自創(chuàng)基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個(gè)步驟有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________,也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個(gè)以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?請閱讀P9第一和二兩段1、從基因文庫獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列一、目的基因的獲取（一）從基因文庫中直接獲取1.基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見課本P9注意：基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫5.基因文庫的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解5.基因文庫的構(gòu)建方法之基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場所酶結(jié)果DNA雙鏈復(fù)制（堿基互補(bǔ)配對）四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本本原理理PCR反應(yīng)條條件PCR過程PCR的特點(diǎn)點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本本原理理PCR反應(yīng)條條件PCR過程PCR的特點(diǎn)點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束束第2輪開始始PCR的基本本原理理PCR反應(yīng)條條件PCR過程PCR的特點(diǎn)點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本本原理理PCR反應(yīng)條條件PCR過程PCR的特點(diǎn)點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束束思考？？1個(gè)DNA分子進(jìn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,循環(huán)4次，理論上上至少少需要要幾個(gè)個(gè)引物物？2×（2n-1）(n為循環(huán)環(huán)次數(shù)數(shù))（24-1）×2=30（三））人工工合成成已知其其序列列已知其其mRNA的序列列已知其其翻譯譯產(chǎn)物物的氨氨基酸酸序列列基因比比較小小，核核苷酸酸序列列又已已知。。DNA合成儀儀目的基基因的的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的的基因因)反轉(zhuǎn)錄錄合成1）反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄法法：以目的的基因因轉(zhuǎn)錄錄成的的信使使RNA為模板板，反反轉(zhuǎn)錄錄成互互補(bǔ)的的單鏈鏈DNA，然后后在酶酶的作作用下下合成成雙鏈鏈DNA，從而而獲得得所需需的基基因。。蛋白質(zhì)質(zhì)的氨氨基酸酸序列列mRNA的核苷苷酸序序列結(jié)構(gòu)基基因的的核苷苷酸序序列目的基基因推測推測化學(xué)合合成2）根據(jù)據(jù)已知知的氨氨基酸酸序列列合成成DNA法：：人工合合成的的目的的基因因的具具體方方法從基因因文庫庫中獲獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)擴(kuò)增利用化化學(xué)方方法人人工合合成歸納：：獲取取目的的基因因的方方法科學(xué)家家在培培育抗抗蟲棉棉時(shí)，，經(jīng)歷歷了多多次失失敗，，才獲獲得成成功。。起初把把蘇云云金芽芽孢桿桿菌的的抗蟲基基因插入載載體質(zhì)質(zhì)粒中中，然然后導(dǎo)導(dǎo)入棉棉花的的受精精卵中中，結(jié)結(jié)果抗抗蟲基基因在在棉花花體內(nèi)內(nèi)沒有有表達(dá)達(dá)。然后在在插入入抗蟲蟲基因因的質(zhì)質(zhì)粒中中插入入啟動(dòng)子子(抗蟲基基因首首端)，導(dǎo)入入棉花花受精精卵，，長成成的棉棉花植植株還還是沒沒有抗抗蟲能能力。?？茖W(xué)學(xué)家又又在有有啟動(dòng)動(dòng)子、、抗蟲蟲基因因的質(zhì)質(zhì)粒中中插入入終止子子(抗蟲基基因末末端)，導(dǎo)入入棉花花受精精卵，，結(jié)果果成長長的植植株，，有了了抗蟲蟲能力力。資料料:復(fù)制原原點(diǎn)+目的基基因+啟動(dòng)子子+終止子子+標(biāo)記基基因它們各各自有有什么么作用用？步驟二二：基因表表達(dá)載載體的的構(gòu)建建——核心調(diào)節(jié)基基因因操縱基基因因結(jié)構(gòu)基基因RNA聚合酶酶半乳糖糖苷酶酶酶酶

