高中生物競(jìng)賽 蛋白組學(xué) 第二章 第一節(jié)實(shí)驗(yàn)原理部分課件

1第二章:蛋白質(zhì)的電泳分離技術(shù)蛋白組學(xué)課程之第一節(jié)實(shí)驗(yàn)原理部分23GenomeDNAWhatcouldhappen

TranscriptomemRNAWhatmightbehappening

ProteomeProteinWhatisactuallyhappening分子生物學(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個(gè)別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。蛋白質(zhì)組學(xué)4圖像分析圖像獲取蛋白質(zhì)斑點(diǎn)切取基于凝膠的工作流程SDS蛋白分離及鑒定的工作流程樣品制備等電聚焦MALDI點(diǎn)靶MS鑒定52.1蛋白樣品的提取2.2雙向凝膠電泳技術(shù)的原理2.3等電聚焦的原理2.4SDS的原理2.5樣品分離的策略2.雙向凝膠電泳技術(shù)62.1蛋白樣品的提取（植物）TCA丙酮的方法酚結(jié)合乙酸銨的方法78樣品的制備原則應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。9高鹽沉淀如，硫酸銨沉淀法。一般過程：在含有EDTA的緩沖液中（>50mM）處理蛋白質(zhì)，最終蛋白濃度大于1mg/ml。慢慢地將硫酸銨加至需要的百分飽度，攪拌10-30min，離心收集蛋白質(zhì)。

缺點(diǎn)：不能獲得所有蛋白質(zhì)。殘留的硫酸銨會(huì)影響等電聚焦。有機(jī)溶劑沉淀如，TCA、丙酮、TCA和丙酮的混合物一般過程：樣品懸浮于含0.07%2-巰基乙醇的10%TCA溶液中。-20℃沉淀蛋白質(zhì)至少45min，離心收集蛋白沉淀，用含有0.07%巰基乙醇的預(yù)冷丙酮溶液清洗。冷凍干燥除去殘留的丙酮。缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)很難再溶。長(zhǎng)時(shí)間暴露于低pH值溶液中蛋白質(zhì)會(huì)被降解和修飾。高鹽與有機(jī)溶劑結(jié)合（適合處理含有大量干擾物質(zhì)的植物樣品）如，乙酸銨的甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)并且用飽和酚抽提

一般過程：樣品中的蛋白被抽提進(jìn)入酚中，酚相用含有0.1M的乙酸銨的甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)，沉淀用含有乙酸銨的甲醇溶液清洗后用丙酮清洗，最后將殘留的丙酮蒸發(fā)掉。缺點(diǎn)：復(fù)雜且費(fèi)時(shí)。蛋白沉淀方法10變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。增加樣品溶解性的手段11蛋白質(zhì)定量（Bradford方法）考馬斯亮藍(lán)G-250在不同的酸堿條件下，可呈現(xiàn)不同的顏色。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成茶色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng)化合物在465～595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系，因此可檢測(cè)595nm的光吸收值的大小計(jì)算蛋白的含量。12第一向:

根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分離第二向:

SDS聚丙烯酰胺電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量分離一塊雙向電泳膠上可以分離幾千個(gè)蛋白點(diǎn)2.2雙向凝膠電泳的原理13等電聚焦技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）的不同而將他們分離的一種電泳技術(shù)。蛋白質(zhì)分子的帶電量取決于組成蛋白質(zhì)的氨基酸的側(cè)鏈及氨基端和羧基端所有電荷總合。圖1蛋白質(zhì)所在pH環(huán)境與帶電的關(guān)系2.3等電聚焦電泳142.3.1等電聚焦電泳圖2蛋白質(zhì)的凈電荷與相對(duì)環(huán)境pH值關(guān)系的曲線圖15丙烯酰胺緩沖液:Immobilinebuffer,化學(xué)上確定的丙烯酰胺衍生物,共同結(jié)構(gòu):CH2=CH-CO-NH-R,R：弱酸性或弱堿性緩沖基團(tuán)2.3.2固相pH梯度（ImmobilizedpHgradients,IPG）兩種形式：一種是含丙稀酰胺緩沖液的相對(duì)酸性的混合物，另一種含相對(duì)堿性緩沖液的混合物。不同濃度配比的酸性和堿性緩沖液決定pH梯度的范圍。16采用ImmobilineDryStrip凝膠進(jìn)行第一向電泳分離。2.3.3ImmobilineDryStrip凝膠172.3.3ImmobilineDryStrip凝膠18linear(L)nonlinear(NL)2.3.3ImmobilineDryStrip凝膠19fromProf.AngelikaG?rg,TechnicalUniversityMunich小鼠肝臟蛋白的分離：IPG3-10linear(L)nonlinear(NL)標(biāo)準(zhǔn)型單根膠條槽采用氧化鋁陶瓷質(zhì)地的膠條槽、可以保證充分的散熱和電場(chǎng)分離效果；膠條槽平整度好，長(zhǎng)期使用不會(huì)變形，確保膠條泡漲厚度均勻。Manifold多功能膠條盤

