南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用第九章蛋白純化與蛋白分析2023/1/112南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

蛋白純化與檢測(cè)1

酶活力的測(cè)定2免疫分析3

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析4第一節(jié)蛋白質(zhì)純化研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、組成和某些物理化學(xué)性質(zhì)，需要獲得純化均一的甚至是晶體的的蛋白質(zhì)樣品。如果研究活性蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，還需要蛋白樣品應(yīng)保持它的天然構(gòu)象。2023/1/113南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)分離、純化的過程和一般原則分離純化蛋白質(zhì)，首先要選擇一種含目的蛋白豐富的實(shí)驗(yàn)材料。一般需要經(jīng)過前處理、初分級(jí)、細(xì)分級(jí)和結(jié)晶四步：前處理——細(xì)胞破碎，蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來。粗分級(jí)——當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物的提取液獲得后，選用一套適當(dāng)分離純化方法，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開。細(xì)分級(jí)——是將樣品進(jìn)一步提純的過程。樣品經(jīng)粗分級(jí)以后，一般體積較小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去。結(jié)晶——由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。蛋白質(zhì)純度愈高，溶液愈濃就愈容易結(jié)晶。2023/1/114南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化的一般方法：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法：透析和超濾密度梯度（區(qū)帶）離心凝膠過濾根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行分離的方法：等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析有機(jī)溶劑分級(jí)分離2023/1/115南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法：電泳離子交換層析等電聚焦根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法：親和層析法根據(jù)吸附性不同的方法：吸附層析法第一節(jié)蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化方法的選擇：沒有一種分離純化方法可適用于所有物質(zhì)的分離純化。一種物質(zhì)也不可能只采用一種分離純化方法。所以合理的分離純化方法是根據(jù)目的物的理化性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)，依具體實(shí)驗(yàn)條件而定。1.分離純化初期使用方法的選擇分離純化的初期，由于提取液中的成分復(fù)雜、目的物濃度較稀、與目的物物理化學(xué)性質(zhì)相似的雜質(zhì)多，所以不宜選擇分辨能力較高的純化方法。所以早期分離純化采用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負(fù)荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮作用，為進(jìn)一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大者為合適，但隨著許多新技術(shù)的建立，一個(gè)特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡(jiǎn)化、收率愈高、生化物質(zhì)的變性危險(xiǎn)愈少，因此親和層析法、纖維素離子交換層析法、等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備少量目的物。2023/1/116南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)純化方法的選擇：2.各種分離純化方法的使用程序生物大分子物質(zhì)的分離都是在液相中進(jìn)行，故分離方法主要根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量大小、離子電荷性質(zhì)和數(shù)量及外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎(chǔ)。每一種方法又都在特定條件下發(fā)揮作用，因此，在相同或相似條件下連續(xù)使用同一種分離方法就不太適宜。各種分離方法的交叉使用對(duì)于除去大量理化性質(zhì)相近的雜質(zhì)也較為有效。兩種步驟的先后順序反過來應(yīng)用也會(huì)得到同樣效果。在安排純化方法順序時(shí)，還要考慮到有利于減少步驟、提高效率。3.分離后期的保護(hù)性措施分離操作后期必須注意避免產(chǎn)品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附、操作過程樣品液體的殘留、空氣的氧化和某些事先無法了解的因素。為了取得足夠量的樣品，常需加大原材料的用量，并在后期純化工序中注意保持樣品溶液有較高濃度，以防制備物在稀溶液中的變性。有時(shí)常加入一些電解質(zhì)以保護(hù)生化物質(zhì)活性，減少樣品溶液在器皿中的殘留量。2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院72023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院8第一節(jié)蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：蛋白質(zhì)分離純化過程中，蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定是不可須臾或缺的手段。溶液中蛋白質(zhì)的濃度可根據(jù)它們的物理化學(xué)性質(zhì)來檢測(cè)：采用物理方法如折射率、比重、紫外線吸收；化學(xué)方法如凱氏定氮、雙縮脲反應(yīng)、福林-酚反應(yīng)；染色法如氨基黑、考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定；此外還可用熒光激發(fā)、氯胺T、放射性同位素計(jì)數(shù)等靈敏度較高的方法。上述方法中，紫外吸收法、雙縮脲法、福林-酚試劑法、考馬斯亮藍(lán)染色法等最為常用，它們操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的設(shè)備。2023/1/119南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純度的測(cè)定：常用蛋白純度檢查的方法有;高效液相層析法。電泳法。凝膠電泳呈現(xiàn)單一區(qū)帶，是純度的一個(gè)重要指標(biāo)，說明樣品的荷質(zhì)比(電荷/質(zhì)量)是均一的。如果在不同的PH下進(jìn)行凝膠電泳都是一條區(qū)帶，則結(jié)果更加可靠。SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳法也適用于含有相同亞基的蛋白質(zhì)的純度檢查。免疫化學(xué)法。主要有免疫擴(kuò)散、各種免疫電泳、放射免疫分析、酶標(biāo)免疫分析等。生物測(cè)定法。利用動(dòng)物體或動(dòng)物的離體器官、細(xì)胞進(jìn)行生物效價(jià)的測(cè)定，這種方法接近動(dòng)物臨床所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)因此實(shí)際意義也更大。分光光度法。包括紫外分光光度法和紅外光譜法。2023/1/1110南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)酶活力的測(cè)定酶不易制成純品，其中含有很多雜質(zhì)，真正的含酶量并不多。所以酶制劑中酶的含量都用酶活力來表示。酶活力是通過測(cè)定酶促反應(yīng)過程中單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，即測(cè)定酶促反應(yīng)的速率來獲得的。一般情況下，產(chǎn)物和底物的改變量是一致的，但測(cè)定產(chǎn)物的生成要比測(cè)定底物的減少為好，這是由于反應(yīng)體系中使用的底物往往是過量的，而反應(yīng)時(shí)間通常又很短，尤其是在酶活力很低時(shí)，底物減少量?jī)H占加入量的很小比例，因此測(cè)定不易準(zhǔn)確；反之，產(chǎn)物從無到有（如不純的酶制劑中內(nèi)源性產(chǎn)物不計(jì)的話），只要測(cè)定方法靈敏，準(zhǔn)確度可以很高，故酶活力測(cè)定絕大多數(shù)是采用測(cè)定產(chǎn)物生成速率的方法。2023/1/1111南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院酶活力測(cè)定酶活力時(shí)通常都附有適當(dāng)?shù)膶?duì)照以消除非酶促反應(yīng)所生成的產(chǎn)物，常用對(duì)照有以下幾種，可根據(jù)具體情況予以選擇。樣品對(duì)照。若測(cè)定酶活力的樣品是粗提取液，屬于非常不純的酶制劑，往往含有所欲測(cè)定的產(chǎn)物，也可能在保溫時(shí)由于內(nèi)源性底物的旁反應(yīng)產(chǎn)生相同的產(chǎn)物，這些可通過不加底物單加樣品的樣品對(duì)照予以消除。底物對(duì)照。某些酶的底物能自發(fā)（非酶促）地分解成所欲測(cè)定的產(chǎn)物，可以通過不加樣品單加底物的底物對(duì)照予以消除。時(shí)間對(duì)照。若酶制劑不純（含有產(chǎn)物）和底物自發(fā)分解的情況并存，則必須做一個(gè)酶和底物都加入但反應(yīng)時(shí)間為零的對(duì)照，也即先用蛋白沉淀劑或其它試劑停止反應(yīng)，再加入底物。在雙底物反應(yīng)時(shí)，對(duì)照管可以加入酶制劑和兩種底物中的一種，因缺乏另一種底物，不可能生成產(chǎn)物，至于應(yīng)加入兩種底物中的哪一種可以根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)決定。測(cè)定管中的產(chǎn)物量必須減去對(duì)照管中的產(chǎn)物才是真正由酶促反應(yīng)所生成的產(chǎn)物量。2023/1/1112南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)酶活力的測(cè)定1.酶活力測(cè)定的方法：酶活力測(cè)定要符合兩個(gè)原則：在零級(jí)反應(yīng)期測(cè)定，即-[s]或[p]與反應(yīng)時(shí)間t成正比，反應(yīng)速度與酶量成線性關(guān)系，即

