復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨修復(fù)下頜骨缺損

www.CRTERwww.CRTER.org蔣柳宏，等.復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨修復(fù)下頜骨缺損www.CRTERwww.CRTER.org蔣柳宏，等.復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨修復(fù)下頜骨缺損PAGE2368P.O.Box10002PAGE3P.O.Box1200,中國組織工程研究第20卷第16期2016–04–15出版www.CRTER.orgChineseJournalofTissueEngineeringResearchApril15,2016Vol.20,No.16www.CRTER.org··研究原著·PAGE2360P.O.Box10002復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨修復(fù)下頜骨缺損蔣柳宏1，董瀅2，閆春歌1，劉艷輝1，景向東1(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，廣東省廣州市510405；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院口腔科，廣東省廣州市511495)引用本文：蔣柳宏，董瀅，閆春歌，劉艷輝，景向東.復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨修復(fù)下頜骨缺損[J].中國組織工程研究，2016，20(16):2360-2368.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.011ORCID:0000-0003-2108-4111(蔣柳宏)文章快速閱讀：富血小板血漿復(fù)合珊瑚骨修復(fù)下頜骨缺損富血小板血漿復(fù)合珊瑚骨修復(fù)下頜骨缺損蔣柳宏，男，1979年生，碩士，主治醫(yī)師，主要從事口腔疾病診治工作。蔣柳宏，男，1979年生，碩士，主治醫(yī)師，主要從事口腔疾病診治工作。中圖分類號:R318文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:2095-4344(2016)16-02360-09稿件接受：2016-03-10http://WWW.健康新西蘭大白兔健康新西蘭大白兔24只，制備下頜骨缺損模型制備珊瑚人工骨提取富血小板血漿對照組8只單純植入珊瑚骨實驗組8只植入珊瑚骨復(fù)合自體富血小板血漿空白對照組8只不植入任何材料術(shù)后2，4，8，12周每組分別處死2只兔，進(jìn)行結(jié)果觀察大體標(biāo)本及剖面觀察影像學(xué)觀察計量新骨面積組織學(xué)觀察對結(jié)果進(jìn)行討論，并得出結(jié)論文題釋義：富血小板血漿：為高度濃縮的血小板，其中富含多種生長因子，它可促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化。自1998年Marx等首次用富血小板血漿復(fù)合移植骨修復(fù)下頜骨缺損以來，富血小板血漿已逐漸被應(yīng)用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域的組織修復(fù)中。珊瑚骨：為濱珊瑚，其主要成分為碳酸鈣，占99%，顯微結(jié)構(gòu)為多孔網(wǎng)狀，孔徑100-300μm，孔隙率為70%-90%，從結(jié)構(gòu)和成分兩方面模擬了天然骨，三維框架結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了從納米到微米級別的骨仿生。多孔的結(jié)構(gòu)，尤其是互聯(lián)的通道，利于營養(yǎng)的傳遞和細(xì)胞的遷移。摘要背景：富血小板血漿含有多種骨生長所需的生長因子，如血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)移性生長因子、類胰島素生長因子、表皮生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等，在骨再生的各個不同階段直接或間接促進(jìn)細(xì)胞的分化與增殖，促進(jìn)新骨再生。PAGE2365ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4P.O.Box1200,Shenyang110004kf23385083@目的：觀察復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨修復(fù)骨缺損的效果。方法：將24只新西蘭大白兔隨機分為3組，每組8只，建立單側(cè)下頜骨缺損模型，實驗組于骨缺損處植入復(fù)合自體富血小板血漿的珊瑚骨，對照組于骨缺損處植入珊瑚骨，空白對照組不植入任何材料。術(shù)后2，4，8，12周進(jìn)行影像學(xué)觀察和骨組織形態(tài)計量學(xué)分析。結(jié)果與結(jié)論：①X射線檢查結(jié)果：術(shù)后12周時，空白對照組缺損區(qū)整體密度增高，略低于周圍骨組織；實驗組、對照組缺損區(qū)密度接近宿主骨，材料與新生組織充分結(jié)合，且實驗組骨密度高于對照組。②骨組織形態(tài)計量學(xué)分析結(jié)果：術(shù)后12周內(nèi)，實驗組新骨面積顯著高于對照組、空白對照組(P<0.05)。③結(jié)果表明，復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，作為框架材料可引導(dǎo)再生骨向缺損內(nèi)生長，促進(jìn)骨缺損修復(fù)。