免疫抑制小鼠灌服蠐螬多肽的療效分析,免疫學論文

免疫抑制小鼠灌服蠐螬多肽的療效分析,免疫學論文摘要：目的觀察蠐螬多肽提取物對免疫抑制小鼠的免疫功能的影響。方式方法采取蛋白酶水解提取蠐螬多肽,電泳確定相對分子質(zhì)量大小,然后天天給小鼠灌服不同劑量多肽連續(xù)20d,除對照組外其余小鼠在實驗結束前連續(xù)3d腹腔注射環(huán)磷酰胺,試驗結束小鼠稱體質(zhì)量、采血、無菌操作制備脾臟細胞,體外培養(yǎng)添加脂多糖和刀豆蛋白A誘導細胞分化,采用MTT和Griess法檢測細胞增殖率和NO分泌量;分光光度法和流式技術檢測血清溶血素及巨噬細胞吞噬功能,遲發(fā)型超敏反響分析免疫原性。結果酶解提取蠐螬多肽質(zhì)量濃度為37.01mg/ml,提取率為31.63%,Mr在8000～9000。模型組小鼠脾臟肝臟胸腺指數(shù)顯著低于對照組和蠐螬組,小鼠脾臟和骨髓T、B淋巴細胞存活率及NO分泌量明顯低于對照組和蠐螬組,華而不實骨髓B淋巴細胞存活率顯著高于T淋巴細胞,但脾臟和骨髓T淋巴細胞NO分泌量高于B淋巴細胞;對照組和蠐螬多肽組小鼠溶血素吸光度值顯著高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加溶血素含量逐步提高,但不存在劑量效應關系;蠐螬組小鼠血液白細胞數(shù)均高于模型組,隨著劑量增加白細胞數(shù)提高;中高劑量蠐螬多肽組小鼠耳腫脹度高于模型組,隨著蠐螬劑量增加耳腫脹度顯著增加,存在劑量效應關系;蠐螬組小鼠腹腔骨髓脾臟巨噬吸光度值高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加吸光度值提高,存在劑量效應關系;流式細胞技術檢測結果蠐螬組巨噬細胞吞噬雞紅細胞熒光強度強于模型組,巨噬細胞吞噬雞紅細胞陽性細胞數(shù)不明顯高于模型組,結果提示巨噬細胞吞噬能力強。結論蠐螬多肽具有明顯加強免疫抑制小鼠免疫功能的作用。本文關鍵詞語：蠐螬多肽;小鼠;免疫功能;Abstract：Thisstudywasperformedtoinvestigatetheeffectsofpolypeptideextractsfromgrubonimmunefunctionofimmunosuppressivemice.Thegrubpolypeptides(GP)wereextractedbyproteasemethod,andthesizeofthemoleculewasdeterminedbyelectrophoresis.Thenthemiceweregivenorallydifferentdosesofgrubpeptidesfor20days.Allmiceexceptthemiceincontrolgroupwereintraperitoneallyinjectedwithcyclophosphamide(CTX)for3daysbeforetheendoftheexperiment.Themicewerepreparedbyweighing,collectingbloodandasepticoperationforspleencells.Thecelldifferentiationwasinducedbylipopolysaccharide(LPS)andconcanavalinA(ConA),andcellproliferationandNOlevelweredetectedbyMTTandGriessmethod.Theserumhaemolysinandmacrophagephagocytosiswereevaluatedbyspectrophotometryandflowcytometry,whiletheimmunogenicitywasanalyzedbydelayedhypersensitivity.Datashowedthattheconcentrationofpolypeptideextractedbyenzymolysiswas31.63%andtheextractionratewas37.01mg/ml,withmolecularweightof8to9KDa.Thespleenandliverthymusindexesofmiceinmodelgroupweresignificantlylowerthanthoseofthecontrolandthegrubgroups.ThesurvivalrateofspleneticandmyeloidTandBlymphocytesandthesecretionofNOinmodelmiceweresignificantlylowerthanthoseofthecontrolandthegrubgroups.ThesurvivalrateofBlymphocytefrombonemarrowwassignificantlyhigherthanthatofTlymphocyte,butthesecretionofNOinthespleenandbonemarrowTlymphocytewashigherthanthatofBlymphocyte.Theabsorbanceofhaemolysinincontrolgroupandgrubpolypeptidegroupweresignificantlyhigherthanthatinmodelgroup.Withtheincreasingofgrubpolypeptidedose,thecontentofhemolysinincreasedgradually,buttherewasnodoseeffectrelationship.Thenumberofwhitebloodcellsingrubgroupswashigherthanthatinmodelgroup.Theearswellingofthemiceinmediumandhighdosegrubpolypeptidegroupswerehigherthanthatofmodelgroup.Withtheincreasingofgrubdose,theearswellingthicknessincreasedsignificantly,andtherewasadoseeffectrelationship.Theabsorbancevaluesofthemacrophagesfromabdominalcavityandbonemarrowaswellasspleenofgrubgroupwerehigherthanthoseofmodelgroup,andtherewasadoseeffectrelationship.Thefluorescenceintensityofmacrophagephagocytosisingrubgroupwasstrongerthanthatofmodelgroup,andthenumberofpositivecellsofmacrophagesphagocytingredcellwasnotsignificantlyhigherthanthatofmodelgroup,whichsuggestedthatthemacrophagephagocytosiswasstrong.Takentogether,polypeptidesfromgrubcansignificantlyenhanceimmunefunctioninimmunosuppressedmice.Keyword：Grubpolypeptide;Mice;Immunefunction;蠐螬為金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子及同屬近緣昆蟲的枯燥幼蟲,在江蘇、安徽、山東和東北等地均有分布[1],神農(nóng)本草經(jīng)記載其具有破瘀、止痛和解毒的作用。文獻報道,蠐螬主要含有脂肪酸類、蛋白質(zhì)、糖類、生物堿和甾體化合物等[2,3]。金哲等[4]發(fā)現(xiàn)蠐螬聯(lián)用羥基喜樹堿對人MGC-803胃癌細胞株有顯著性抗增殖作用,陳梅等[5]發(fā)現(xiàn)蠐螬提取物能抑制家兔脈絡膜新生血管中的血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子表示出,抑制脈絡膜新生血管的構成。多肽是20種氨基酸以不同的的組成和排列方式構成的從二肽到復雜的線性或環(huán)形構造的具有不同生物活性肽類的總稱[6],由于多肽構造樣式繁多,其在人體生理和代謝上表現(xiàn)出多種藥理活性,主要有提高免疫力、降血糖和抗氧化等功能。嚴銘銘等[7]分離得到了單一鹿茸多肽CNT14,其能夠明顯促進小鼠海馬HT22細胞增殖。本研究擬從蠐螬中提取蠐螬多肽,通過體內(nèi)試驗分析其免疫調(diào)節(jié)作用,為蠐螬的開發(fā)應用提供試驗根據(jù)。1、材料與方式方法1.1、實驗材料環(huán)磷酰胺(CTX)購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司,RPMI1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司,刀豆蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司,噻唑藍(MTT)購自美國AMRESCO公司,羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)購自北京化工廠,蠐螬多肽(GP)由本實驗室制備。細胞培養(yǎng)板和酶標板購自美國Corning公司,二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO產(chǎn)品,XSZ-D2倒置生物顯微鏡為重慶光學儀器廠產(chǎn)品,粉碎機(小型)購于日本日立公司。6～8周齡健康昆明小鼠,體質(zhì)量20～22g,購于中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心【SCXK-(京)2021-0002】。