[E]=k(-[s]/t)=k[p]/t常用的方法有：定時(shí)法連續(xù)檢測(cè)法平衡法2023/1/1113南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.酶活力測(cè)定的方法1.1.定時(shí)法:測(cè)定酶反應(yīng)開始后某一時(shí)間內(nèi)（t1到t2）產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來求取酶反應(yīng)初速度的方法稱為定時(shí)法。因t1和t2是整個(gè)反應(yīng)歷程的兩個(gè)點(diǎn)，故又稱兩點(diǎn)法，其中t1一般取反應(yīng)開始的時(shí)間，在酶反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間（t2）后終止反應(yīng)，如加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等，然后測(cè)定底物或產(chǎn)物的變化。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單，因最后測(cè)定產(chǎn)物時(shí)酶反應(yīng)已被終止，故比色池?zé)o需保溫裝置，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活力的影響。缺點(diǎn)是如果不用預(yù)試驗(yàn)確定，無法了解酶作用的這段時(shí)間內(nèi)是否都是零級(jí)反應(yīng)，故很難保證測(cè)定結(jié)果的真實(shí)性。因此，用定時(shí)法測(cè)定酶活力時(shí)，應(yīng)先做預(yù)試驗(yàn)來確定線性時(shí)間，并在線性時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，否則，不能用[p]除以t來表示每分鐘產(chǎn)生的[p]，并用其計(jì)算酶活力單位。2023/1/1114南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.酶活力測(cè)定的方法1.2.連續(xù)監(jiān)測(cè)法:連續(xù)測(cè)定（每15s-1min監(jiān)測(cè)一次）酶反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間的變化來求出酶反應(yīng)初速度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，又稱動(dòng)力學(xué)法或速率法。定時(shí)法只測(cè)定兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，而連續(xù)監(jiān)測(cè)法則進(jìn)行多點(diǎn)連續(xù)測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)是：可將多點(diǎn)測(cè)定結(jié)果（[s]或[p]的變化）連接成線，容易找到成直線的區(qū)段，可以觀察到是否偏離零級(jí)反應(yīng)，因而可選擇線性反應(yīng)期來計(jì)算酶活力，不需要終止反應(yīng)。也可在反應(yīng)曲線的拐點(diǎn)處求出其切線的斜率，即初速度。連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定的結(jié)果通常較定時(shí)法高，也較為準(zhǔn)確，因前者測(cè)定時(shí)間較短，而在酶反應(yīng)的初始階段底物最充裕，而產(chǎn)物的抑制作用、可逆反應(yīng)、酶的變性作用等均很小。缺點(diǎn)是：因酶和底物邊保溫邊測(cè)定的需要，儀器必須有保溫裝置，而且產(chǎn)物應(yīng)是可被直接測(cè)定的化合物，且借以測(cè)定的特殊性質(zhì)，必須與底物有明顯差別，否則，需加入其它試劑，將其轉(zhuǎn)變成可測(cè)物質(zhì)，但必須專慮到加入的酶試劑或顯色劑對(duì)待測(cè)酶是否有影響。2023/1/1115南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.酶活力測(cè)定的方法1.3.平衡法:通過測(cè)定酶反應(yīng)開始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法稱為平衡法，或稱終點(diǎn)法。因定時(shí)法是在酶反應(yīng)的動(dòng)態(tài)期進(jìn)行測(cè)定，故需終止反應(yīng)后才能測(cè)定，而平衡法則無需，因在平衡期中任何一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，底物和產(chǎn)物的量都不再變化。用平衡法測(cè)定時(shí)，因產(chǎn)物的增加或底物的減少與反應(yīng)時(shí)間不成線性，故不能把[p]或[s]的總變化量除以t來代表每分鐘產(chǎn)物或底物的變化。另外，平衡法也會(huì)受到產(chǎn)物抑制、可逆反應(yīng)等因素的影響，由于反應(yīng)時(shí)間較定時(shí)法更長(zhǎng)，故這種影響會(huì)更大，測(cè)定結(jié)果也較連續(xù)監(jiān)測(cè)法低，不能代表初速度，也不是零級(jí)反應(yīng)的速度。但是與定時(shí)法相同，只要待測(cè)標(biāo)本與正常標(biāo)本在相同條件下反應(yīng)并測(cè)定，亦能以此判斷出待測(cè)標(biāo)本酶活力的相對(duì)大小。而且，對(duì)于有些零級(jí)反應(yīng)期很短的酶促反應(yīng)，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法和定時(shí)法很難測(cè)出其初速度，也只得采用平衡法測(cè)定。2023/1/1116南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)酶活力的測(cè)定2.酶活力的表示方法：酶活力的大小是以酶單位數(shù)表示的。所謂酶單位是在某一特定條件下，使酶反應(yīng)達(dá)到某一速度所需要的酶量，而速度即指單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物的變化量。酶單位一般有三種表示方法。慣用單位