JiangLiu-hong,Master,Attendingphysician,DepartmentofStomatology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,GuangdongProvince,China關(guān)鍵詞：JiangLiu-hong,Master,Attendingphysician,DepartmentofStomatology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,GuangdongProvince,China主題詞：富血小板血漿；下頜骨；組織工程MandibulardefectsrepairedbycoralbonewithplateletrichplasmaJiangLiu-hong1,DongYing2,YanChun-ge1,LiuYan-hui1,JingXiang-dong1(1DepartmentofStomatology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,GuangdongProvince,China;2DepartmentofStomatology,CliffordHospital,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou511495,GuangdongProvince,China)AbstractBACKGROUND:Plateletrichplasmacontainsvariousgrowthfactors,suchasplatelet-derivedgrowthfactor,metastaticgrowthfactor,insulin-likegrowthfactor,epidermalgrowthfactoraswellasvascularendothelialgrowthfactor.Therefore,itcandirectlyorindirectlypromotecelldifferentiationandproliferationindifferentstagesofboneregeneration.OBJECTIVE:Tostudytheeffectsofcoralbonewithplateletrichplasmaintherepairofmandibulardefects.METHODS:Totally24NewZealandwhiterabbitswererandomlydividedintothreegroups(n=8pergroup)includingtestgroup,controlgroupandblankcontrolgroup.Coralbonewithautologousplateletrichplasma,coralboneornothingwasimplanted,respectively,afterestablishingunilateralmandibulardefectmodels.Thedefectswereevaluatedbyimagingobservationandbonehis-tomorphometricanalysisat2,4,8,12weeksaftersurgery.RESULTSANDCONCLUSION:At12weeksaftersurgery,byimagingobservation,densityofthedefectincreasedintheblankcontrolgroup,whichwaslowerthanthatofthenormalbone;thebonedensityinthetestgroupwashigherthanthatinthecontrolgroup,bothofwhichweresimilarwiththenormalbone.Besides,thematerialswerecloselycombinedwiththenewtissues.Bybonehis-tomorphometricanalysis,areaofthenewboneinthetestgroupwassignificantlylargerthanthatinthecontrolandblankcontrolgroup(P<0.05).Inconclusion,coralbonewithplateletrichplasmahasgoodbiocompatibilityandboneconductivity,whichcaninduceboneregenerationtopromotedefectrepair.Subjectheadings:Platelet-RichPlasma;Mandible;TissueEngineeringCitethisarticle:JiangLH,DongY,YanCG,LiuYH,JingXD.Mandibulardefectsrepairedbycoralbonewithplateletrichplasma.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(16):2360-2368.0引言Introduction大段骨缺損的修復(fù)一直是臨床領(lǐng)域研究的重要課題，也是醫(yī)學(xué)界面臨的棘手難題之一。早在1934年，Key發(fā)現(xiàn)長管狀骨骨干的直徑?jīng)Q定了骨不愈合中骨缺損的范圍，當(dāng)長骨干骨缺損尺寸相當(dāng)于其直徑的1.5-2.5倍時，即難以自行愈合，造成永久性骨不連[1]。尋找理想修復(fù)骨缺損的方法是相關(guān)學(xué)科長期致力解決的課題。Cook曾指出，骨修復(fù)材料應(yīng)通過以下3種機制促進(jìn)骨的愈合：骨傳導(dǎo)作用、骨誘導(dǎo)作用和成骨作用。骨傳導(dǎo)作用是指置入的材料可作為宿主骨長入的支架，允許原始成骨細(xì)胞長入并在其中分化和成熟，同時有血管單元的想的修復(fù)材料應(yīng)既具有骨誘導(dǎo)性又具有骨傳導(dǎo)性，能促進(jìn)新骨的形成和生長，在新骨完成了結(jié)構(gòu)和功能重建后，植入物可被完全爬行替代。