RNA聚合酶啟動(dòng)子子RNA聚合酶酶啟動(dòng)子子：位于基基因首首端的的一段段特殊殊的DNA片斷，，它是是RNA聚合酶酶識別別和結(jié)結(jié)合的的部位位，有有了它它才能能驅(qū)動(dòng)動(dòng)基因因轉(zhuǎn)錄錄出mRNA，最終終獲得得蛋白白質(zhì)。。為什么么要構(gòu)構(gòu)建基基因表表達(dá)載載體呢呢？目的：：所需物物質(zhì)：：使目的的基因因在受受體細(xì)細(xì)胞中中穩(wěn)定定存在在，并并且可可以遺遺傳給給下一一代，，同時(shí)時(shí)使目目的基基因能能夠表表達(dá)和和發(fā)揮揮作用用?；蚬すこ碳技夹g(shù)路路線（二））方法法將目的的基因因?qū)肴胫参锛?xì)細(xì)胞將目的的基因因?qū)肴雱?dòng)物細(xì)細(xì)胞將目的的基因因?qū)肴胛⑸镂锛?xì)胞胞農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化化法基因槍槍法花粉管管通道道法——顯微注注射法法——感受態(tài)態(tài)細(xì)胞胞（1）農(nóng)桿桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法法①特點(diǎn)點(diǎn)：易感染染雙子子葉植植物和和裸子子植物物，對對大多多數(shù)單單子葉葉植物物沒有有感染染能力力②原理理：Ti質(zhì)粒上上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體體細(xì)胞胞，并并整合到受體細(xì)細(xì)胞染染色體體的DNA上。③轉(zhuǎn)化過過程:Ti質(zhì)粒目的基基因構(gòu)建表達(dá)載載體導(dǎo)入植物細(xì)細(xì)胞插入植物細(xì)細(xì)胞染染色體體DNA表達(dá)新性狀狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌基因因槍槍法法又又稱稱微微彈彈轟轟擊擊法法，，是是利用用壓壓縮縮氣氣體體產(chǎn)產(chǎn)生生的的動(dòng)動(dòng)力力，將將包包裹裹在在金金屬屬顆顆粒粒表表面面的的表表達(dá)達(dá)載載體體DNA打入入受受體體細(xì)細(xì)胞胞中中，使使目目的的基基因因與與其其整整合合并并表表達(dá)達(dá)的的方方法法。。（2）基基因因槍槍法法適用用于于單子子葉葉植植物物（3）花花粉粉通通道道法法植物物花花粉粉在在柱柱頭頭上上萌萌發(fā)發(fā)后后，，花花粉粉管管要要穿穿過過花花柱柱直直通通胚胚囊囊。?；ɑǚ鄯酃芄芡ㄍǖ赖婪ǚň途褪鞘窃谠谥仓参镂锸苁芊鄯酆蠛?，，花粉粉形形成成的的花花粉粉管管還還未未愈合合前，剪去去柱頭頭，，然然后后，，滴加加DNA（含含目目的的基基因因）），，使使目目的的基基因因借借助助花花粉粉管管通通道道進(jìn)進(jìn)入入受受體體細(xì)細(xì)胞胞。。適用用于于被子子植植物物胚珠珠花藥藥花絲絲柱頭頭花柱柱子房房壁壁子房房雄蕊蕊雌蕊蕊2.將目目的的基基因因?qū)?dǎo)入入動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞（1）方方法法：：顯顯微微注注射射法法（將將基基因因表表達(dá)達(dá)載載體體提提純純，，用用顯顯微微注射射儀儀注注射射到到受精精卵卵中））思考考：：為為什什么么要要用用受受精精卵卵而而不不用用體體細(xì)細(xì)胞胞？？