第一章-植物工廠化育苗的工廠與設(shè)備

植物工廠化育苗的工廠與設(shè)備2第一節(jié)實驗室一、實驗室植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。

實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。準備室培養(yǎng)室溫室Text實驗室接種室接種室實驗室組成：4基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室準備實驗室5緩沖室6無菌室7無菌室899無菌室10101111培養(yǎng)架架1212培養(yǎng)室室13溫室1414第二節(jié)節(jié)儀儀器與與設(shè)備備15冰箱酸度計計電爐1.基本設(shè)設(shè)備17天平純水器器18攪拌器器19蒸汽壓壓力滅滅菌鍋鍋2.滅菌設(shè)設(shè)備20212222過濾滅滅菌裝裝置2323紫外滅滅菌燈燈管3、無菌菌操作作設(shè)備備超凈工工作臺臺242525超凈工工作臺臺無菌接接種箱箱26恒溫振振蕩培培養(yǎng)箱箱光照培培養(yǎng)箱箱4、培養(yǎng)養(yǎng)設(shè)備備27搖床床285、細胞胞學(xué)鑒鑒定設(shè)設(shè)備光學(xué)研研究顯顯微鏡鏡、實實體顯顯微鏡鏡、倒倒置顯顯微鏡鏡29倒置顯顯微鏡鏡光學(xué)顯顯微鏡鏡301、玻璃璃器皿皿三、培培養(yǎng)器器皿及及實驗驗用具具培養(yǎng)皿皿三角瓶瓶培養(yǎng)瓶瓶2、金屬屬材質(zhì)質(zhì)用具具鑷子解剖刀刀接種針針32接種盤盤3333第二節(jié)節(jié)培培養(yǎng)養(yǎng)基培養(yǎng)基基是決決定植植物組組織培培養(yǎng)成成敗的的關(guān)鍵鍵因素素之一一。培養(yǎng)基基的構(gòu)構(gòu)成要要素通通?？煽煞譃闉椋孩偎址?；②②無機機鹽類類；③③有機機營養(yǎng)養(yǎng)成分分；④④植物物生長長調(diào)節(jié)節(jié)物質(zhì)質(zhì)；⑤⑤天熱熱物質(zhì)質(zhì)；⑥⑥pH；⑦凝凝固劑劑等。3434構(gòu)成培培養(yǎng)基基的絕絕大部部分組組分為為水分分。在研究究上，常用用蒸餾餾水來來配制制培養(yǎng)養(yǎng)基，，而最最為理理想的的水應(yīng)應(yīng)該是是純水水。（一））水分分※大量營營養(yǎng)元元素：占干干物質(zhì)質(zhì)重量量的0.1%以上；；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種※微量營營養(yǎng)元元素：占干干物質(zhì)質(zhì)重量量的0.1%以下有的只只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國國際植植物生生理協(xié)協(xié)會的的建議議：所需濃濃度>0.5mmol/L的元素素為大大量元元素所需濃濃度<0.5mmol/L的元素素為微微量元元素35（二））礦質(zhì)質(zhì)元素素1.大量元元素N是蛋白白質(zhì)、、酶、、葉綠綠素、、維生生素、、核酸酸、磷磷脂、、生物物堿等等的組組成成成分，，在植植物生生命活活動中中占有有重要要的位位置。。P是磷脂脂的主主要成成分。。培養(yǎng)養(yǎng)基中中常用用KH2PO4NaH2PO4等。K對碳水水化合合物合合成，，轉(zhuǎn)移移，以以及氮氮素代代謝等等有密密切關(guān)關(guān)系。。36Mg、S、Ca是葉綠綠素的的組成成成分分，又又是激激酶的的活化化劑，，對核核蛋白白體結(jié)結(jié)構(gòu)具具有穩(wěn)穩(wěn)定作作用；；S是含S氨基酸酸的蛋蛋白質(zhì)質(zhì)的組組成成成分。。Ca是構(gòu)成成細胞胞壁的的成分分，對對細胞胞分裂裂，穩(wěn)穩(wěn)定質(zhì)質(zhì)膜結(jié)結(jié)構(gòu)有有顯著著作用用，此此外，，Ca及鈣調(diào)調(diào)素在在細胞胞信號號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)中起起重要要作用用。