但目前骨缺損的修復(fù)主要采用自體骨移植和同種異體骨移植方法，兩種方法各有優(yōu)缺點，公認(rèn)的自體骨移植療效最佳，但骨源有限且供區(qū)有潛在的并發(fā)癥，增加了患者的創(chuàng)傷和痛苦；同種異體骨是臨床上常用的替代自體骨移植材料，但可誘發(fā)宿主產(chǎn)生劇烈免疫排異反應(yīng)，目前臨床上多采用經(jīng)冷凍、凍干、脫鈣或其他化學(xué)處理同種異體骨，其細(xì)胞成分多已壞死[4-6]，因此同種異體骨移植在成骨機制、愈合過程中的表現(xiàn)、免疫反應(yīng)等方面與自體骨移植有一定的差異。為克服自體骨移植和異體骨移植的缺點，近年來臨床上開始廣泛應(yīng)用天然材料和人工材料(金屬、陶瓷、高分子材料等)修復(fù)骨缺損，但無論哪種材料，其在生物相容性、可降解性、骨誘導(dǎo)性、生物活性等諸多方面都存在著各自的重大缺陷[7-10]。將具有骨誘導(dǎo)性的生物因子同支架材料復(fù)合培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程化人工骨成為骨缺損治療的發(fā)展趨勢。珊瑚人工骨作為一種良好的骨傳導(dǎo)性骨代用品，已被國內(nèi)外學(xué)者所證實[11-16]。富血小板血漿含有多種高濃度骨生長所需要的生長因子，如血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)移性生長因子、轉(zhuǎn)移性生長因子、類胰島素生長因子、表皮生長因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等[17-18]，它們在骨再生的各個不同階段通過直接或者間接的作用，促進(jìn)細(xì)胞的分化與增殖，從而促進(jìn)新骨再生。實驗將富血小板血漿與具有良好生物相容性及骨引導(dǎo)性的珊瑚骨復(fù)合，修復(fù)兔下頜骨骨質(zhì)缺損，探討富血小板血漿對材料成骨活性和生物相容性的影響，為復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨臨床應(yīng)用于口腔頜面部骨缺損修復(fù)提供更多資料。1材料和方法Materialsandmethods1.1設(shè)計隨機對照動物實驗。1.2時間及地點實驗于2014年6月至2015年10月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心完成。1.3材料珊瑚人工骨：選用海南省淺海灘產(chǎn)石頭狀濱珊瑚為原料，將其制成8mm×8mm×2mm的小塊，放入5%次氯酸鈉溶液浸泡24h，流水沖洗24h，超純水沖洗3次，5min/次，置于66℃實驗動物：6月齡健康雌性新西蘭大白兔24只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：2014-0092，體質(zhì)量2.5-3.0kg。24只新西蘭大白兔儀器和工具：電子天平，AnKe離心機，10mL離心管，吸管，移液管，吸量管，計數(shù)板，口腔用數(shù)碼X射線片機(villa，意大利)，切片機，染色工具，顯微鏡(德國LeicaMPS32)，DIA-2000病理圖像分析系統(tǒng)(武漢大學(xué))等。1.4實驗方法配置ACD-A抗凝劑及血小板稀釋液溶于10mL超純水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，?jīng)中性濾紙過濾兩次，高壓滅菌，備用。②血小板稀釋液：用電子天平分別稱取尿素1g、枸櫞酸鈉0.05g，溶于10mL三蒸水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，滴加體積分?jǐn)?shù)40%甲醛0.01mL，經(jīng)中性濾紙過濾2次，備用。富血小板血漿提取[19-22]：術(shù)前1d，將實驗組新西蘭大白兔固定后，以預(yù)先裝有1mL復(fù)方枸櫞酸鈉抗凝劑的10mL注射器從心臟抽取6mL血液，搖勻，置入10mL離心管中。按Petrungaro法分兩次離心，第1次離心半徑13.5cm，3650r/min離心6min；吸管吸取全部上清液至交界面下3mm，移至離心管，平衡后再次離心，離心半徑13.5cm，3000r/min離心6min。吸取約3/4上清液棄掉，剩余約0.8mL搖勻，即為富血小板血漿，置于0℃制備富血小板血漿復(fù)合材料[19-22]：將珊瑚人工骨和富血小板血漿置入高溫消毒小玻璃瓶或離心管中，密封，一次性注射器抽取瓶內(nèi)空氣，形成負(fù)壓，至孔隙內(nèi)無氣泡冒出，使富血小板血漿充分吸附至珊瑚人工骨微小孔隙內(nèi)，制備成復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨活性材料，靜置，備用。為保證每組材料的量一致，根據(jù)缺損區(qū)大小，每個樣本均選取2mm×2mm×2mm立方體材料7塊。制備兔下頜骨缺損模型與分組干預(yù)：所有動物均選右側(cè)為實驗側(cè)，左側(cè)不做處理。將新西蘭大白兔以氯胺酮0.2mL/kg耳后肌肉注射全麻成功后，右側(cè)頜下區(qū)脫毛備皮，左側(cè)臥位，常規(guī)消毒，鋪巾，沿下頜骨下緣走行做一2.0cm切口，依次切開皮膚、皮下組織、肌層直達(dá)骨膜，將骨膜從下頜骨下緣處切開，小心剝離下頜角區(qū)附著肌肉，游離頰舌側(cè)骨膜，分別向兩側(cè)銳性剝離骨膜瓣直達(dá)牙槽嵴頂，在此將骨膜完整與下頜骨剝離，剝離時小心謹(jǐn)慎，避免穿破骨膜造成骨膜的連續(xù)性缺失。暴露下頜骨體部中段，用電機磨出10mm×8mm全層矩形骨缺損，對照組填入珊瑚骨，實驗組填入復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨，空白對照組未填塞任何材料，止血，分層嚴(yán)密縫合骨膜、肌肉、皮下組織及皮膚。1.5主要觀察指標(biāo)大體觀察：嚴(yán)密觀察兔術(shù)后的一般情況。