生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課件：實(shí)驗(yàn)八 底物濃度對酶活性的影響

酶的動力學(xué)性質(zhì)分析，是酶學(xué)研究的重要方面。測定Km

和Vmax，特別是測定Km，是酶學(xué)研究的基本內(nèi)容之一，Km是酶的一個基本的特性常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)，特別是同一種酶能夠作用于幾種不同的底物時，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力強(qiáng)弱，Km值越大，說明酶與底物的親和力越弱，反之，Km值越小，酶與底物的親和力越強(qiáng)。

2.底物濃度對酶活性的影響實(shí)驗(yàn)原理Michaelis-MentenKinetics實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理Lineweaver-BurkKinetics實(shí)驗(yàn)原理（雙倒數(shù)作圖法）蔗糖酶的準(zhǔn)備酶粉溶于10ml—20ml蒸餾水，離心10,000rpm離心10分鐘后去掉不溶物。酶活力預(yù)試12（對照）10%蔗糖溶液ml0.600.60H2O1.11.1pH5.0醋酸緩沖液ml0.20.225℃水浴中保溫3min二硝基水楊酸試劑0.5ml稀釋后的蔗糖酶溶液ml0.100.1025℃水浴5min二硝基水楊酸試劑0.5ml0.1mol/LNaOH溶液ml2.52.5沸水浴煮5min取出后經(jīng)自來水冷卻3min，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管調(diào)零點(diǎn)，于520nm處測光密度值。測得的A520nm值在1.0-1.8之間。底物濃度與酶促反應(yīng)速度管號試劑

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710%蔗糖溶液ml0.040.060.080.100.200.400.60H2O1.661.641.621.601.501.301.10

pH5.0醋酸緩沖液，ml0.20.20.20.20.20.20.225℃預(yù)熱3分鐘加入0.1ml稀釋后的酶液25℃準(zhǔn)確反應(yīng)5min，迅速加入0.5ml二硝基水楊酸溶液，加0.1mol/L的NaOH溶液2.5ml混勻，沸水浴5min，自來水冷卻3min，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的”0”管調(diào)0，520nm測OD值。結(jié)果處理管號結(jié)果1234567OD520葡萄糖產(chǎn)量，mgv=[葡萄糖產(chǎn)量?10]1ml酶在單位時間內(nèi)的產(chǎn)量(mg)[S]=10%?V?1000/2?342(mmol/L)1/[S]1/vv代表生成產(chǎn)物葡萄糖的速率（5min單位時間內(nèi)內(nèi)1ml酶液反應(yīng)生成的葡萄糖的量）；[S]=10%?V?1000/2?342：[S]代表底物蔗糖的摩爾濃度；V代表每只試管中加入的底物蔗糖的體積；2指的是反應(yīng)的總體積是2ml；342是蔗糖的分子量；10%指的是100ml的溶液中蔗糖的量是1