:60年代前，各種酶活力的表示法或酶單位的定義沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同酶、甚至同一種酶不同的測(cè)定法可有不同的定義，因此正常范圍也相差很大，容易造成混亂，有時(shí)甚至直接用測(cè)得的物理量，如單位時(shí)間的吸光度變化(△A/△t)來表示酶單位。katal單位:

1972年酶學(xué)委員會(huì)又提出一種新的酶單位katal（簡(jiǎn)稱kat），即在確定的最適反應(yīng)條件下每秒鐘催化一摩爾底物變化所需要的酶量為1kat單位。1kat=60×106IU1nkat=0.06IU1IU=16.67nkat2023/1/1117南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2.酶活力的表示方法：國(guó)際單位:1961年國(guó)際生化學(xué)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)建議使用統(tǒng)一的國(guó)際單位（IU）。規(guī)定一個(gè)國(guó)際單位（IU）為在實(shí)驗(yàn)規(guī)定的條件下（如溫度為25℃、最適pH、最適底物濃度時(shí)），每分鐘催化一個(gè)微摩爾底物變化所需要的酶量。酶的濃度可以IU/L或IU/mL來表示；當(dāng)?shù)孜餅榈鞍踪|(zhì)、多糖等含有多個(gè)能被酶作用的鍵或基團(tuán)時(shí)，可用催化一個(gè)微摩爾被作用的基團(tuán)或鍵的變化來表示酶單位。如采用物理方法測(cè)定，應(yīng)該在物理量與化學(xué)量之間建立對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行換算。國(guó)際單位的應(yīng)用有利于比較同一樣品中不同酶活力。但也有缺點(diǎn)：從慣用單位換算成國(guó)際單位比較麻煩；某些酶作用于Mr不明的大分子底物（如淀粉酶、胃蛋白酶等），采用底物減少法來定量時(shí)，無法計(jì)算其底物減少的微摩爾數(shù)；同一種酶用不同的方法測(cè)定，換算成國(guó)際單位時(shí)，其結(jié)果仍不相同。各國(guó)常采用不同的測(cè)定溫度，如25℃、30℃、37℃等，這也導(dǎo)致即使用國(guó)際單位表示酶活力，其正常參考范圍也是不同的。2023/1/1118南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)酶活力的測(cè)定3.Km和Vmax的測(cè)定：對(duì)于符合米氏方程的酶類，通過測(cè)定底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響，可以測(cè)定米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。測(cè)定時(shí)，首先確定反應(yīng)的條件，包括溫度、pH值、酶濃度等。然后取不同濃度的底物與酶反應(yīng)，分別測(cè)定不同底物濃度下的酶反應(yīng)速度。然后用雙倒數(shù)作圖法和單倒數(shù)作圖法等求Km和Vmax。2023/1/1119南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)酶活力的測(cè)定3.Km和Vmax的測(cè)定：3.1.雙倒數(shù)作用法（LineweaverBurk法）:米氏公式v=Vmax[S]/(Km+[S])改寫成