（2）操操作作程程序序:提純純含含目目的的基基因因表表達(dá)達(dá)載載體體取受受精精卵卵顯微微注注射射移植植到到輸輸卵卵管管或或子子宮宮受精精卵卵發(fā)發(fā)育育新性性狀狀動(dòng)動(dòng)物物常用用法法：Ca2+處理理常用用菌菌：大大腸腸桿桿菌菌微生生物物作作受受體體細(xì)細(xì)胞胞原原因因：：繁殖殖快快、、多多為為單單細(xì)細(xì)胞胞、、遺遺傳傳物物質(zhì)質(zhì)相相對對少少過程程：：Ca2+處理理大大腸腸桿桿菌菌感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞表達(dá)達(dá)載載體體與與感感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞混混合合感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞吸吸收收DNA3.將目目的的基基因因?qū)?dǎo)入入微微生生物物細(xì)細(xì)胞胞思考考：：為為什什么么要要用用Ca2+處理理受受體體細(xì)細(xì)胞胞？？用Ca2＋處理理，，增增加加細(xì)細(xì)菌菌細(xì)胞胞壁壁的通通透透性性受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精精卵卵體細(xì)細(xì)胞胞受精精卵卵細(xì)胞胞/個(gè)體體農(nóng)桿桿菌菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化法法基因因槍槍法法花粉粉管管通通道道法法顯微微注注射技技術(shù)術(shù)用Ca2+處理理成成感感受受態(tài)態(tài)細(xì)細(xì)胞胞采用用基基因因工工程程的的方方法法培培育育抗抗蟲蟲棉棉，，下下列列導(dǎo)導(dǎo)入入目目的的基基因因的的作作法法正正確確的的是是（（））A.將毒毒素素蛋蛋白白注注射射到到受受精精卵卵中中B.將編編碼碼毒毒素素蛋蛋白白的的DNA序列列，，與與質(zhì)質(zhì)粒粒重重組組，，導(dǎo)導(dǎo)入入細(xì)細(xì)菌菌，，用用該該細(xì)細(xì)菌菌感感染染棉棉的的體體細(xì)細(xì)胞胞，，再再進(jìn)進(jìn)行行組組織織培培養(yǎng)養(yǎng)C.將編編碼碼毒毒素素蛋蛋白白的的DNA序列列，，與與質(zhì)質(zhì)粒粒重重組組，，注注射射到到棉棉的的子子房房并并進(jìn)進(jìn)入入受受精精卵卵D.將編編碼碼毒毒素素蛋蛋白白的的DNA序列列，，注注射射到到棉棉受受精精卵卵中中BC四、、目目的的基基因因的的檢檢測測與與鑒鑒定定檢測測:是否否插插入入目目的的基基因因是否否轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄是否翻譯譯鑒定:分子水平平鑒定個(gè)體生物物學(xué)水平平鑒定1、檢測轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生生物染色色體的DNA上是否插插入了目目的基因因①首先先取出轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交交（2）過程:②將含目的基因因的DNA片段用放放射性同同位素等等作標(biāo)記記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生生物的基基因組雜交,若顯示出出雜交帶,表明染色色體已插插入染色色體DNA中。（一）檢檢測基因探針針：是一段帶帶有檢測測標(biāo)記，，且序列列已知的的，與目目的基因因互補(bǔ)的的核酸序序列?；蛱结樶樛ㄟ^分子雜交交與目的基基因結(jié)合合，產(chǎn)生生雜交信信號，能能從浩翰翰的基因因組中把把目的基基因顯示示出來。。DNA分子雜交交示意圖圖采用一定定的技術(shù)術(shù)手段，，將兩種種生物的的DNA分子的單單鏈放在在一起，，如果這這兩個(gè)單單鏈具有有互補(bǔ)的的堿基序序列，那那么，互互補(bǔ)的堿堿基序列列就會結(jié)結(jié)合在一一起，形形成雜合雙鏈鏈區(qū)；在沒有有互補(bǔ)堿堿基序列列的部位位，仍然然是兩條游離離的單鏈鏈。（二）鑒鑒定（個(gè)個(gè)體生物物學(xué)水平平）2、檢測目目的基因因是否轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄出了了mRNA3、檢測目目的基因因是否翻翻譯成蛋蛋白質(zhì)抗蟲鑒定定、抗病病鑒定、、活性鑒鑒定等①方法:分子雜雜交交方法:抗原-抗體雜交交②過程:用上述探探針和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜雜交帶,表明目的的基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄出了了mRNA。提?。?）檢測目目的基因因是