術(shù)后2，4，8，12周時處死動物，每組每個時間段2只，完整取下下頜骨標(biāo)本，去除軟組織，行大體觀察，觀察骨缺損區(qū)表面變化、骨缺損修復(fù)情況及周圍組織反應(yīng)。放射學(xué)檢查：取離體的右側(cè)下頜骨行頰舌向正位X射線片，投照距離20cm，投照條件70kV，60mA，曝光時間0.112s，觀察骨缺損愈合情況。組織學(xué)觀察：取術(shù)后2，4，8，12周各組骨缺損區(qū)，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定72h，EXAKT300PC硬組織切片機將骨塊沿頰舌向分切成2mm厚的骨片，再固定24h，流水沖洗24h，行梯度乙醇脫水，氯仿透明，樹脂浸透，42℃烤箱內(nèi)聚合3-5d，取出后修整組織塊并以LeicaSM2500E型切片機切片，厚約5μm，蘇木精-伊紅染色。對所有蘇木精-伊紅染色結(jié)果切片進(jìn)行新骨量的計算，具體步驟如下：采用DIA-2000病理圖像分析系統(tǒng)，4倍顯微鏡下在缺損區(qū)選擇4個角、4條邊中點及缺損中央共9個視野，進(jìn)行數(shù)碼圖像采集并計算新骨面積，9個視野區(qū)計量總和，每個標(biāo)本平均為3張切片，各組各個時間段為2個標(biāo)本，累計后取平均值，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示[23-25]1.6統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件處理，數(shù)據(jù)以±s表示，對術(shù)后2，4，8，12周時3組所得新骨量進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)一步做任意兩組均數(shù)之間的兩兩比較，再將各組每個時間段的計量值歸為一組，再次進(jìn)行方差分析及均數(shù)的兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果Results2.1實驗動物數(shù)量分析24只新西蘭大白兔均進(jìn)入結(jié)果分析。2.2各組大體觀察結(jié)果術(shù)后2周時，各組標(biāo)本骨缺損區(qū)均由纖維肉芽組織填充，質(zhì)地松軟。術(shù)后4周時，空白對照組標(biāo)本表面形態(tài)不規(guī)則，缺損區(qū)主要為纖維組織；實驗組、對照組頰、舌側(cè)表面可見部分骨皮質(zhì)形成，周圍纖維組織增生明顯，剖面觀察缺損區(qū)中央由材料、纖維結(jié)締組織及新生骨組織填充，未出現(xiàn)缺損中央空洞的情況，見圖1。術(shù)后8周時，空白對照組標(biāo)本骨缺損區(qū)邊緣有部分骨痂形成，周圍纖維組織增生明顯；實驗組、對照組骨缺損區(qū)內(nèi)組織更加致密，探針不能探入。術(shù)后12周時，實驗組、對照組刮除表面肉芽可見質(zhì)地粗糙的顆粒狀骨質(zhì)，空白對照組缺損區(qū)邊緣部分骨質(zhì)生成，但中心仍可用探針探入。2.3各組影像學(xué)觀察結(jié)果術(shù)后2周時，3組缺損區(qū)邊界基本清晰可見；術(shù)后4，8，12周時，3組缺損邊界逐漸模糊，缺損區(qū)中央及邊緣骨密度增高，高密度影面積增大?？瞻讓φ战M術(shù)后2周時缺損區(qū)中央呈透光影，邊界清晰；術(shù)后4周時，缺損區(qū)中央低密度影減小，下頜骨下緣方向邊緣模糊；術(shù)后8周時，缺損區(qū)密度略增高，表現(xiàn)為集中在缺損邊緣的骨痂影像；12周時缺損區(qū)整體密度增高，略低于周圍骨組織。對照組、空白對照組術(shù)后2周時，材料區(qū)與宿主骨交界處有少量模糊云霧狀致密影，隱約可見材料影像；術(shù)后4周時，材料區(qū)與宿主骨交界線較前模糊，缺損邊緣絮狀高密度影；術(shù)后8周時，缺損邊緣及中央出現(xiàn)片狀骨痂影像，材料與新生骨無界限；12周時缺損區(qū)密度接近宿主骨，材料與新生組織充分結(jié)合；實驗組術(shù)后第2，4，12周時骨密度較對照高，密度不均，絮狀阻射影更多，第8周時兩組骨密度相近，見圖2。2.4各組組織學(xué)觀察結(jié)果空白對照組：術(shù)后2周，缺損區(qū)中央約4mm范圍內(nèi)為空白區(qū)，邊緣主要為纖維組織，成纖維細(xì)胞豐富，未見成骨；術(shù)后4周，缺損區(qū)由大量纖維組織、成纖維細(xì)胞構(gòu)成，邊緣可見少量散在線狀新骨，中央未見成骨；術(shù)后8周，缺損中央可見少量散在梭形新骨形成，大量的纖維組織由脂肪組織替代，邊緣可見新骨向中間延伸。術(shù)后12周，缺損中央可見條索狀、水滴狀的新骨形成，新生骨周圍新生血管形成，大量纖維組織由脂肪組織替代，邊緣新骨形成并延伸至中央，見圖3。對照組：術(shù)后2周，缺損區(qū)由材料和纖維組織充填滿，材料之間由纖維組織連接，小部分區(qū)域材料之間可見小梁狀新骨形成，材料顆粒內(nèi)部可見成骨樣反應(yīng)；術(shù)后4周，缺損區(qū)內(nèi)由材料、纖維組織及新生骨組織構(gòu)成，材料之間可見條索狀新骨形成，部分連續(xù)成片，較密集。部分材料邊緣也可見新生骨組織包繞材料顆粒，不連續(xù)，由邊緣向中間擴(kuò)展，小面積區(qū)域成片狀；術(shù)后8周，缺損區(qū)內(nèi)由材料、纖維組織及新生骨組織填滿，材料之間為片狀的新生骨組織，周圍纖維組織包繞，缺損周邊的骨組織伸入材料內(nèi)，與材料內(nèi)的骨組織連接。材料顆粒少量完全由骨組織替代，部分成骨樣反應(yīng)；術(shù)后12周，缺損區(qū)由材料、新生骨組織、纖維組織及少量脂肪組織充填，材料之間為片狀骨組織，延伸成長條形，骨成熟度增高，中間存在裂隙，周圍由纖維和脂肪組織包繞，材料周邊新生骨伸入到材料內(nèi)部連接成片，材料顆粒內(nèi)部近1/2完全被骨組織替代并連接成片，剩余部分成骨樣反應(yīng)，表現(xiàn)為類骨質(zhì)，見圖4。