1/v=（Km/Vmax[S]）+1/Vmax以1/v對(duì)1/[S]作圖，得到直線，其縱截距為1/Vmax，橫軸截距為1/-Km，斜率為Km/Vmax。2023/1/1120南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.Km和Vmax的測(cè)定：3.2.單倒數(shù)作圖法:將米氏公式改寫成[S]/v=[S]/Vmax+Km/Vmax以[S]/v對(duì)[S]作圖。橫軸截距為-Km，縱軸截距為Km/Vmax，斜率為1/Vmax。2023/1/1121南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.Km和Vmax的測(cè)定：3.2.伊蒂—霍夫斯第法(EadieHofstee法)：將米氏公式改寫成下式v=Vmax–Km（v/[S]）以v對(duì)v/[S]作圖，得一直線。斜率為Km，縱軸截距Vmax，橫軸截距Vmax/Km，兩者相除，即為Km。2023/1/1122南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)酶活力的測(cè)定4.其它動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的測(cè)定：最適溫度測(cè)定：任何酶反應(yīng)都有一個(gè)最適溫度范圍。在測(cè)定時(shí)，只要把其他的反應(yīng)條件固定，只改變反應(yīng)溫度，通過測(cè)定不同溫度下的反應(yīng)速度，以溫度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)酶反應(yīng)速度（最高反應(yīng)速度為100%，其余溫度下的反應(yīng)速度除以最高反應(yīng)速度得出相對(duì)酶反應(yīng)速度）為縱坐標(biāo)繪圖，就可得出反應(yīng)最適溫度。熱穩(wěn)定測(cè)定：熱穩(wěn)定性試驗(yàn)的測(cè)定有二種方法：在底物濃度、酶濃度、pH等條件不變的條件下，在不同的溫度下(一般選在40℃以上的溫度)，測(cè)定相同時(shí)間內(nèi)的酶反應(yīng)速度，計(jì)算出不同溫度下的相對(duì)酶反應(yīng)速度。在底物濃度、酶濃度、pH值等條件不變的情況下，測(cè)定在某一較高溫度下不同時(shí)間的酶反應(yīng)速度，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，繪出曲線。2023/1/1123南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)酶活力的測(cè)定4.其它動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的測(cè)定：最適溫度測(cè)定：任何酶反應(yīng)都有一個(gè)最適溫度范圍。在測(cè)定時(shí)，只要把其他的反應(yīng)條件固定，只改變反應(yīng)溫度，通過測(cè)定不同溫度下的反應(yīng)速度，以溫度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)酶反應(yīng)速度（最高反應(yīng)速度為100%，其余溫度下的反應(yīng)速度除以最高反應(yīng)速度得出相對(duì)酶反應(yīng)速度）為縱坐標(biāo)繪圖，就可得出反應(yīng)最適溫度。熱穩(wěn)定測(cè)定：熱穩(wěn)定性試驗(yàn)的測(cè)定有二種方法：在底物濃度、酶濃度、pH等條件不變的條件下，在不同的溫度下(一般選在40℃以上的溫度)，測(cè)定相同時(shí)間內(nèi)的酶反應(yīng)速度，計(jì)算出不同溫度下的相對(duì)酶反應(yīng)速度。在底物濃度、酶濃度、pH值等條件不變的情況下，測(cè)定在某一較高溫度下不同時(shí)間的酶反應(yīng)速度，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，繪出曲線。2023/1/1124南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4.其它動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的測(cè)定：最適pH值的測(cè)定：酶促反應(yīng)均有其最適pH值。通過測(cè)定不同pH條件下酶的反應(yīng)速度，就可以找出其最適pH值。測(cè)定時(shí)，其他條件保持一定，使用不同pH值的緩沖液測(cè)定酶的反應(yīng)速度。然后以pH值為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，繪出曲線，求出最適pH。酶的激活與抑制為了測(cè)定激活劑和抑制劑對(duì)酶活性的影響，可在一定的條件下于反應(yīng)液中添加不同量的激活劑或抑制劑，然后分別測(cè)定酶反應(yīng)速度。以激活劑或抑制劑的濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)，可繪出酶的激活曲線或抑制曲線。抑制作用有競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制等幾種。為了辯別抑制的類型，可以按測(cè)定底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度影響的方法將反應(yīng)分成幾組（三組以上），每組的各試管中加入不同濃度的抑制劑，而各組的其他條件均互相對(duì)應(yīng)，分別測(cè)定酶反應(yīng)速度。然后以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)、1/v為縱坐標(biāo)，把各組的變化曲線畫在同一圖中，即可從圖中辯別出抑制類型。