(duì)多數(shù)宿主的生理無(wú)影響，是理想的報(bào)告基因。熒光蛋白作為報(bào)告基因，可顯示生物體１個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的狀況，并可對(duì)活體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞元件間的互作進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光顯像，且直觀、準(zhǔn)確。Gregor等構(gòu)建了bicoid（一種成形素）與GFP的融合蛋白，通過(guò)直接光漂白和間接對(duì)bicoid擴(kuò)散常數(shù)的估測(cè)，使研究者能直接地觀察到bicoid輸送的實(shí)時(shí)影像，幫助研究者更好地了解bicoid成形素梯度的穩(wěn)定性和核動(dòng)態(tài)。2.4生物光學(xué)感受器熒光蛋白由于其獨(dú)特的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，適于用作活細(xì)胞內(nèi)的光學(xué)感受器?，F(xiàn)在許多研究者將具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的分子識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合到熒光蛋白分子上來(lái)設(shè)計(jì)成生物感受器。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用GFP感受器可以檢測(cè)多種分子（如核酸、激素）的表達(dá)狀況，甚至可以檢測(cè)活體細(xì)胞中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，其潛在應(yīng)用前景極為廣闊。Taniguchi等構(gòu)建了一種黃色熒光蛋白融合庫(kù)（YFPfusionlibrary）作為單分子感受器，可以有效用于分析大腸桿菌單細(xì)胞中蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平的關(guān)系。2.5篩選技術(shù)利用GFP可顯色的特點(diǎn)，我們還可對(duì)需要的物質(zhì)進(jìn)行篩選和純化。比如增強(qiáng)型GFP（enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP）融合蛋白可被熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）有效地篩選，生產(chǎn)出穩(wěn)定的人類(lèi)糖皮質(zhì)激素受體配體結(jié)合域（humanglucocorticoidreceporligand-bindingdomain，hGRLBD）。不僅如此，GFP還可用于檢驗(yàn)玉米胚乳和胚芽提取物的篩選和純化重組蛋白的效力。GFP篩選技術(shù)已在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。2.6抗體生產(chǎn)由于新型病毒的鑒別特征有限，使得傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法不能被有效運(yùn)用，生產(chǎn)抗體便遇到了極大的困難，而GFP的發(fā)現(xiàn)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用解決了這一難題。Steela等將新型的病毒—葫蘆黃發(fā)育遲緩癥病毒（cucurbityellowstuntingdisordervirus，YSDV）外殼蛋白植入GFP基因，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，再將農(nóng)桿菌接入本生煙用于生產(chǎn)該病毒，然后再用GFP純化的重組蛋白－CYSDV便可制備多克隆免疫抗體?？焖凫`活的GFP抗體生產(chǎn)技術(shù)在應(yīng)對(duì)新型流行性病毒、及時(shí)控制疫情等方面必定會(huì)發(fā)揮巨大的作用。3、GFP在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用2.1顯像技術(shù)2.2示蹤技術(shù)2.4生物光學(xué)感受器2.5篩選技術(shù)2.3報(bào)告基因2.6抗體生產(chǎn)3.1益生菌在動(dòng)物胃腸道中的動(dòng)態(tài)檢測(cè)GFP在生物學(xué)方面的技術(shù)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用推廣，必然推動(dòng)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的發(fā)展?，F(xiàn)在GFP已經(jīng)應(yīng)用于飼用益生菌的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并且表現(xiàn)出了良好的研究和應(yīng)用前景。利用GFP示蹤技術(shù)，可以直觀地觀察到GFP重組菌在腸道黏膜中的定植、在局部區(qū)域的繁殖以及擴(kuò)散到整個(gè)腸道的過(guò)程，使整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程可視化，這對(duì)研究益生菌的益生機(jī)制提供了有力的技術(shù)。這些研究成果為深入地探索微生態(tài)制劑的作用機(jī)制提供了依據(jù)，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了GFP作為新的基因報(bào)告在微生物動(dòng)態(tài)檢測(cè)方面有著廣泛的應(yīng)用前景。3.2營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道內(nèi)的動(dòng)態(tài)觀察邊慧慧等首次采用帶有GFP質(zhì)粒的大腸桿菌作為蛋白質(zhì)指示劑，簡(jiǎn)單、直觀、形象地指示了魚(yú)類(lèi)攝食飼料后不同時(shí)間食糜蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)的分布狀況。同時(shí)，利用GFP還可以通過(guò)測(cè)定黏膜上皮細(xì)胞、組織的熒光強(qiáng)度初步估計(jì)蛋白質(zhì)的消化吸收情況。