2、微量量元素素在微量量元素素中，，鐵的使用用最大大：：◆一些氧氧化酶酶的組組成成成分◆葉綠素素形成成的必必要條條件◆使用乙乙二胺胺四乙乙酸鐵鐵（EDTA-Fe）鰲合合物防防止鐵鐵的沉沉淀38硼與蛋白白質(zhì)合合成、、糖類類運輸輸有著著密切切的關(guān)關(guān)系銅是某些些氧化化酶的的成分分，能能夠促促進離離體根根的生生長錳參與植植物的的光合合、呼呼吸代代謝鉬參與氮氮素的的代謝謝氯是光合合作用用水光光解的的活化化劑微量元元素的的主要要作用用是作作為酶的輔輔助因因子或或激活活劑參與代代謝的的調(diào)節(jié)節(jié)。39（三））有機機營養(yǎng)養(yǎng)成分分培養(yǎng)基基中的的有機機營養(yǎng)養(yǎng)成分分包括括糖類物物質(zhì)、、維維生素素類和和氨氨基酸酸類。。1.碳源源碳源源物物質(zhì)質(zhì)包包括括糖糖類類物物質(zhì)質(zhì)、、醇醇類類物物質(zhì)質(zhì)和和有有機機酸酸，，以以糖類類物質(zhì)質(zhì)最最重重要要。。糖類類物物質(zhì)質(zhì)特特點點：：◆具有有熱熱易易變變的的性性質(zhì)質(zhì)◆利于于吸吸收收和和利利用用◆使用用濃濃度度一一般般在在2%—5%◆提供供能能源源和和調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)滲滲透透壓壓412.維生生素素類類◆以各各種種輔酶酶的形形式式存存在在◆參與與多多種種代代謝謝活活動動◆對生生長長，，分分化化等等有有很很好好的的促促進進作作用用◆主要要分分為為脂溶溶性性維維生生素素和水溶溶性性維維生生素素◆常用用維維生生素素有有VB1和VB642◆蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的組組成成成成分分◆有有機機氮氮源源◆可可直直接接被被細細胞胞吸吸收收利利用用◆培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中常常用用的的是是甘氨氨酸酸3.氨基基酸酸434.肌醇醇◆環(huán)己己六六醇醇◆細胞胞壁壁的的構(gòu)構(gòu)建建材材料料◆參與與碳碳水水化化合合物物、、磷磷脂脂代代謝謝及及離離子子平平衡衡等等生生理理活活動動◆促進活性性物質(zhì)發(fā)發(fā)揮作用用44（四）植植物生長長調(diào)節(jié)劑劑植物生長長調(diào)節(jié)劑劑不僅可可以促進植物物組織的的脫分化化和形成成愈傷組組織，還還可以誘誘導(dǎo)不定定芽、不不定胚的的形成。。最常用的的有生長素和和細胞分分裂素，有時也也會用到到赤霉素和和脫落酸酸。1.生長素類類◆促進細胞胞伸長和和分裂◆促進生根根、抑制制器官脫脫落、性性別控制制、延長長休眠、、頂端優(yōu)優(yōu)勢、單單性結(jié)實實◆誘導(dǎo)愈傷傷組織形形成◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者者的溶解解效果更更好◆常用的生生長素：：IAA(吲哆乙酸酸)NAA(萘乙酸)2,4-D(2,4，二氯苯苯氧乙酸酸)IBA(吲哆丁酸酸)462.細胞分裂裂素類◆促進細胞胞分裂和和分化◆誘導(dǎo)胚狀狀體和不不定芽的的形成◆延緩組織織的衰老老并增強強蛋白質(zhì)質(zhì)的合成成◆用于離體體成花的的調(diào)控◆溶于0.5-1.0mol/L的鹽酸或或稀薄的的NaOH中◆常用的細細胞分裂裂素：KT(激動素)BA(6-卞基腺嘌嘌呤)2-ip(異戊烯氨氨基嘌呤呤)ZT（玉米素素）473.赤霉素類類和脫落落酸A、赤霉素素類◆組織培培養(yǎng)中不不常使用用◆加速細細胞的伸伸長生長長◆促進細細胞的分分裂◆主要是是GA3B、脫落酸酸◆抑制細細胞分裂裂和伸長長◆促進脫脫落和衰衰老◆促進休休眠和提提高抗逆逆能力GA3脫落酸48◆促進某某些愈傷傷組織和和器官的的生長◆化學(xué)成成分不明明、復(fù)雜雜◆天然營營養(yǎng)混合合物如：水解解酪蛋白白、玉米米胚乳、、酵母提提取物（五）天天然復(fù)合合物4950（六）pH在滅菌前前，培養(yǎng)養(yǎng)基的pH一般被調(diào)調(diào)節(jié)到5.0~6.0之間，最最常用的的pH為5.7~5.8。pH過高時，，培養(yǎng)基基會變硬硬；pH過低時，，則影響響培養(yǎng)基基的凝固固。50（七）凝凝固劑◆瓊脂是是使用最最普遍的的凝固劑劑◆用量一一般在6-10g/L之間◆顏色以以淺、透透明度高高好，潔潔凈為上上品除了瓊脂脂外，在在組織培培養(yǎng)中還還可以使使用瓊脂脂糖、結(jié)結(jié)冷膠等等。51（八）其其他添加加物521.活性炭◆吸附培養(yǎng)養(yǎng)基及培培養(yǎng)物分分泌物中中的抑制制物質(zhì)◆抑制外植植體褐變變◆防止玻璃璃苗的產(chǎn)產(chǎn)生◆促進培養(yǎng)養(yǎng)物生長長和分化化◆促進生根根2.