適合高通量7-24cm任意長(zhǎng)度的IPG膠條的等電聚焦和后續(xù)的平衡反應(yīng)；膠條槽表面有疏水涂層，有效防止蛋白黏附到膠條槽內(nèi)壁上，避免樣品交叉污染。2.3.4膠條槽的選擇21IPG膠條的溶漲溶漲的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的IEF。蛋白質(zhì)的上樣量待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：防止高豐度蛋白遮蓋低豐度蛋白。樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。一向等電聚焦22IPG中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長(zhǎng)，預(yù)試驗(yàn)確定。聚焦時(shí)間的優(yōu)化理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長(zhǎng)度通過經(jīng)驗(yàn)來確定。一向等電聚焦232.3.5EttanIPGphor3第一向等電聚焦系統(tǒng)內(nèi)置電源

電壓：0-10000V,電流：0-2.4

mA,功率：最大12W同時(shí)運(yùn)行1－12根IPG膠條242.3.6IPG膠條的平衡在IPG膠條等電聚焦之后，需要進(jìn)行IPG膠條的平衡，使蛋白質(zhì)被SDS充分飽和。試劑目的IPG膠條平衡SDSDTT碘乙酰胺與蛋白質(zhì)結(jié)合破壞二硫鍵除去多余的DTT，烷基化巰基基團(tuán)第一步，15min，緩沖液中含DTT第二步，15min，緩沖液中含碘乙酰胺（不含DTT）25Tris-HCl（pH8.8）→使IPG膠條pH值維持在適合電泳的范圍內(nèi)。尿素（6M）→增加緩沖溶液的粘滯性來減小電內(nèi)滲效應(yīng)。電內(nèi)滲是由于電場(chǎng)中在IPG膠條上存在固定電荷，干擾蛋白質(zhì)從IPG膠條向第二向凝膠移動(dòng)。甘油（30%）→與尿素一同減少電內(nèi)滲并且促進(jìn)蛋白質(zhì)由IPG膠條向第二向凝膠移動(dòng)。DTT→使變性的非烷基化的蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)。SDS→使蛋白質(zhì)變性并且形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS數(shù)量以及由此而產(chǎn)生額外的負(fù)電荷直接與蛋白質(zhì)的質(zhì)量成比例。因此，蛋白質(zhì)電泳將蛋白質(zhì)通過含有SDS的膠篩，依靠蛋白質(zhì)的分子量將蛋白分離。碘乙酰胺→在電泳過程中蛋白的氧化會(huì)產(chǎn)生拖尾。碘乙酰胺能使蛋白質(zhì)巰基烷基化，防止它們?cè)陔娪具^程中重新氧化。并能使殘留的DTT烷基化，從而防止產(chǎn)生點(diǎn)拖尾和其它銀染雜質(zhì)。利用碘乙酰胺進(jìn)行平衡也可以減少不希望的半胱胺酸殘留物的反應(yīng)（當(dāng)采用質(zhì)譜來研究分離的蛋白時(shí)）。溴酚藍(lán)→示蹤染料，用來指示電泳。平衡緩沖液成分作用262.4SDS

瓊脂糖覆蓋密封放置IPGstrip272.4SDS的原理

SDS是一種陰離子表面活性劑，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。

SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，如β巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。這樣，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀，近似于長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小成正比的變化。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的相關(guān)。28聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠的主要參數(shù)T=(Acr的質(zhì)量＋Bis的質(zhì)量)/溶劑的終體積C=Bis的質(zhì)量/(Acr的質(zhì)量＋Bis的質(zhì)量)聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑隨總濃度T％的增加而減小，隨交聯(lián)度C％的增加而減小。PAGE實(shí)驗(yàn)原理29連續(xù)電泳系統(tǒng)與不連續(xù)電泳系統(tǒng)連續(xù)電泳系統(tǒng)中僅有分離膠，緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)不連續(xù)電泳系統(tǒng)中有分離膠和濃縮膠，由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中流動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度和分辨率均較前者佳。PAGE實(shí)驗(yàn)原理30EttanDALTsix第二向電泳系統(tǒng)31EttanDALTtwelve