2023/1/1125南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應(yīng)而建立起來的一種生物化學(xué)分析法，該法具有很高的選擇性和很低的檢出限，可以應(yīng)用于測(cè)定各種抗原、半抗原或抗體。免疫分析法可分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、酶免疫法及電化學(xué)免疫法等非放射免疫法和放射免疫法。放射免疫法的靈敏度最高，達(dá)10-12-10-15摩/升，是在待測(cè)分析物中加入理化性質(zhì)、免疫學(xué)特性與分析物相同的放射性同位素標(biāo)記的分析物。將該分析物與特異性抗體結(jié)合，用測(cè)量放射性的方法，測(cè)量并計(jì)算結(jié)合部分與游離部分的比值，從而確定分析物的量。非放射免疫法是使用熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光組分以及酶作為疫標(biāo)記。免疫分析法普遍應(yīng)用于生物化學(xué)研究和臨床病理檢驗(yàn)。2023/1/1126南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析1.抗體抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。由于不同的抗原與抗體特異結(jié)合表現(xiàn)出各種不同的反應(yīng)，因而抗體有不同的名稱，如抗毒素、凝集素、沉淀素、溶血等、溶菌素等。并具有作用于相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞、組織、毒素、酶等一系列的生物學(xué)活性。2023/1/1127南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.抗體單克隆抗體當(dāng)抗原進(jìn)入體內(nèi)，在機(jī)體中就會(huì)誘導(dǎo)出針對(duì)不同抗原決定簇的多種抗體，如果要把這些抗體一一分開，用現(xiàn)有的生物化學(xué)或物理化學(xué)方法是根本辦不到的。1975年科勒和米爾斯坦將小鼠免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)出既能迅速生長(zhǎng)繁殖又可分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。從而獲得針對(duì)某一特殊抗原決定簇的單克隆抗體。2023/1/1128南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.抗體抗體的特性：結(jié)合特異性抗原：抗體與其他免疫球蛋白分子區(qū)別，就在于抗體能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在體內(nèi)導(dǎo)致生理或病理效應(yīng)；在體外產(chǎn)生各種直接或間接的可見的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)?？贵w是靠其分子上的特殊的結(jié)合部位與抗原結(jié)合的。結(jié)合細(xì)胞：不同類別的免疫球蛋白，可結(jié)合不同種的細(xì)胞，產(chǎn)生不同的疚，參與免疫應(yīng)答。2023/1/1129南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院具有抗原性：抗體分子是一種蛋白質(zhì)，也具有刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。1.抗體抗體的特性：結(jié)合特異性抗原：抗體與其他免疫球蛋白分子區(qū)別，就在于抗體能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在體內(nèi)導(dǎo)致生理或病理效應(yīng)；在體外產(chǎn)生各種直接或間接的可見的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)?？贵w是靠其分子上的特殊的結(jié)合部位與抗原結(jié)合的。結(jié)合細(xì)胞：不同類別的免疫球蛋白，可結(jié)合不同種的細(xì)胞，產(chǎn)生不同的疚，參與免疫應(yīng)答。2023/1/1130南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院具有抗原性：抗體分子是一種蛋白質(zhì)，也具有刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。2023/1/1131南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.抗體抗體的制備第三節(jié)免疫分析2.放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)包括：放射免疫分析（RIA），免疫放射分析（IRMA）。廣義放射免疫技術(shù)還包括放射受體分析（使用受體測(cè)量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點(diǎn)：靈敏度高（10-9-10-15g/L）、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等。放射免疫分析（RIA）2023/1/1132南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院原理是：采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。第三節(jié)免疫分析2.放射免疫技術(shù)放射免疫分析（RIA）測(cè)定方法與步驟抗原抗體反應(yīng)：平衡法