抗生素◆防止外植植體內(nèi)生生菌造成成的污染染活性炭5353二、培養(yǎng)養(yǎng)基的基基本類型型◆培養(yǎng)基形形態(tài)不同同：固體培養(yǎng)養(yǎng)基、液液體培養(yǎng)養(yǎng)基◆培養(yǎng)過程程不同：：初代培養(yǎng)養(yǎng)基、繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)基◆其作用不不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)養(yǎng)基、增增殖培養(yǎng)養(yǎng)基、生生根培養(yǎng)養(yǎng)基◆營養(yǎng)水平平不同：：基本培養(yǎng)養(yǎng)基、完完全培養(yǎng)養(yǎng)基（一）培培養(yǎng)基的的種類◆成分和濃濃度不同同：含鹽量較較高的培培養(yǎng)基、、硝酸鉀鉀含量較較高的培培養(yǎng)基、、中等無無機鹽含含量的培培養(yǎng)基、、低無機機鹽含量量的培養(yǎng)養(yǎng)基54541、MS培養(yǎng)基◆無機鹽鹽濃度高高◆高含量量的氮、、鉀，尤尤其是硝硝酸鹽◆含有一一定數(shù)量量的銨鹽鹽◆營養(yǎng)豐豐富◆不需要要添加更更多的有有機附加加物（二）幾幾種常見見培養(yǎng)基基的特點點2、White培養(yǎng)基◆1943年由White為培養(yǎng)番番茄根尖尖而設(shè)計計◆1963年作了改改良，提提高MgSO4的濃度和和增加硼硼元素◆無機鹽鹽濃度較較低◆使用廣廣泛◆在生根根培養(yǎng)、、胚胎培培養(yǎng)中有有良好的的效果大量元素含量微量元素含量鐵鹽含量有機物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0煙酸0.3瓊脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3.0鹽酸硫胺素0.1

NaH2PO44H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆辛0.1KCl65CuSO45H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：：White培養(yǎng)基基563、B5培養(yǎng)基基◆1968年由Gamborg等為培培養(yǎng)大大豆根根細胞胞而設(shè)設(shè)計◆含有有較低低的銨銨鹽◆較高高的硝硝酸鹽鹽和鹽鹽酸硫硫胺素素組成成分數(shù)量(mg/l）組成成分數(shù)量(mg/l)KNO3

2500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0煙酸1.0MnSO4·4H2O10鹽酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激動素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025鹽酸硫銨10Na2-EDTA37.3

B5培養(yǎng)基基的組組成和和配方方574、N6培養(yǎng)基基◆1974年朱至至清等等為水水稻等等禾谷谷類作作物花花藥培培養(yǎng)設(shè)設(shè)計◆KNO3和(NH4)2SO4含量高高，不不含鉬鉬組成成分數(shù)量(mg/l)組成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463煙酸0.5KI0.8鹽酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4鹽酸硫銨1.0ZnSO4·7H2O1.5N6培養(yǎng)基基組成成及配配方58第三章章培培養(yǎng)基基和培培養(yǎng)條條件為了減減少工工作量量，減減小誤誤差，，最方方便的的方法法是預(yù)預(yù)先配配制好好不同同組分分的培培養(yǎng)基基母液液。一、培培養(yǎng)基基母液液的配配制601.配制母母液原原則相同類類型的的試劑劑混合合；易形成成沉淀淀的藥藥品分分開；；母液濃濃度要要適宜宜；用量要要認真真計算算和核核對；；藥品要要準確確稱量量。612.MS培養(yǎng)基基母液液的配配制62MS培養(yǎng)基基母液液根據(jù)據(jù)試劑劑特性性通常常配成成五種母母液，即大量量元素素母液液（10或20倍）、、微量量元素素母液液（100或1000倍）、、Fe鹽（100倍）、、Ca鹽（50倍）、、有機機物（（100倍）。