實(shí)驗(yàn)五大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

實(shí)驗(yàn)五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化一、

概述在自然界條件下，很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌結(jié)合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體上，一般缺乏轉(zhuǎn)移所必須的mob基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)胞，需誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA.

轉(zhuǎn)化（transformation）是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。常用的細(xì)菌菌株如：DH5,JM109等。實(shí)驗(yàn)五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞經(jīng)一些特殊方法（如電激法、CaCl2、RbCl（KCl）等化學(xué)試劑）處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞狀態(tài)，這些細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備的方法中，RbCl（KCl）方法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，但CaCl2方法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，因此CaCl2方法使用更廣泛。實(shí)驗(yàn)五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素：1、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)存于40C

的培養(yǎng)基，最好從-700C或-200C甘油保存的菌種直接轉(zhuǎn)接用于感受態(tài)細(xì)胞制備。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，(如DH5的OD600為0.5左右，細(xì)胞密度為5107)。2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：質(zhì)粒DNA應(yīng)主要為cccDNA;轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但濃度過高或體積過大，轉(zhuǎn)化效率下降；一般1ng的cccDNA即可使50l的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般DNA溶液體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。3、試劑質(zhì)量：所用試劑，如CaCl2等需用最高純度（如GR或

AR）,并用超凈水（如MillQ）.4、防止雜菌和雜DNA污染：所有用到的器皿均應(yīng)無菌，不被雜DNA污染。實(shí)驗(yàn)五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化試劑

1、LB液體培養(yǎng)基及不含Amp的LB平板2、含Amp的LB平板：熔化的LB固體培養(yǎng)基在600C左右時(shí)加Amp至50-100g/ml.混勻后鋪板。3、50mmol/LCaCl2溶液:0.28g

CaCl2的定容于1000ml蒸餾水，滅菌。4、含15%甘油的50mmol/LCaCl2溶液:0.28g

CaCl2，加50ml蒸餾水,加15ml甘油，定容于1000ml蒸餾水，滅菌。

實(shí)驗(yàn)五、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化操作步驟感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）受體菌的培養(yǎng)：從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5單菌落，接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C下震蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期）。將菌液以1%至2%比例接種于100mlLB培養(yǎng)液中，370C震蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)左右至OD600為0.5左右。受體菌的處理：1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管，冰上放置10min，然后于40C下5000rpm離心10min.2、沉淀細(xì)菌用10ml預(yù)冷的50mmol/L的CaCl2溶液輕輕懸浮，冰上放置15-30min，然后于40C下5000rpm離心10min.3、沉淀細(xì)菌用4ml預(yù)冷的含15%甘油的50mmol