實驗組：術(shù)后2周，缺損區(qū)已由材料和纖維組織充填滿，材料之間由纖維組織和少量條索狀新生骨連接，可見新骨由缺損邊緣沿材料之間間隙向中央延伸生長，材料邊緣也可見新生血管增多，材料顆粒內(nèi)部可見成骨樣反應(yīng)，少量類骨質(zhì)形成；術(shù)后4周，缺損區(qū)內(nèi)由材料、纖維組織及新生骨組織完全充填，材料之間有新生骨小梁形成，密集，骨量明顯增多，成網(wǎng)格狀分布，一層成骨細(xì)胞規(guī)則地排列在骨小梁表面，中間纖維組織較少，部分材料邊緣可見新生骨組織，條索狀連續(xù)生長，材料顆粒周圍可見新生骨包繞，由邊緣向中間擴(kuò)展，新生骨圖1圖1術(shù)后4周時各組缺損區(qū)頰、舌面大體觀Figure1Buccalandlingualviewinthedefectregionat4weeksaftersurgery圖注：圖中A-C分別為對照組、實驗組、空白對照組?？瞻讓φ战M標(biāo)本表面形態(tài)不規(guī)則，缺損區(qū)主要為纖維組織；實驗組、對照組頰、舌側(cè)表面可見部分骨皮質(zhì)形成，周圍纖維組織增生明顯，剖面觀察缺損區(qū)中央由材料、纖維結(jié)締組織及新生骨組織填充，未出現(xiàn)缺損中央空洞。ABC對照組實驗組空白對照組圖2術(shù)后不同時間點各組缺損區(qū)X射線檢查結(jié)果Figure2對照組實驗組空白對照組圖2術(shù)后不同時間點各組缺損區(qū)X射線檢查結(jié)果Figure2X-rayfilmofdefectsineachgroupatdifferenttimepointsaftersurgery圖注：術(shù)后12周時，空白對照組缺損區(qū)整體密度增高，略低于周圍骨組織；實驗組、對照組缺損區(qū)密度接近宿主骨，材料與新生組織充分結(jié)合，實驗組骨密度高于對照組。術(shù)后2周術(shù)后4周術(shù)后8周術(shù)后12周BABA圖圖3空白對照組術(shù)后不同時間點的骨缺損區(qū)組織學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，×400)Figure3Histologicalobservationofdefectsintheblankcontrolgroupatdifferenttimepointsaftersurgery(hematoxylin-eosinstaining,×400)圖注：圖中A-D分別為術(shù)后2，4，8，12周。術(shù)后2周，缺損區(qū)中央約4mm范圍內(nèi)為空白區(qū)，邊緣主要為纖維組織，成纖維細(xì)胞豐富，未見成骨；術(shù)后12周，缺損中央可見條索狀、水滴狀的新骨形成，新生骨周圍新生血管形成，大量纖維組織由脂肪組織替代，邊緣新骨形成并延伸至中央。DCDCBADCBADC圖圖4對照組術(shù)后不同時間點的骨缺損區(qū)組織學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，×400)Figure4圖注：圖中A-D分別為術(shù)后2，4，8，12周。術(shù)后2周，缺損區(qū)由材料和纖維組織充填滿，材料之間由纖維組織連接，小部分區(qū)域材料之間可見小梁狀新骨形成，材料顆粒內(nèi)部可見成骨樣反應(yīng)；術(shù)后12周，缺損區(qū)由材料、新生骨組織、纖維組織及少量脂肪組織充填，材料周邊新生骨伸入到材料內(nèi)部連接成片，材料顆粒內(nèi)部近1/2完全被骨組織替代并連接成片，剩余部分成骨樣反應(yīng)，表現(xiàn)為類骨質(zhì)。DDCABCAB圖圖5實驗組術(shù)后不同時間點的骨缺損區(qū)組織學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色，×400)Figure5Histologicalobservationofdefectsinthetestgroupatdifferenttimepointsaftersurgery(hematoxylin-eosinstaining,×400)圖注：圖中A-D分別為術(shù)后2，4，8，12周。術(shù)后2周，缺損區(qū)已由材料和纖維組織充填滿，材料之間由纖維組織和少量條索狀新生骨連接，材料顆粒內(nèi)部可見成骨樣反應(yīng)，少量類骨質(zhì)形成；術(shù)后12周，缺損區(qū)由材料、新生骨、纖維及少量脂肪組織填充，隨著時間的推移，材料內(nèi)部新生骨小梁不斷增加，可見大面積片狀的新生骨組織，骨組織逐漸成熟，新骨輪廓與原來材料一致，周圍類骨質(zhì)生成，部分表現(xiàn)為成骨樣反應(yīng)。表1表1各組術(shù)后不同時間點的新生骨面積(±s，μm2)Table1Areaofnewboneineachgroupatdifferenttimepointsaftersurgery時間對照組實驗組空白對照組2周1149910.0±319032.91967615.6±403917.088904.2±45301.84周2335306.0±58027.04150426.6±1087733.0572511.6±364182.68周3940314.8±332070.74210209.0±156526.01748436.0±352391.612周4363671.0±1300176.04970360.2±680675.81756702.5±156737.1表2表2LSD法多重組間均數(shù)比較Table2Multi-groupmeancomparisonsbyleastsignificantdifferencetest組別(I)組別(J)平均差(I-J)標(biāo)準(zhǔn)差顯著性95%可信區(qū)間下限上限空白對照組對照組-704.0299137.030440-978.7594-429.3004實驗組-1008.0598137.030440-1282.7892-733.3303對照組空白對照組704.0299