633.激素母母液的的配制制64生長素素類、、赤霉霉素類類及脫脫落酸酸等用用95％乙醇醇溶解解；細胞分分裂素素類用用1NHCl或1NNaOH溶解。。通常激激素母母液濃濃度生生長素素類為為0.1~0.5mg/ml,細胞分分裂素素母液液濃度度為0.2~1.0mg/ml.二、培培養(yǎng)基基的配配制水藥品糖瓊脂混合加熱溶溶解調(diào)整pH玻璃器器皿水洗干燥分裝滅菌封口冷卻接種1、取出出母液液并按按順序序放好好。將將潔凈凈的各各種玻玻璃器器皿如如量筒筒、容容量瓶瓶、移移液管管、移移液槍槍和玻玻璃棒棒等放放在指指定位位置；；2、取一一只容容量瓶瓶，放放入配配制培培養(yǎng)基基總量量的1/3左右純純水，，將母母液按按順序序加入入，并并不斷斷攪拌拌；3、加入入植物物生長長調(diào)節(jié)節(jié)劑后后定容容；培養(yǎng)基基的配配制的的具體步步驟：4、將定定容的的培養(yǎng)養(yǎng)基倒倒入容容器中中，加加入蔗蔗糖和和瓊脂脂，并并加熱熱使其其完全全溶解解；5、調(diào)整整pH；6、將培培養(yǎng)基基分裝裝倒培培養(yǎng)器器皿中中，封封好瓶瓶口；；7、滅菌菌，用用高壓壓鍋滅滅菌（（121℃，15～20min）或過過濾除除菌；；8、滅菌菌后待待高壓壓鍋溫溫度下下降到到50℃℃以下時時，便便可以以取出出、冷冷卻凝凝固后后待用用。6869三、培培養(yǎng)基基的保保存配制好好的培培養(yǎng)基基一般般要在在室溫溫、黑黑暗且且清潔潔的地地方放置3～5天再使使用。保存時時間太太久，，培養(yǎng)養(yǎng)基可可能會會污染、、脫水水、易易分解解的成成分會會發(fā)生生分解解，培培養(yǎng)基基成分分會發(fā)發(fā)生較較大的的變化化。每批培培養(yǎng)基基均必必須附附有該該批培培養(yǎng)基基制備備記錄錄副頁頁或明明顯標標簽。。四、培培養(yǎng)條條件71溫度光照濕度氣體培養(yǎng)基的滲滲透壓pH值植物材料一一般最適溫溫度在25±2℃℃之間環(huán)境條件光強：1000~6000lx一般情況下下，培養(yǎng)器器內(nèi)相對濕濕度應(yīng)達100%，培養(yǎng)室內(nèi)內(nèi)環(huán)境的相相對濕度在在70%~80%氧氣是愈傷傷組織生長長所必需的的調(diào)節(jié)滲透壓壓常常從糖糖入手植物組織培培養(yǎng)時培養(yǎng)養(yǎng)基的pH值大多在5.0－6.5光質(zhì)：影響細胞分分裂和器官官分化光周期：光照16h，黑暗8h第三節(jié)基基本操作一、洗滌1、玻璃器皿皿洗滌新購置玻璃璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌滌清水沖洗晾干備用已用過的玻玻璃器皿2、塑料用品品洗滌塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗洗晾干備用733、金屬用品品洗滌熱洗衣粉水水洗凈沖洗擦干74751.滅菌方法：：（1）物理方法法：物理滅菌干干熱、濕熱熱、射線處處理、物理理除菌、過過濾、離心心、沉淀等等（2）化學(xué)方法法：消毒劑、抗抗菌素滅菌菌75二、消毒滅滅菌2、滅菌（1）培養(yǎng)基滅滅菌：高溫高壓濕濕熱滅菌法法壓力在9.8×104—10.8×104Pa溫度在121℃滅菌20—30min（2）玻璃器皿皿滅菌：蒸汽高壓消消毒滅菌干熱消毒滅滅菌76飽和蒸汽壓壓力與其對對應(yīng)的溫度度飽和蒸汽壓力溫度（℃）飽和蒸汽壓力溫度（℃）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0001.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.677（3）塑料器皿滅滅菌：多采用高壓蒸汽消消毒滅菌（4）金屬用具具滅菌：灼燒滅菌浸入95%酒精，后置置于酒精火火焰上灼燒燒，冷卻后后使用（5）過濾滅菌菌：一些生長調(diào)節(jié)劑劑，如赤霉素、玉玉米素、脫脫落酸和某某些維生素素。78（6）接種室滅滅菌空氣消毒滅滅菌接種室超凈工作臺臺紫外燈照射射70%—75%的酒精擦洗洗培養(yǎng)材料的的接種紫外燈照射射79（7）外植體滅滅菌流水沖洗10—20min或更長時間間70%—75%酒精中浸泡泡30s0.1%——0.2%氯化汞液中中浸泡10min左右蒸餾水沖洗洗4—5次在10%的次氯酸鈉鈉、飽和漂漂白粉浸泡泡30min左右備用80常用消毒