或非平衡法分離結(jié)合與游離標(biāo)記物沉淀劑沉淀復(fù)合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡；操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)。放射性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計(jì)數(shù)儀（γ射線）或液體閃爍計(jì)數(shù)儀（β射線）；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢抗原濃度。2023/1/1133南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2.放射免疫技術(shù)免疫放射分析（IRMA）基本原理單位點(diǎn)IRMA：利用過量標(biāo)記

抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離，測(cè)定上清液的放射量。雙位點(diǎn)IRMA：先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合，然后再用過量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相抗原的另一抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗

體，測(cè)定固相上的放射性。2023/1/1134南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析2.放射免疫技術(shù)兩種放射免疫技術(shù)的異同點(diǎn)：標(biāo)記物。在RIA中核素標(biāo)記抗原，抗原有不同種類，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)記時(shí)需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中核素標(biāo)記抗體，不同抗體標(biāo)記方法基本相同，且標(biāo)記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。反應(yīng)速率。反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度呈正比，在IRMA中標(biāo)記抗體是過量的，所以反應(yīng)速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在IRMA中應(yīng)用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結(jié)果。反應(yīng)原理。RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，劑量反應(yīng)曲線為正相關(guān)的直線關(guān)系。特異性。在雙位點(diǎn)IRMA中，一般均應(yīng)用針對(duì)不同位點(diǎn)的單克隆抗體，其交叉反應(yīng)率低于應(yīng)用多克隆抗體的RIA。檢測(cè)范圍。通常RIA的工作范圍為2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，而RIMA可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。2023/1/1135南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)是是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測(cè)的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種方法。其基本原理為：利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析（第十章將專題講述）。可用于檢測(cè)細(xì)胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細(xì)胞亞群等的檢測(cè)。2023/1/1136南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析4.酶免疫技術(shù)基本原理：利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)?；咎攸c(diǎn)：標(biāo)記后保留酶和抗原（抗體）的活性酶促反應(yīng)專一性，保證特異性底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便，安全易行2023/1/1137南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析4.酶免疫技術(shù)分類：酶免疫組化。用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原和抗體。酶免疫測(cè)定：均相酶免疫測(cè)定。利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中的抗原量。（

Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E）異相酶免疫測(cè)定?；驹恚涸诳乖贵w反應(yīng)后，先將抗原抗體復(fù)合物與游離的酶標(biāo)抗體分離，再測(cè)定酶標(biāo)記的復(fù)合物催化底物顯色的活性，最后推算出樣品中抗原的含量。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E液相酶免疫測(cè)定。分離劑分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記物。分為固相酶免疫測(cè)定。固相載體結(jié)合酶標(biāo)復(fù)合物，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)抗體。如ELISA。2023/1/1138南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4.酶免疫技術(shù)4.1.主要試劑的制備與要求酶與酶作用底物用于標(biāo)記酶的要求：酶活性高；標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性；酶催化底物后信號(hào)易判定或測(cè)定；酶活性不受樣品中其他成分的影響；酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無害，價(jià)廉。常用酶及其底物：辣根過氧化物酶（HRP）；堿性磷酸酶（AP）。2023/1/1139南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析4.1.主要試劑的制備與要求酶標(biāo)記抗體或抗原基本要求：酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體特異性好，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化。固相載體基本要求：結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡(jiǎn)便易行、快捷經(jīng)濟(jì)。固相載體的種類與選擇塑料制品。材料經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，最常用。微顆粒。結(jié)合容量大，反應(yīng)迅速，普遍用于自動(dòng)化分析。膜載體。硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應(yīng)用于定性或半定量的斑點(diǎn)ELISA。2023/1/1140南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4.酶免疫技術(shù)4.2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（

ELISA

）基本原理與方法：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。2023/1/1141南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析4.2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（

ELISA

）雙抗體夾心法特點(diǎn)為：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)；常用于抗原的檢測(cè)；適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)；所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇。2023/1/1142南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院434.1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（

ELISA

）間接法2023/1/1144南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4.1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（