1.2、蠐螬多肽的提取純化及鑒定1.2.1、提取取5g蠐螬粉于含100ml蒸餾水的燒杯中并調(diào)pH至8.0,向其參加木瓜蛋白酶攪拌,置于55℃水浴鍋水浴2.5h,然后置于100℃沸水10min終止酶解反響,10000r/min離心15min,收集上清為蠐螬多肽粗提取物;粗提取物與10%三氯乙酸1.25ml搖勻,靜置10min,4000r/min離心15min,取3ml上清液參加2ml雙縮脲試劑混勻,靜置10min后2000r/min離心10min,取上清于540nm處測吸光度值,同時制作谷胱甘肽標準曲線,計算蠐螬多肽質(zhì)量濃度及提取率。1.2.2、純化采用Mr10000膜超濾粗提物得Mr10000和Mr10000多肽,然后用10ml玻璃分離柱,0.02mol/L的Tiris-HCl作為緩沖液,0.5mol/L的NaCl做梯度洗脫,洗脫流速1ml/min,上樣質(zhì)量濃度25mg/ml的上樣量1～2ml進行離子層析,按洗脫峰收集分離純化Mr10000的蠐螬多肽,備用。1.2.3、鑒定采用Tricine-SDS法鑒定蠐螬多肽相對分子質(zhì)量,首先按4∶1取蠐螬多肽和5loadingBuffer混合,沸水浴10min,冷至室溫備用;然后根據(jù)凝膠配方制膠;其次灌膠:取制膠架、1.5mm制膠板、制膠夾和電泳槽一套,組裝并檢查能否漏膠,用加樣槍緩緩注膠于裝置內(nèi),加樣后用去離子水壓平界面,靜置等待分層,同理參加濃縮膠,插入10孔梳子,準備電泳;最后點樣:裝備好電泳設備后槽中參加電泳液,依次加點樣蛋白Marker5?l和樣品30?l。1.3、動物分組與給藥處理取50只健康昆明小鼠隨機分對照組、模型組(環(huán)磷酰胺組)、蠐螬多肽組;蠐螬組小鼠天天1次灌服不同劑量蠐螬多肽(50、100、200mg/kg),對照組和模型組灌服等量生理鹽水,連續(xù)灌服20d,實驗結束前3d,除對照組外其余小鼠天天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CY)50mg/kg,連續(xù)3d。1.4、小鼠白細胞數(shù)與臟器指數(shù)的測定實驗結束小鼠稱體質(zhì)量,取全血于抗凝管中,采用全血細胞分析儀檢測白細胞數(shù);頸椎脫臼處死小鼠,摘取脾臟、肝臟、腎臟,生理鹽水清洗,濾紙吸干后稱質(zhì)量,根據(jù)公式計算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。1.5、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反響(DTH)檢測末次給藥后小鼠腹部剃毛,均勻涂抹50?l二甲苯致敏,4d后在小鼠右耳均勻涂抹20?l二甲苯,24h后將小鼠頸椎脫臼處死,用直徑為8mm打孔器在左右耳一樣位置取下圓耳片稱質(zhì)量,記錄致敏前后質(zhì)量之差即為其耳脹程度。1.6、小鼠淋巴細胞和巨噬細胞制備處死小鼠無菌操作取脾于200目細胞篩研碎,收集細胞懸液,3000r/min離心4min,棄上清PBS懸浮細胞,加紅細胞裂解液1～2min,3000r/min離心4min,棄上清反復洗,培養(yǎng)基重懸細胞,參加細胞培養(yǎng)皿37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4h,收集未貼壁懸浮細胞,3000r/min離心4min,棄上清加完全培養(yǎng)基重懸細胞,計數(shù)調(diào)整細胞數(shù)至1106/ml;同樣方式方法收集貼壁細胞,制備脾臟巨噬細胞;無菌操作取脛骨和股骨,收集骨髓細胞于細胞培養(yǎng)皿,同理脾細胞制備一樣,制備骨髓淋巴細胞和巨噬細胞備用(運晨霞等)[8]。1.7、小鼠淋巴細胞增殖檢測取100?l脾細胞(或骨髓細胞)和100?l完全培養(yǎng)基參加96孔細胞板,T淋巴細胞組每孔加5?l100?g/mlConA,B淋巴細胞組每孔加2?l1mg/mlLPS,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,然后每孔參加8?l5mg/mlMTT繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄上清每孔加150?lDMSO,振蕩10min酶標儀570nm測OD值,計算細胞增殖率%=處理組吸光度值/對照組吸光度值100%1.8、小鼠淋巴細胞分泌NO檢測汲取細胞上清100?l至酶標板中,每孔參加等量Griess試劑,室溫反響10min,置于490nm測吸光值,根據(jù)NaNO2標準曲線,計算細胞分泌NO量。1.9、染色法檢測巨噬細胞吞噬功能取100?l巨噬細胞懸液參加96孔細胞培養(yǎng)板,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,棄上清,每孔各加0.075%的中性紅100?l,繼續(xù)培養(yǎng)3h,棄去中性紅,用PBS洗2次,加細胞裂解劑(醋酸∶無水乙醇=1∶1V/V),酶標儀540nm測吸光度值。