基因?qū)W之人類基因組計劃

1人類基因組計劃2人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)是對全長約33億對堿基的人類基因組進行測序和注釋工作的國際科學合作計劃。該計劃所制作的基因組圖（GenomeMaps）將幫助科學家定位人類的全部基因。3一、歷史背景1985年：

美國能源部（DOE）提出

三項主要目標：

繪制高精度的人類染色體物理圖譜

開發(fā)相關技術及設備

擴展用于交流的網(wǎng)絡、計算能力以及數(shù)據(jù)庫容積4一、歷史背景1986年3月：

諾貝爾獲獎者RenatoDulbecco

在《Science》發(fā)表短文《腫瘤研究的轉(zhuǎn)折點——人類基因組測序》被譽為“人類基因組計劃”的標書5一、歷史背景1988年：

美國在NIH建立人類基因組國家研究中心

——NCHGR協(xié)調(diào)全國主要研究組織和實驗室

向國會提出15年，經(jīng)費￥30億。6一、歷史背景WatsonCollinsNCHGR第一任主任NCHGR第二任主任（1989）（1992）7一、歷史背景1990年：

美國官方正式宣布實施人類基因組計劃英、法、德、日制定了各自的人類基因組計劃

人類基因組計劃是一項國際合作事業(yè)8一、歷史背景人類基因組組織成立（HUGO）

協(xié)助研究資源的互通

鼓勵公眾的討論

對人類基因組研究的用途提出建議Bermuda原則

1996年2月，在Bermuda召開的國際會議上，合作者同意讓測序數(shù)據(jù)在24小時內(nèi)進入公共數(shù)據(jù)庫，9一、歷史背景1998年5月，CraigVenter創(chuàng)立Celera公司10一、歷史背景1993年：

中國成立人類基因組南方和北方中心1999年：

中國加入HGP

負責3號染色體短臂末端30萬bp的測序工作11二、目標12二、目標1.繪制人類基因組的遺傳圖2.繪制人類基因組的物理圖3.繪制人類基因組的序列圖4.繪制人類基因組的基因圖遺傳圖以遺傳標記為路標，以遺傳學距離為圖距的基因組圖。遺傳標記：具有遺傳多態(tài)性，在一個遺傳位點上具有一個以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率高于1%遺傳學距離：在減數(shù)分裂事件中兩個位點之間進行交換、重組的百分率，1%重組率為1cM（厘摩）14三代不同的遺傳標記：第一代標記：RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）第二代標記：VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復）第三代標記：SNP（單核苷酸多態(tài)性）15

限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）概念由于DNA多態(tài)性，如果取代的某一堿基正好位于某一限制性內(nèi)切酶識別序列內(nèi)，那么群體當中不同個體、不同染色體的DNA用相同的某一限制性內(nèi)切酶切割時產(chǎn)生不同長度的DNA片段。16可變數(shù)目的串聯(lián)重復（VNTR）概念基因組內(nèi)廣泛存在串聯(lián)重復序列，串聯(lián)重復首尾相連。在群體中不同的個體或不同的染色體中，其串聯(lián)重復的拷貝數(shù)不同而產(chǎn)生的多態(tài)。17可變數(shù)目的串聯(lián)重復（VNTR）重復單元衛(wèi)星DNA：>25bp

小衛(wèi)星DNA：6~25bp

微衛(wèi)星DNA：2~6bp18可變數(shù)目的串聯(lián)重復（VNTR）19單核苷酸多態(tài)（SNP）概念

DNA序列中單個核苷酸發(fā)生的變異。位置編碼區(qū)、非編碼區(qū)、基因間20遺傳圖應用RFLP繪制遺傳圖：標記間距>10cM應用VNTR繪制遺傳圖：標記間距達1cM應用SNP繪制遺傳圖：將遺傳圖和物理圖有機整合21物理圖以序列標簽位點為路標，以序列長度kb或Mb為圖距的基因組圖。步驟：（1）用限制性內(nèi)切酶切割DNA鏈（2）序列分析（3）構建克隆片段重疊群23物理圖