ELISA

）競(jìng)爭(zhēng)法特點(diǎn)：用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測(cè)定的酶標(biāo)Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（Ab）的濃度成反比。2023/1/1145南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4.2.免疫印跡（WesternBlot）免疫印跡法是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測(cè)、多肽分子的質(zhì)量測(cè)定及病毒的抗體或抗原檢測(cè)等。免疫印跡法亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法，因與Southern早先建立的檢測(cè)核酸的印跡方法Southern-blot相類似，亦被稱為Western-blot。2023/1/1146南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析4.2.免疫印跡（WesternBlot）免疫印跡法分三個(gè)階段進(jìn)行：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流，通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDA加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。2023/1/1147南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院482023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院495.免疫擴(kuò)散免疫擴(kuò)散指抗原抗體在瓊脂凝膠中擴(kuò)散，當(dāng)兩者在比例適當(dāng)處相遇，發(fā)生的沉淀反應(yīng)，反應(yīng)的沉淀物因其顆粒較大，在凝膠中不再擴(kuò)散，形成沉淀帶的過程。免疫擴(kuò)散可分單擴(kuò)散和雙擴(kuò)散。單向免疫擴(kuò)散是抗原抗體中一種成分?jǐn)U散，而另一種成分不擴(kuò)散；雙向免疫擴(kuò)散是二種成分在凝膠內(nèi)彼此都擴(kuò)散。根據(jù)擴(kuò)散的方向不同又分。2023/1/1150南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析5.免疫擴(kuò)散單向免疫擴(kuò)散：在含有特異抗體的瓊脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，當(dāng)抗原向周圍擴(kuò)散后與瓊脂中抗體相結(jié)合，即形成白色沉淀環(huán)，其直徑或面積與抗原濃度呈正相關(guān)。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)抗原或國(guó)際參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可用以定量檢測(cè)未知標(biāo)本的抗原濃度(mg/ml或U/ml)。雙向免疫擴(kuò)散：是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴(kuò)散，彼此相遇后形成一定類型的特異性沉淀線。沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原抗體的特異性及相互間比例，而且與其分子大小及擴(kuò)散速度相關(guān)。當(dāng)抗原、抗體存在多個(gè)系統(tǒng)時(shí)，可呈現(xiàn)多條沉淀線乃至交叉反應(yīng)。依據(jù)沉淀線的形態(tài)、條數(shù)、清晰度及位置可了解抗原或抗體的若干性質(zhì)，如濃度、特異性等。2023/1/1151南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院526.免疫電泳免疫電泳法是將凝膠電泳與雙向免疫擴(kuò)散兩種技術(shù)相結(jié)合的一種實(shí)驗(yàn)方法。項(xiàng)技術(shù)由于具有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，電泳分離技術(shù)的快速，靈敏和高分辨力，以及實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，至今仍作為免疫學(xué)的一種基本技術(shù)，廣泛用于科學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷。該方法可以用來研究：抗原和抗體的相對(duì)應(yīng)性；測(cè)定樣品的各成分以及它們的電泳遷移率；根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率，免疫特性及其它特性，可以確定該復(fù)合物中含有某種蛋白質(zhì)；鑒定抗原或抗體的純度。2023/1/1153南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析6.免疫電泳法免疫電泳法是將凝膠電泳與雙向免疫擴(kuò)散兩種技術(shù)相結(jié)合的一種實(shí)驗(yàn)方法。在電場(chǎng)作用下標(biāo)本中各組分因電泳遷移率不同而分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向?qū)⒛z挖一溝槽，將抗體加入溝槽內(nèi)，使抗原與抗體相互擴(kuò)散而形成沉淀線。在經(jīng)典的免疫電泳技術(shù)基礎(chǔ)上，還衍生出對(duì)流免疫電泳、火箭電泳等新技術(shù)。該方法可以用來研究：抗原和抗體的相對(duì)應(yīng)性；測(cè)定樣品的各成分以及它們的電泳遷移率；根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率，免疫特性及其它特性，可以確定該復(fù)合物中含有某種蛋白質(zhì)；鑒定抗原或抗體的純度。2023/1/1154南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)免疫分析6.免疫電泳法免疫電泳免疫電泳是將區(qū)帶電泳與雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化學(xué)分析技術(shù)。先將蛋白質(zhì)抗原在瓊脂平板上進(jìn)行電泳，使不同的抗原成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，電泳遷移率各異而彼此分離。2023/1/1155南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院然后在與電泳方向平行的瓊脂槽內(nèi)加入相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫分散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應(yīng)抗體在瓊脂中擴(kuò)散后相遇，在二者比例合適處形成肉眼可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，與已知的標(biāo)準(zhǔn)（或正常）抗原抗體形成的沉淀線比較，即可對(duì)樣品中所含成分及其性質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定。6.免疫電泳法對(duì)流免疫電泳：對(duì)流免疫電泳是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。在pH8.6的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)；而抗體大部分屬于Ig，由于分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng)。在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。由于電場(chǎng)的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)散，而使其定向泳動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短反應(yīng)時(shí)間。此法操作簡(jiǎn)便，僅需30～60分鐘，靈敏度比雙

向擴(kuò)散高10～15倍；但缺點(diǎn)