1.10、流式細胞技術檢測巨噬細胞的吞噬能力1.10.1、CFSE標記雞紅細胞[9]取雞靜脈采血,制備新鮮雞紅細胞(cRBC),參加PBS稀釋,1600r/min離心5min,棄上清,PBS重復洗2次,用RPMI1640培養(yǎng)液將雞紅細胞數(shù)調(diào)為4107/ml,參加10mmol/L的CFSE使其終濃度為5?mol/L,37℃培養(yǎng)箱恒溫孵育15min,取出加培養(yǎng)液終止反響,1600r/min離心5min,棄上清,培養(yǎng)液洗2次,懸浮細胞計數(shù),將CFSE-cRBC細胞數(shù)調(diào)為2106/ml,以備用。1.10.2、CFSE標記雞紅細胞與巨噬細胞共孵育[10]將收集的巨噬細胞參加24孔細胞培養(yǎng)板,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～4h,取出棄上清加無菌PBS沖洗2次,向細胞培養(yǎng)板各孔加2106/mlCFSE-cRBC細胞液1ml,然后將其置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共同孵育2～4h。1.10.3、流式細胞儀檢測巨噬細胞的吞噬能力[11]收集共同孵育的巨噬細胞和雞紅細胞于離心管,1600r/min離心5min,棄上清,參加緩沖液重懸細胞并將細胞數(shù)調(diào)為4106/ml,分別取各組100?l細胞懸液于流式管,上流式細胞儀檢測。1.11、血清溶血素含量測定結束前7d小鼠腹腔注射5%雞紅細胞懸液0.2ml,末次給藥24h后,采血制備血清,生理鹽水100倍稀釋血清,取稀釋血清1ml與5%雞紅細胞懸液0.5ml以及10%豚鼠補體1ml混合,37℃溫育30min,0℃終止反響,離心取上清,置于紫外分光光度計540nm測OD值。1.12、統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以平均數(shù)標準差表示,采用t檢驗分析,P0.05以為差異有統(tǒng)計學意義。2、結果2.1、蠐螬多肽的提取純化與鑒定采用酶解法制備蠐螬多肽,華而不實料液比1∶20、加酶量和酶解的時間分別為6000U和2.5h,利用谷胱甘肽標準曲線測得蠐螬多肽粗提取物質(zhì)量濃度為37.01mg/ml,提取率為31.63%;通過超濾和離子層析得2個組分蠐螬多肽(圖1),收集高峰洗脫出來多肽,采用TricineSDS鑒定蠐螬多肽分子大小,結果觀察電泳圖,根據(jù)Marker蛋白相對分子質(zhì)量比照,提取的蠐螬多肽分子為相對分子質(zhì)量8000～9000的小肽(圖2)。2.2、蠐螬多肽對小鼠臟器指數(shù)的影響根據(jù)小鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量比擬,結果小鼠臟器指數(shù)見表1。由表1知,模型組小鼠脾臟肝臟胸腺指數(shù)顯著低于對照組,而蠐螬組小鼠脾臟肝臟胸腺指數(shù)提高,且顯著高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加,華而不實脾臟指數(shù)逐步提高,存在著劑量效應關系。圖1蠐螬多肽提取物離子層析純化圖Fig1Ionchromatographypurificationofpolypeptidesextractsfromthegrub圖2Tricine-SDS分析蠐螬多肽分子大小Fig2Tricine-SDSanalysisforthemoleculesizeofgrubpolypeptides2.3、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖和分泌NO的影響采用MTT法對免疫抑制小鼠不同組織淋巴細胞增殖分析,結果模型組小鼠T、B淋巴細胞存活率明顯低于對照組,蠐螬組脾臟和骨髓T、B淋巴細胞存活率高于模型組,華而不實脾臟B淋巴細胞存活率顯著增加,而且高于脾臟T淋巴細胞(圖3a);蠐螬組骨髓T淋巴細胞存活率為81.48%5.23%,B淋巴細胞存活率為95.27%5.56%,骨髓B淋巴細胞存活率顯著高于T淋巴細胞(圖3b)。表1蠐螬多肽對免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響a)P0.05,b)P0.01,vscontrolgroup;c)P0.01,vsmodelgroup.采用Griess法分析淋巴細胞分泌NO情況,結果模型組小鼠脾臟和骨髓T、B淋巴細胞NO分泌量明顯低于對照組,蠐螬組T、B淋巴細胞NO分泌量較模型組明顯增加,隨蠐螬多肽劑量增加淋巴細胞分泌NO量逐步提高,存在劑量依靠關系(圖4),華而不實脾臟T淋巴細胞NO量到達(1.330.11)mmol/L,而B淋巴細胞高達(1.260.08)mmol/L(圖4a),骨髓T淋巴細胞NO濃度到達(1.550.05)mmol/L,B淋巴細胞高達(1.340.13)mmol/L(圖4b),脾臟和骨髓T淋巴細胞分泌NO量高于B淋巴細胞。