137.030440429.3004978.7594實驗組-304.0299142.203210.037-589.1301-18.9296實驗組空白對照組組1008.0598137.030440733.33031282.7892對照組304.0299142.203210.03718.9296589.1301PAGE2369ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4P.O.Box1200,Shenyang110004kf23385083@厚度較空白對照組增大；術(shù)后8周，缺損區(qū)由材料、新生骨和纖維組織填充，材料之間可見片狀的新骨形成，分布較廣，骨成熟度增高，中央存在裂隙，周圍纖維組織包繞，材料邊緣可見條索狀、連續(xù)性新骨形成，并伸入到材料內(nèi)，與內(nèi)部新形成骨組織連接，材料顆粒部分已由骨組織完全替代并與周圍新骨連接成片，骨量增多；術(shù)后12周，缺損區(qū)由材料、新生骨、纖維及少量脂肪組織填充，隨著時間的推移，材料內(nèi)部新生骨小梁不斷增加，可見大面積片狀的新生骨組織，骨組織逐漸成熟，中間可見裂隙，材料進(jìn)一步降解，殘留的材料被活躍生長的骨組織包圍并替代，新生骨量明顯增多，多數(shù)為片狀分布，材料顆粒內(nèi)部近2/3完全被骨組織替代并連接成片，新骨輪廓與原來材料一致，周圍類骨質(zhì)生成，部分表現(xiàn)為成骨樣反應(yīng)，見圖5。2.5各組新骨面積計量結(jié)果12周內(nèi)總體新生骨面積選用LSD法做的均數(shù)多重兩兩比較，空白對照組<對照組<實驗組(P均<0.05)，見表1，2。3討論Discussion骨組織工程的3個關(guān)鍵要素為種子細(xì)胞、支架材料、生長因子(骨生長因子、骨誘導(dǎo)因子)。骨生長因子的靶細(xì)胞是一些血管周圍游走的未分化間充質(zhì)細(xì)胞，其具有多向分化的特性，可不可逆的向軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞方向分化，增大成骨性細(xì)胞量，滿足大范圍缺損修復(fù)的需要。支架材料一方面作為信號分子的載體，將其運送到缺損部位，另一方面為新骨生長提供框架。本實驗中支架材料選擇的是，與天然骨成分和分級結(jié)構(gòu)都很接近的濱珊瑚。骨生長因子則可刺激成骨性細(xì)胞的有絲分裂，形成大量新骨，此次實驗采用富含多種生長因子的富血小板血漿[26]。由此可見，骨組織工程的基本出發(fā)點是以“誘導(dǎo)成骨”的方式，而不是單純以“爬行替代”的方式實現(xiàn)骨修復(fù)和再生，實驗由濱珊瑚+富血小板血漿構(gòu)建組織工程骨。實驗選用的珊瑚骨為濱珊瑚，其主要成分為碳酸鈣，占99%，顯微結(jié)構(gòu)為多孔網(wǎng)狀，孔徑100-300μm，孔隙率為70%-90%，從結(jié)構(gòu)和成分兩方面模擬了天然骨，三維框架結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了從納米到微米級別的骨仿生[27-28]。多孔的結(jié)構(gòu)，尤其是互聯(lián)的通道，利于營養(yǎng)的傳遞和細(xì)胞的遷移。對于骨傳導(dǎo)，所需的框架的最小孔徑是80-100μm，孔徑在100-400μm的范圍是成骨細(xì)胞優(yōu)選的，因為它可為細(xì)胞的機械性刺激感受器提供合適的壓力和張力[29]，并取得了良好的實驗效果。初步的體內(nèi)和體外實驗證明，此材料是具有生物活性和生物可降解性的。國內(nèi)有研究將人成骨細(xì)胞與珊瑚骨支架材料復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示成骨細(xì)胞在材料表面黏附生長良好，復(fù)合生長早期細(xì)胞的增殖指數(shù)比對照組有顯著性提高，支架材料上生長的細(xì)胞分裂增殖旺盛[30]。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量不斷增多，材料的三維立體結(jié)構(gòu)為細(xì)胞的生長提供了充足的空間和理想的代謝環(huán)境，同時材料表面的納米級羥基磷灰石結(jié)構(gòu)與天然骨結(jié)構(gòu)相似，也為成骨細(xì)胞的分裂增殖提供了適宜的環(huán)境。但珊瑚人工骨本身無骨誘導(dǎo)性且降解速度過快，易導(dǎo)致骨修復(fù)不完全，如何使其獲得骨誘導(dǎo)性、加快成骨速度是解決這一問題的關(guān)鍵。而富血小板血漿含有多種高濃度的骨生長所需要的生長因子，這些生長因子對組織的修復(fù)和再生起著重要作用，它們在骨再生的各個不同階段通過直接或間接的作用促進(jìn)細(xì)胞的分化與增殖，促進(jìn)新骨再生，而這種促進(jìn)骨再生的作用在血小板處于中等濃縮濃度時作用最強[31]。Kim等[32]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)血小板的濃度在1000000/μL左右時，富血小板血漿具有正面效應(yīng)，能促進(jìn)骨的再生。但單獨使用富血小板血漿時，考慮其半衰期短、易降解或隨血循環(huán)稀釋，不能在局部保持長期有效濃度[33]。因此，要為富血小板血漿選擇一個良好的載體，有研究證實不與任何載體結(jié)合時，富血小板血漿并不能提高骨再生能力[34]。所以此次實驗將富血小板血漿同珊瑚骨復(fù)合，相互取長補短，在影像學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)，3組骨缺損區(qū)域在12周時均能有效成骨，但成骨時間和成骨質(zhì)量有所差異。2周時對照組、試驗組材料區(qū)與宿主骨交界處有少量模糊云霧狀致密影，隱約可見材料影像，而空白對照組缺損區(qū)中央呈透光影，邊界清晰，說明實驗組、對照組成骨起始時間早于空白對照組；4周時缺損邊緣產(chǎn)生絮狀高密度影，空白對照組骨缺損區(qū)僅有下頜骨下緣方向邊緣模糊，說明空白對照組成骨緩慢；12周時實驗組、對照組骨缺損區(qū)密度接近宿主骨，空白對照組缺損區(qū)整體密度增高，但略低于周圍骨組織，說明實驗組、對照組成骨質(zhì)量高于空白對照組。