HLA分型技術(shù)-課件

HLA分型技術(shù)HLA分型技術(shù)1Variation>1%atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation,over1,695MHCalleleshavebeenidentifiedababab3559231263481DRDPDQClassII851506276ABCNoofpolymorphismsClassIDatafrom

http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla

July2007PolymorphismintheMHCVariation>1%atasinglegene2Polymorphicresiduesarelocatedintheantigen-bindinggroove—VariationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegroovePolymorphicresiduesarelocat3HLA分型概述方法比較

血清學(xué)分型細(xì)胞學(xué)分型基因分型PCR-RFLPPCR-SSCPPCR-SSOPCR-SSP

應(yīng)用移植配型疾病相關(guān)性研究法醫(yī)學(xué)HLA分型概述方法比較應(yīng)用4PCR-SSP檢測HLA-B27

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握HLA基因分型的原理，學(xué)習(xí)PCR-SSP基因分型方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

編碼HLA的基因具有高度的多態(tài)性，每一個(gè)基因座位上有眾多的復(fù)等位基因，而每一個(gè)等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相應(yīng)的序列特異性引物（sequencespecificprimers，SSP）進(jìn)行擴(kuò)增。通過控制PCR反應(yīng)條件，特異性引物僅擴(kuò)增與其相應(yīng)的等位基因，而不擴(kuò)增其他的等位基因。

PCR-SSP檢測HLA-B27一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?EveryHLAallelehasitsownuniquesequencesEveryHLAallelehasitsownu6Specificsequenceprimer(SSP)isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily

Specificsequenceprimer(SSP)7SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus8SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus9實(shí)驗(yàn)步驟

PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳抽提DNA

實(shí)驗(yàn)步驟PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳抽提DNA10三、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1、血樣：0.2mlEDTA抗凝血2、紅細(xì)胞裂解液3、白細(xì)胞裂解液4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimers三、實(shí)驗(yàn)材料和方法11HLA-B27檢測操作流程一、DNA的提取1、取1mlRBC裂解液入血樣管中混勻，裂解RBC;2、離心4000rpm×1min;3、重復(fù)步驟1-2兩次，最后用棉簽吸干管壁液體；4、取40ul白細(xì)胞裂解液（SDS,ProteinaseK)入上述WBC管中混勻；5、將WBC管于60oC水浴消化20min；6、取出WBC管再于100oC，3-5min，滅活蛋白酶K；7、離心10000rpm×2min。上清即為富含DNA的PCR模板。HLA-B27檢測操作流程一、DNA的提取12二、PCR擴(kuò)增1、吸2ul模板DNA入裝有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蠟油層）；2、將小管置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。（需80min）

×12×23

預(yù)變性：94oC2min

變性：94

oC

20sec

復(fù)性：67

oC30sec

延伸：72

oC30sec

變性：94

oC20sec

復(fù)性：60

oC30sec

延伸：72

oC30sec

HLA-B27擴(kuò)增程序二、PCR擴(kuò)增×12×23預(yù)變性：94oC13三、電泳檢測

吸PCR產(chǎn)物10ul加到2%瓊脂糖凝膠孔內(nèi)；將瓊脂糖凝膠板置電泳槽內(nèi)電泳160V×20min后取出，觀察結(jié)果。三、電泳檢測14四、結(jié)果觀察

四、結(jié)果觀察15SpecificbandscanbeseenwithHLA-B27(+)samples

Specificbandscanbeseenwit16HLA分型技術(shù)HLA分型技術(shù)17Variation>1%atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation,over1,695MHCalleleshavebeenidentifiedababab3559231263481DRDPDQClassII851506276ABCNoofpolymorphismsClassIDatafrom

http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla

July2007PolymorphismintheMHCVariation>1%atasinglegene18Polymorphicresiduesarelocatedintheantigen-bindinggroove—VariationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegroovePolymorphicresiduesarelocat19HLA分型概述方法比較

血清學(xué)分型細(xì)胞學(xué)分型基因分型PCR-RFLPPCR-SSCPPCR-SSOPCR-SSP

應(yīng)用移植配型疾病相關(guān)性研究法醫(yī)學(xué)HLA分型概述方法比較應(yīng)用20PCR-SSP檢測HLA-B27

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握HLA基因分型的原理，學(xué)習(xí)PCR-SSP基因分型方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

編碼HLA的基因具有高度的多態(tài)性，每一個(gè)基因座位上有眾多的復(fù)等位基因，而每一個(gè)等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相應(yīng)的序列特異性引物（sequencespecificprimers，SSP）進(jìn)行擴(kuò)增。通過控制PCR反應(yīng)條件，特異性引物僅擴(kuò)增與其相應(yīng)的等位基因，而不擴(kuò)增其他的等位基因。

PCR-SSP檢測HLA-B27一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1EveryHLAallelehasitsownuniquesequencesEveryHLAallelehasitsownu22Specificsequenceprimer(SSP)isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily

Specificsequenceprimer(SSP)23SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus24SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus25實(shí)驗(yàn)步驟

PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳抽提DNA

實(shí)驗(yàn)步驟PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳抽提DNA26三、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1、血樣：0.2mlEDTA抗凝血2、紅細(xì)胞裂解液3、白細(xì)胞裂解液4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimers三、實(shí)驗(yàn)材料和方法27HLA-B27檢測操作流程一、DNA的提取1、取1mlRBC裂解液入血樣管中混勻，裂解RBC;2、離心4000rpm×1min;3、重復(fù)步驟1-2兩次，最后用棉簽吸干管壁液體；4、取40ul白細(xì)胞裂解液（SDS,ProteinaseK)入上述WBC管中混勻；5、將WBC管于60oC水浴消化20min；6、取出WBC管再于100oC，3-5min，滅活蛋白酶K；7、離心10000rpm×2min。上清即為富含DNA的PCR模板。HLA-B27檢測操作流程一、DNA的提取28二、PCR擴(kuò)增1、吸2ul模板DNA入裝有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蠟油層）；2、將小管置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。（需80min）

×12×23

預(yù)變性：94oC2min

變性：94

oC

20sec

復(fù)性：67

oC30sec

延伸：72

oC30sec

變性：94

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復(fù)性：60

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延伸：72

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