圖3蠐螬多肽對免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖的影響Fig3Effectsofgrubpolypeptidesontheproliferationoflymphocytesinimmunosuppressivemicea)Splen;b)bonemarrow.**P0.01,vscontrolgroup;△P0.05,vsmodelgroup.圖4蠐螬多肽對免疫抑制小鼠淋巴細胞NO分泌的影響Fig4EffectsofgrubpolypeptidesonNOsecretionfromlymphocytesofimmunosuppressivemicea)Splen;b)bonemarrow.**P0.01,vscontrolgroup;△P0.05,△△P0.01,vsmodelgroup.2.4、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響采用分光光度法分析巨噬細胞吞噬功能,結果模型組腹腔脾臟骨髓巨噬細胞吸光度值顯著低于對照組,蠐螬組小鼠腹腔骨髓脾臟巨噬吸光度值高于模型組,隨著蠐螬多肽劑量增加吸光度值提高,存在劑量效應關系(圖5);3種組織巨噬細胞之間比擬,腹腔和脾臟巨噬細胞吸光度值高于骨髓巨噬細胞。采用流式細胞技術分析腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力,結果蠐螬組巨噬細胞吞噬雞紅細胞熒光強度強于模型組,巨噬細胞吞噬雞紅細胞陽性細胞數(shù)不明顯高于模型組,結果提示巨噬細胞吞噬能力加強了(圖6)。圖5分光光度法分析蠐螬多肽對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響Fig5Effectsofgrubpolypeptidesonthephagocytosisofmacrophagesfromimmunosuppressivemicedetectedbyspectrophotometry**P0.01,vscontrolgroup;△P0.05,△△P0.01,vsmodelgroup.2.5、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠白細胞數(shù)和溶血素的影響采用分光光法檢測小鼠血清溶血素含量,結果對照組和蠐螬多肽組小鼠溶血吸光度值顯著高于模型組組,隨著蠐螬多肽劑量增加小鼠血清溶血素含量逐步提高,但不存在劑量效應關系。采用血細胞分析儀檢測小鼠血液中白細胞數(shù),結果模型組小鼠血液白細胞數(shù)低于對照組,蠐螬組小鼠血液白細胞總數(shù)均高于模型組,隨著劑量增加白細胞數(shù)提高,且高劑量組呈現(xiàn)極顯著性差異,結果提示蠐螬多肽能增加小鼠血液中白細胞的數(shù)量(表2)。表2蠐螬多肽對免疫抑制小鼠白細胞與溶血素的影響a)P0.05,b)P0.01,vscontrolgroup;c)P0.05,d)P0.01,vsmodelgroup.圖6流式細胞技術分析蠐螬多肽對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響Fig6Effectsofgrubpolypeptidesonthephagocytosisfunctionofmacrophagesfromimmunosuppressivemicedetectedbyflowcytometrytechnology*P0.05,**P0.01,vsmodelgroup.2.6、蠐螬多肽對免疫抑制小鼠DTH反響強度的影響DTH是檢測細胞免疫功能的常用方式方法,通過稱重小鼠左右耳片質(zhì)量,計算耳腫脹度。結果模型組小鼠耳腫脹度顯著低于對照組,中高劑量蠐螬多肽組小鼠耳腫脹度高于模型組,隨著蠐螬劑量增加耳腫脹度顯著增加,存在著劑量效應關系(圖7)。圖7蠐螬多肽對免疫抑制小鼠DTH反響強度的影響Fig7EffectsofgrubpolypeptideonDTHresponseintensityinimmunosuppressedmice*P0.05,vscontrolgroup;△P0.05,△△P0.01,vsmodelgroup.3、討論活性肽是由20種天然氨基酸以不同的組成和排列方式構成的環(huán)形或線性肽類的總稱,源于蛋白質(zhì)的功能性化合物,而活性肽在母體蛋白中通常沒有活性[12],因而生物活性肽的制備引起越來越多的學者關注和研究。當前制備生物活性肽的最常用方式方法是酶水解法,經(jīng)酶解植物或動物蛋白獲得多肽具有良好的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)[13,14]。酶解的條件對活性多肽的制備都有至關重要,蛋白酶在最適的環(huán)境下到達最大酶解效率。本實驗酶解的條件料液比1∶20、酶解時間2.5h和加酶量6000U,獲得螬多肽濃度為37.01mg/ml,提取率為31.63%,Mr為8000～9000。環(huán)磷酰胺(CY)作為癌癥化學治療藥物,是一種作用強、療效好的常用免疫抑制劑廣泛應用于臨床建立小鼠免疫抑制模型,用來觀察免疫促進藥物對免疫功能的影響,但因其非特異性的毒性作用,除殺傷癌細胞外對正常細胞具有毒性作用[15,16,17]。