在影像學(xué)觀察中無法判定在實驗組、對照組的成骨差異，但通過計量新骨面積，利用LSD進(jìn)行組間多重檢驗，判定出實驗組成骨效果更好。有大量新骨形成的富血小板血漿復(fù)合材料中的材料降解要比單純材料快，分析其原因可能為：富血小板血漿所釋放的各種因子及各種信號表達(dá)，均對血管內(nèi)皮細(xì)胞有較強的趨化作用，促進(jìn)了新生血管的形成[35-39]，有利于代謝廢物及降解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運及排除[40-41]。所以復(fù)合富血小板血漿珊瑚骨具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，作為框架材料可引導(dǎo)再生骨向缺損內(nèi)生長，促進(jìn)骨缺損修復(fù)。但同時也發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周成骨效果最明顯，再隨著時間推移，成骨速度有所下降，富血小板血漿對骨的再生與修復(fù)的作用有時間依賴性，推測如果是濃度問題，那么如何能更好維持生長因子濃度，保持成骨速度？還是由于成骨細(xì)胞成骨時相導(dǎo)致速度放緩，這個問題值得進(jìn)一步探討。實驗在對珊瑚骨、富血小板血漿研究的基礎(chǔ)上，制備了珊瑚骨+富血小板血漿活性骨修復(fù)材料，解決了以往自體骨移植、免疫排斥帶來的諸多問題，通過動態(tài)觀察二者聯(lián)合的成骨作用，進(jìn)一步驗證應(yīng)用珊瑚骨+富血小板血漿的可行性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：珊瑚骨在體內(nèi)實驗過程中，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，作為框架材料可以引導(dǎo)再生骨向缺損內(nèi)生長，促進(jìn)骨缺損修復(fù)；富血小板血漿有助于誘導(dǎo)并促進(jìn)活性材料，具有成骨誘導(dǎo)活性，可有效促進(jìn)骨缺損愈合，第1個月內(nèi)效果最顯著；由珊瑚骨+富血小板血漿構(gòu)建的組織工程骨，能為成骨、血管化及骨的代謝提供良好的“微環(huán)境”，進(jìn)一步有效促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。作者貢獻(xiàn)：蔣柳宏進(jìn)行實驗設(shè)計，實驗實施為蔣柳宏、董瀅、閆春歌，實驗評估為景向東，資料收集為劉艷輝，蔣柳宏成文，景向東審校。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗方案經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為20131235。實驗動物在氯胺酮麻醉下進(jìn)行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：本刊實行雙盲外審制度，文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：蔣柳宏作為第一作者對于研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4參考文獻(xiàn)ReferencesNilssonES,UristMR,DawsonEG,etal.Bonerepairinducedbybonemorphogeneticproteininulnardefectsindogs.JBoneJointSurg.1986;68B:635-642.BurchardtH.RelatedArticles,Thebiologyofbonegraftrepair.ClinOrthop.1983;(174):28-42.EnnekingWF,EadyJL,BurchardtH.Autogenouscorticalbonegraftsinthereconstructionofsegmentalskeletaldefects.JBoneJointSurgAm.1980;62(7):1039-1058.WengD,HürzelerAitasaloK,LehtinenR.Theinfluenceofafreeperiostealtransplantonbonehealingintheirradiatedtibia.Aradiologicalhistologicalandbiochemicalstudyonrabbits.ScandJPlastReconstrSurg.1985;19(3):237-244.ZhangC,HuYY,CuiFZ,etal.Astudyonatissue-engineeredboneusingrhBMP-2inducedperiostealcellswithaporousnano-hydroxyapatite/collagen/poly(L-lacticacid)scaffold.BiomedMater.2006;1(2):56-62.SchmidtBL,KungL,JonesC,etal.Inducedosteogenesisbyperiostealdistraction.JOralMaxillofacSurg.2002;60(10):1170-1175.SencimenM,AydintugYS,OrtakogluK,etal.Histomorphometricalanalysisofnewboneobtainedbydistractionosteogenesisandosteogenesisbyperiostealdistractioninrabbits.IntJOralMaxillofacSurg.2007;36(3):235-242.GlowackiJ,ShustermanEM,TroulisM,etal.Distractionosteogenesisoftheporcinemandible:histomorphometricevaluationofbone.PlastReconstrSurg.2004;113(2):566-573.SouyrisF,PellequerC.Coral,anewbiomedicalmaterial:experimentalandfirstclinicalinvestigationonMadreporaria.JMaxillfacSurg.1985;13:64-69.