是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)散

高。2023/1/1156南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院6.免疫電泳法火箭免疫電泳火箭免疫電泳是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測(cè)技術(shù)。電泳時(shí)，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)，而在電場(chǎng)的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動(dòng)。當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)。2023/1/1157南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院因此，當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時(shí)，以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長(zhǎng)度即可計(jì)算出待測(cè)抗原的含量；反之，當(dāng)瓊脂中抗原濃度固定時(shí)，便可測(cè)定待測(cè)抗體的含量（即反向火箭免疫電泳）。蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)2023/1/1158南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第四節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析1.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的方法有：Edman降解法，質(zhì)譜法，由DNA序列推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列。Edman降解法蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)最具有意義的發(fā)展是瑞典化學(xué)家Edman發(fā)展的以他名字命名的蛋白質(zhì)N-端測(cè)序方法——Edman降解法。Edman降解進(jìn)行多肽序列分析是一個(gè)循環(huán)式的化學(xué)反應(yīng)過程。用此原理已制成蛋白質(zhì)序列分析儀。若每次循環(huán)的準(zhǔn)確度為99%，經(jīng)60次循環(huán)，準(zhǔn)確度為：0.9960=0.542023/1/1159南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第四節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析1.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定Edman降解法循環(huán)過程包括三個(gè)主要的化學(xué)步驟：偶聯(lián)。試劑為異硫氰酸苯酯即Edman試劑。斷裂。多肽鏈的自由α-氨基與耦聯(lián)試劑PITC（異硫氰酸苯酯）反應(yīng)后，與緊鄰的第二個(gè)殘基的結(jié)合力大大減弱，易于斷裂。無水強(qiáng)酸如TFA（三氟乙酸）使第一個(gè)殘基環(huán)化，從而使該殘基從肽鏈中釋放出來，生成ATZ氨基酸（2-苯胺基-噻唑啉酮衍生物）。緊挨著的第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的α-氨基，又可與PITC發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，如此進(jìn)行降解循環(huán)。轉(zhuǎn)化。ATZ氨基酸在三氟乙酸水溶液（25%）中可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的PTH-氨基酸（乙內(nèi)酰苯硫脲衍生物）。2023/1/1160南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院611.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定Edman降解法循環(huán)之后對(duì)PTH-氨基酸由高效液相層析進(jìn)行鑒定。2023/1/1162南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院631.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定質(zhì)譜法MALDI-MS（基質(zhì)輔助的激光解析離子化質(zhì)譜）可通過分析待測(cè)離子在飛行管中的飛行時(shí)間來測(cè)定其質(zhì)量。分子量超過300ka的分子現(xiàn)已可以用MALDI-MS成功測(cè)定。實(shí)際可能測(cè)量的分子量范圍幾乎是無限的。2023/1/1164南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第四節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院65蛋白質(zhì)固體樣本無介質(zhì)輔助（A）與有介質(zhì)輔助（B）的鐳射脫附過程示意圖：質(zhì)譜法Ladder測(cè)序法，即MALDI質(zhì)譜與Edman化學(xué)降解相結(jié)合。在Edman化學(xué)降解中用5%異氰酸苯酯作為末端反應(yīng)劑與整條肽鏈形成苯氨甲酰衍生物，而95%仍像往常一樣在用三氟乙酸解離后與異硫氰酸苯酯反應(yīng)以形成縮短了一個(gè)氨基酸的肽鏈，在剩下的降解多肽上連續(xù)運(yùn)用Edman降解循環(huán)，最終苯氨甲?；嚯牡幕旌衔锿ㄟ^MA。另一種將質(zhì)譜分析（尤其是MALDI-MS）與Edman化學(xué)降解偶聯(lián)起來測(cè)定未知蛋白序列的方法是，以1pmol蛋白為起始量，其在酶解或化學(xué)裂解下的時(shí)間歷程用MS來進(jìn)行監(jiān)測(cè)。消化后用HPLC將肽分離，再用MS和氨基酸分析進(jìn)行測(cè)定，接下來再使用Edman降解。肽分子量的測(cè)定結(jié)果可用于估計(jì)所需進(jìn)行的循環(huán)次數(shù)并確認(rèn)測(cè)序結(jié)果，修飾過的氨基酸也可測(cè)定出來，進(jìn)而把肽的分子量相加再與完整蛋白的分子量相比較，可把對(duì)應(yīng)于完整序列的肽挑選出來進(jìn)行測(cè)序。到此，大部分序列均被測(cè)定LDI-MS一步完成。2023/1/1166南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定由DNA序列推導(dǎo)法蛋白質(zhì)測(cè)序可根據(jù)核苷酸序列推定法：分離mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄測(cè)定cDNA的核苷酸序列,再用遺傳密碼推定氨基酸序列。因?yàn)镈NA測(cè)序比蛋白質(zhì)直接測(cè)序方便的多，所以根據(jù)核苷酸序列推定非常容易。缺點(diǎn)：對(duì)于測(cè)定轉(zhuǎn)譯后加工所導(dǎo)致的氨基酸殘基的修飾無法檢測(cè)。2023/1/1167南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第四節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析2023/1/11南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院68比較內(nèi)容蛋白質(zhì)序列DNA序列測(cè)序中判斷的復(fù)雜性20種氨基酸，且可能出現(xiàn)特殊的氨基酸4種核苷酸樣品的性質(zhì)不同蛋白質(zhì)和肽片斷理化性質(zhì)相差很大，存在不溶性和變性的問題不同DNA片斷的理化性質(zhì)相差小，基本不存在不溶性和變性的問題對(duì)樣品量的依賴性常為限制因素只要建立了克隆，樣品量不成問題測(cè)序速度手工操作者一天完成約4-5個(gè)殘基的順序，自動(dòng)測(cè)序儀一天可完成約30個(gè)殘基的順序手工操作者一天可完成數(shù)百個(gè)堿基的順序，自動(dòng)測(cè)序儀一天可完成數(shù)千個(gè)堿基的順序測(cè)定準(zhǔn)確性可能出現(xiàn)拼接和辨讀錯(cuò)誤準(zhǔn)確性高費(fèi)用高，對(duì)昂貴儀器依賴性高較低2.二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定圓二色光譜法（CD）原理：當(dāng)一束平面