序列標簽位點（sequencetaggedsite,STS）：已知核苷酸序列的一個DNA片段稱為STS。

STS作為基因組中的特殊位點，可用兩個引物由PCR來鑒定。物理圖的制作伴隨DNA克隆技術的發(fā)展而完善。2425載體將外源DNA片段運送到受體細胞，并能進行自我復制增殖和表達的工具。26載體的基本特征

（1）分子量小，便于與較大的DNA片段結合，能進入受體細胞并在其中增殖。（2）有多種限制酶切位點，但對于每一種限制酶只能有一個酶切位點。（3）被切割載體DNA插入外源DNA后，不影響自身的復制和表達能力。（4）載體上要有可選擇的標記基因（如抗藥基因）或報道基因，以利于在受體細胞中被選出。（5）克隆載體上要有復制起點，表達載體上還要有啟動子。27載體種類：（1）克隆載體：外源DNA片段在宿主細胞中復制、拷貝增多。質(zhì)粒

λ噬菌體粘粒細菌人工染色體酵母人工染色體（2）表達載體：外源DNA片段或基因在宿主細胞中表達產(chǎn)生蛋白質(zhì)。281、質(zhì)粒（plasmid）獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子。29具備特點：片段較小，多克隆位點，抗性基因，復制起始點302、λ噬菌體（λphage）

一種可在體外包裝的細菌病毒，可高效感染大腸桿菌。

COS序列：5′末端12bp突出的互補粘末端，進入宿主細胞后配對環(huán)化。3132

置換λ載體：33

插入λ載體：343、粘粒（cosmid）將質(zhì)粒和λ噬菌體改造的載體，改造后含λ噬菌體的COS序列以及質(zhì)粒特性354、細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）

抗生素抗性標記復制子oriS

解旋酶（RepE）確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座（parA,parB，parC等）365、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）

著絲粒端粒

自主復制序列元件37物理圖第一代物理圖譜：由酵母人工染色體構建的疊連群第二代物理圖譜：由細菌人工染色體與P1人工染色體

克隆疊連群38序列圖是人類基因組的核苷酸序列圖，也是分子水平的最高層次和最精確的物理圖。是指核苷酸在每條染色體上從一個末端經(jīng)著絲粒到另一末端的精確次序。只有測序完成才能繪制出全基因組30億堿基分布于每條染色體上正確順序的序列圖。3940四、遺傳學和醫(yī)學相互影響4.人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)41測序技術的發(fā)展

Sanger測序↓

焦磷酸測序↓

Next-generationsequencing

42雙脫氧鏈終止法（Sanger測序）：

磷酸二酯鍵43444546474849焦磷酸測序（Pyrosequencing）Pyrosequencing技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團（PPi）。

PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成。50焦磷酸測序（Pyrosequencing）第1步：

1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然后加入酶混合物（包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。51焦磷酸測序（Pyrosequencing）第2步：

向反應體系中加入1種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3‘末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸（PPi）。52焦磷酸測序（Pyrosequencing）第3步：

在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過CCD光學系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。53焦磷酸測序（Pyrosequencing）54第4步：反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。焦磷酸測序（Pyrosequencing）55焦磷酸測序（Pyrosequencing）第5步：

加入另一種dNTP，使第2~4步反應重復進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。Next-generationsequencing

57Next-generationsequencing

第三代測序

5960在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎上繪制的結合有關基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。（1）獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄/人工合成cDNA（EST）（2）以EST為探針，進行雜交（3）鑒定轉(zhuǎn)錄相關基因基因圖62三、進程2000年6月，完成人類基因組的框架圖（工作草圖）63三、進程2003年4月，完成人類基因組DNA的關鍵序列圖64三、進程2006年5月，完成人類最后1條染色體——1號染色體的測序65中國對基因組研究的主要貢獻

1999年加入HGP3號染色體短臂末端30萬bp

完成人類基因組關鍵序列圖的六國之一

水稻基因組框架圖

2007年10月，“炎黃一號”人類基因組單體型圖計劃（HapMap）黑猩猩基因組序列66人與黑猩猩的基因組只有1.32％的差別黑猩猩的Chr22＝人的Chr21中國對基