本研究結果表示清楚,與正常對照組比擬,CY模型組小鼠脾臟淋巴細胞增殖、NO分泌和巨噬細胞吞噬功能明顯被抑制,血清溶血素含量顯著降低,結果表示清楚環(huán)磷酰胺具有明顯的免疫毒性。白細胞是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分,白細胞數(shù)降低,提示機體抵御細菌入侵的能力減弱,易受感染。本研究蠐螬多肽能使免疫低下小鼠的外周血白細胞數(shù)升高至正常水平,表示清楚蠐螬多肽能夠改善機體的細胞免疫狀態(tài)。單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一,蠐螬多肽提高免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬能力,對免疫抑制小鼠吞噬功能有促進作用。免疫器官的發(fā)育決定了免疫功能的強弱,機體免疫功能情況可由淋巴細胞的增殖能力間接反映,如淋巴細胞的活化以及分化為免疫活性細胞,進而加強機體的免疫應答能力[18]。本試驗淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化結果顯示高劑量蠐螬多肽能夠促進免疫抑制小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖,低劑量促進作用不明顯。DTH具體表現(xiàn)出了機體的細胞免疫狀態(tài),是T細胞介導的細胞免疫應答[19]。本研究結果顯示,蠐螬多肽能夠加強小鼠DTH強度,且存在計量效應關系,隨蠐螬多肽的濃度增加而加強。講明蠐螬多肽能夠改善免疫抑制小鼠的細胞免疫功能。NO是一種細胞間信息傳遞的雙向調(diào)節(jié)因子,能緩解血管平滑肌緊張度、影響淋巴細胞增殖、免疫應答等。研究報道,細菌脂多糖能使免疫細胞NO分泌量升高,加強機體的免疫功能[20]。研究結果表示清楚蠐螬多肽促進免疫抑制小鼠脾臟淋巴細胞分泌NO,提示其介入免疫調(diào)節(jié)。異源動物紅細胞免疫動物后,B淋巴細胞可產(chǎn)生抗RBC抗體,即溶血素。這種抗體在體外與免疫源性RBC溫育后,在補體介入下可產(chǎn)生溶血反響,檢測反響體系溶血后光密度吸收值能夠反映溶血素水平,B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力,以此評價機體的體液免疫功能[21,22]。試驗結果蠐螬組小鼠外周血溶血素含量明顯高于模型組,低劑量蠐螬多肽可極顯著提高免疫抑制小鼠外周血溶血素含量,拮抗CY所致的體液免疫抑制,表示清楚蠐螬多肽能夠提高小鼠體液免疫能力。綜上所述,蠐螬多肽能對免疫抑制藥環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制小鼠特異性及非特異性免疫功能均有促進作用,試驗結果提示其可有望成為一種新的安全高效的免疫調(diào)節(jié)劑開發(fā),但其免疫調(diào)節(jié)作用機制還有待進一步研究。以下為參考文獻[1]國家藥典委員會.中國藥典一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2018:附錄45.[2]陳智,鄭學燕,朱榮剛,等.蠐螬化學成分及藥理作用研究進展[J].食品與藥品,2020,16(1):62-64.[3]陽長明,侯世祥,王新春,等.蠐螬與蠐螬滴眼液的成分研究[J].中藥材,2000,23(12):769-771.[4]金哲,孫抒,李基俊,等.蠐螬提取物體外對人MGC-803胃癌細胞株凋亡相關基因作用的研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2004,11(2):90-92.[5]陳梅,邱曉星,彭清華,等.蠐螬提取物對兔脈絡膜新生血管VEGF和bFGF表示出的影響[J].國際眼科雜志,2008,8(12):2443-2448.[6]喇文軍,劉冬,張力君,等.離子交換層析法分離純化玉米降血壓肽的研究[J].食品工程,2007,9(3):57-60.[7]嚴銘銘,曲曉波,王旭,等.梅花鹿茸中活性多肽的純化、測序及功能研究[J].高等學?；瘜W學報,2007,20(28):1893-1896.[8]運晨霞,余曉玲,吳光,等.三葉黃合劑對小鼠細胞免疫功能影響的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2018,20(5):1155-1157.[9]MaH,LiuG,DingW,etal.Diabetes-inducedalterationofF4/80(+)macrophages:astudyinmicewithstreptozotocininduceddiabetesforalongterm[J].JMolMed,2008,86(4):391-400.[10]SwanR,ChungCS,AlbinaJ,etal.Polymicrobi