鄭有華,任材年,張志光,等.珊瑚人工骨/自體骨髓復(fù)合移植修復(fù)頜骨缺損臨床應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2005,15(8):1227-1230鄭有華,任材年,陳小華,復(fù)合珊瑚骨修復(fù)頜骨實驗性骨缺損[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,1996,12(3):143-145.ChenF,MaoT,TaoK,etal.Bonegraftintheshapeofhumanmandibularcondylereconstructionviaseedingmarrow-derivedosteoblastsintoporouscoralinanudemicemodel.JOralMaxillofacSurg.2002;60:1155-1159.GuilleminG,PatatJL.Theuseofcoralasabonegraftsubstitutes.JBiomedMaterRes.1987;21:557-567.WeibrichG,KleisWK,HafnerG.Growthfactorlevelsintheplatelet-richplasmaproducedby2differentmethods:curasan-typePRPKitversusPCCSPRPsystem.IntJOralMaxillofacImplants.2002;17(2):184-190.CenniE,GranchiD,VanciniM,etal.Plateletreleaseoftransforminggrowthfactor-βandβ-thromboglobulinafterinvitrocontractwithacrylicbonecements.Biomaterials.2002;23(6):1479-1484.CasapN,VeneziaNB,WilenskyA,etal.VEGFfacilitatesperiostealdistraction-inducedosteogenesisinrabbits:amicro-computerizedtomographystudy.TissueEngPartA.2008;14(2):247-253.GruberR,MayerC,BobaczK,etal.Effectsofcartilage-derivedmorphogeneticproteinsandosteogenicprotein-1onosteochondrogenicdifferentiationofperiosteum-derivedcells.Endocrinology.2014;142(5):2087-2094.NakaharaH,GoldbergVM,CaplanAI.Cultured-expandedperiosteal-derivedcellsexibitosteochondrogenicpotentialinporouscalciumphosphateceramicsinvivo.ClinOrthopRelatRes.2013;(276):291-298.BreitbartAS,GrandeDA,KesslerR,etal.Tissueengineeredbonerepairofcalvarialdefectsusingculturedperiostealcells.PlastReconstrSurgy.2014Mar;101(3):567-74.SakataY,UenoT,KagawaT,etal.Osteogenicpotentialofculturedhumanperiosteum-derivedcells-apilotstudyofhumancelltransplantationintoaratcalvarialdefectmodel.JCraniomaxillofacSurg.2014;34(8):461-465.ZhuSJ,ChoiBH,HuhJY,etal.AComparativequalitativehistologicalanalysisoftissue-engineeredboneusingbonemarrowmessenchmalstemcells,alveolarbonecellsandperiostealcells.OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod.2013;101(2):164-169.SchilephakeH.Bonegrowthfactorsinmaxillofacialskeletalreconstruction.IntJOralMaxillofacSurg.2002;31(5):469-484.陳鵬,劉冰.活性納米羥基磷灰石復(fù)合膠原/聚乳酸材料修復(fù)顱骨極限缺損的實驗研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2007,21(11):1191-1195.KarageorgiouV,KaplanD.Porosityof3Dbiomaterialscaffoldsandosteogenesis.Biomaterials.2015;26(27):5474-5479.GauthierO,BoulerJM,AguadoE,etal.Macroporousbiphasiccalciumphosphateceramics:influenceofmacropor