采用GFP觀測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道內(nèi)的流通與變化，使得抽象的營(yíng)養(yǎng)消化與吸收變得清晰、具體。3.3飼料原料的改良由于GFP熒光的產(chǎn)生無(wú)需輔助因子和底物，可在活細(xì)胞或組織中進(jìn)行熒光檢測(cè)，不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒害，所以GFP已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因植物中已經(jīng)成為了一個(gè)非常有效的報(bào)告基因。提高飼用植物中的含硫氨基酸水平是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究者們關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)，因?yàn)楹虬被釋?duì)奶制品、羊毛產(chǎn)量及肉類(lèi)都有重要的影響，關(guān)寧等將玉米醇溶蛋白（γ-zein，有含硫氨基酸的蛋白質(zhì)）基因和玉米醇溶蛋白和菜豆球蛋白的融合基因（ｚ-eoli）分別與植物表達(dá)載體pCABIA1302的GFP報(bào)告基因融合，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化研究了γ-zein和ｚ-eoli基因在洋蔥表皮細(xì)胞和煙草中的表達(dá)情況，并驗(yàn)證所構(gòu)建植物表達(dá)載體的正確性，為研究三葉草、紫花苜蓿等豆科牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改良奠定了良好的基礎(chǔ)。所以利用GFP檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)成分的分布和含量將成為分析飼料原料改良效果的有力工具。3.4水生環(huán)境檢測(cè)人類(lèi)的生產(chǎn)、生活活動(dòng)對(duì)環(huán)境的影響逐漸增強(qiáng)，環(huán)境日益受到來(lái)自生產(chǎn)、生活的廢棄物的污染，水質(zhì)的污染就是一個(gè)較為嚴(yán)重的問(wèn)題，污染物大多是來(lái)自工業(yè)廢物和污水。被污染的水質(zhì)對(duì)魚(yú)體的影響通常表現(xiàn)出生殖機(jī)能障礙、雄性魚(yú)體雌性化等。目前，人們已經(jīng)將生物作為生物傳感器的敏感元件來(lái)檢測(cè)污染水平。研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)將GFP基因重組到可與水中污染物發(fā)生反應(yīng)的啟動(dòng)子中。有研究表明，GFP作為報(bào)告基因能夠被用來(lái)作為轉(zhuǎn)基因有機(jī)體連續(xù)的定性生物傳感器測(cè)定水中污染物的水平，并在消除酶或特異性蛋白質(zhì)試驗(yàn)時(shí)，提供快速而有效的結(jié)果。3.5酶活測(cè)定Malik等發(fā)現(xiàn)利用eGFP作為底物，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度可以測(cè)定豬的胃蛋白酶的活性。這種方法有助于準(zhǔn)確、直觀測(cè)定動(dòng)物腸道內(nèi)容物消化酶的體外消化能力。3.6營(yíng)養(yǎng)代謝研究礦物質(zhì)元素—鐵是動(dòng)物和人健康生長(zhǎng)不可或缺的。鐵不僅僅是血紅蛋白和肌紅蛋白的原料，而且還作為多種酶的成分和激活劑參與機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)代謝。所以研究分析鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)將有助于確定飼料中的鐵添加量以及探討鐵離子作為營(yíng)養(yǎng)元素的分子作用機(jī)制。Henderson等通過(guò)將鐵離子反應(yīng)原件（ironresponsiveelement，IRE）重組到GFP質(zhì)粒中，發(fā)現(xiàn)可以檢測(cè)活細(xì)胞中鐵離子調(diào)節(jié)蛋白（ironregulatoryprotein，IRP）的活力，確定鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)。例如：如果細(xì)胞內(nèi)的鐵離子的濃度減少了，那么細(xì)胞內(nèi)的熒光蛋白的含量就減少了，說(shuō)明IRP結(jié)合到了IRE上，并阻斷了蛋白質(zhì)翻譯。這為準(zhǔn)確分析外源及內(nèi)源刺激對(duì)鐵離子代謝的影響提供了動(dòng)態(tài)檢測(cè)技術(shù)。

此外，GFP還被用于時(shí)空檢測(cè)分析磷脂酰纖維醇的代謝與細(xì)胞內(nèi)的鈣離子的水平的相關(guān)性、維生素Ｅ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)維生素Ｅ的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)、高氯酸鹽在甲狀腺細(xì)胞中的累積以及測(cè)定胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ、游離脂肪酸的含量等。GFP在代謝方面的推廣應(yīng)用必然帶動(dòng)動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究?，F(xiàn)代成像系統(tǒng)的完善將為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)分子代謝的研究提供有力的工具。熒光蛋白基因?qū)⒆鳛閳?bào)告基因?qū)⒃趧?dòng)物營(yíng)養(yǎng)成分代謝、酶類(lèi)活性測(cè)定、蛋白質(zhì)分子動(dòng)態(tài)檢測(cè)等方面呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。熒光蛋白使得變幻無(wú)窮的大自然生物現(xiàn)象可視化，這無(wú)疑是一大奇跡。熒光蛋白可用于時(shí)空監(jiān)控生物體內(nèi)的各種生物現(xiàn)象，例如基