第二向電泳系統(tǒng)32放射自顯影、熒光成像－低到200fg蛋白銀染－低于1ng蛋白。銀染方法比較復(fù)雜，步驟較多，使用試劑也較多，而且試劑純度非常重要。最好采用專用的試劑盒。 在敏化步驟中不加戊二醛，以及在硝酸銀溶液中不加甲醛，雖然靈敏度有所降低，但更能與質(zhì)譜分析兼容?？捡R斯亮藍(lán)－染色靈敏度比銀染低50到100倍方法簡(jiǎn)單，比銀染定量準(zhǔn)確?？捡R斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)按化學(xué)計(jì)量結(jié)合，當(dāng)有關(guān)的蛋白質(zhì)要用密度計(jì)來測(cè)量時(shí)，這種方法比較適合。Hoefer自動(dòng)化凝膠染色儀－低于1ng的蛋白檢測(cè)能自動(dòng)完成多步的染色過程，操作非常簡(jiǎn)單并能增加染色的重復(fù)性。鋅-咪唑負(fù)染法－檢測(cè)限是15ng與質(zhì)譜兼容性很好，但定量不準(zhǔn)確。SYPRO?染料的熒光標(biāo)記和熒光染色－靈敏度介于膠體考馬斯亮藍(lán)和改良的銀染試劑盒之間需要熒光掃描儀，但是方法與質(zhì)譜兼容很好，定量動(dòng)力學(xué)范圍寬。凝膠染色33問題1:對(duì)于一個(gè)新的組織樣品，該如何進(jìn)行IPG膠條選擇？問題2:對(duì)于低豐度的蛋白，該如何進(jìn)行樣品分離？2.5樣品分離的策略34問題1:對(duì)于一個(gè)新的組織樣品，該如何進(jìn)行IPG膠條選擇？

蛋白質(zhì)主要分布在兩個(gè)區(qū)域，一部分為pI為4-6.5的蛋白質(zhì)，另一部分為pI在8-12的蛋白質(zhì)。大多數(shù)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量小于100kDa。采用寬范圍的IPG膠條進(jìn)行分離，然后進(jìn)一步用較窄的IPG膠條進(jìn)行分離。pI311A舉例：羽衣甘藍(lán)柱頭組織蛋白質(zhì)的二向電泳分離pI4B735pH3-11NLpH3-5.6NL

pH5.3-6.5pH7-11NLpH6.2-7.5舉例:小鼠肝臟蛋白的電泳分離36問題2:對(duì)于低豐度的蛋白，該如何進(jìn)行樣品分離？舉例：在血清中，白蛋白占蛋白質(zhì)總量的60%，免疫球蛋白占總蛋白質(zhì)總量的15%，白蛋白的大斑點(diǎn)使得2-DE不能夠展示出其他蛋白質(zhì)，同樣，在MS分析中，高濃度的白蛋白肽段也會(huì)掩飾其他肽段，使之無法得到檢測(cè)。去除高豐度的蛋白，如白蛋白和免疫球蛋白。（白蛋白可以通過免疫吸附去除，免疫球蛋白可以通過固定化的金黃色葡萄球菌蛋白A去除）去除高豐度蛋白后，可以上樣更多感興趣的蛋白，從而檢測(cè)到之前無法檢測(cè)的蛋白質(zhì)（低豐度）。37

參考書：

蛋白質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南，李玉花等編著，高等教育出版社，2010.蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)（第二版），郭堯君編著,科學(xué)出版社，2005.Guidetoproteinpurification(SecondEdition),RichardR.Burgess,科學(xué)出版社，2011.蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)純化手冊(cè)，茹炳根主譯，化學(xué)工業(yè)出版社，2008.蛋白質(zhì)組學(xué)研究-概念、技術(shù)及應(yīng)用，張麗華等譯（原書第二版），科學(xué)出版社，2010.38實(shí)驗(yàn)篇39實(shí)驗(yàn)儀器－電泳設(shè)備IPGphorTMisoelectricfocusingsystemHoeferSE600(standardvertical)EPS601PowerSupply40IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。實(shí)驗(yàn)儀器－膠條槽、干膠條41實(shí)驗(yàn)儀器-其它設(shè)備紫外分光光度計(jì)離心機(jī)脫色搖床42蛋白質(zhì)一向電泳試劑提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。平衡緩沖液：1.5MTris-Cl6.7ml(pH8.8)，尿素72.07g，87％的甘油69ml，SDS4g，溴酚藍(lán)少許。溶漲液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚藍(lán)少許溶于無菌水中，總體積為25ml。使用之前再加入IPG緩沖液0.5ul/100ul，DTT1.5ul/100ul。實(shí)驗(yàn)試劑43蛋白質(zhì)二向電泳試劑

丙烯酰胺單體儲(chǔ)液：丙烯酰胺60g，甲叉雙丙烯酰胺1.6g，溶于無菌水中，總體積200ml

分離膠緩沖液：Trisbase181.5g，溶于750ml無菌水中，調(diào)PH8.8，總體積1000ml10％SDS：5gSDS溶于無菌水中，總體積50ml10％過硫酸銨：0.1g溶于無菌水中，總體積1mlSDS電泳緩沖液：Tris-base15.1g，甘氨酸72.1g，SDS5g，溶于無菌水中，總體積5000ml

封膠溶液：SDS電泳緩沖液100ml，瓊脂糖0.5g，溴酚藍(lán)少許實(shí)驗(yàn)試劑44蛋白質(zhì)定量（Bradford方法）試劑

Bradford儲(chǔ)存液：100ml95％乙醇；200ml88％磷酸；350mgServaG藍(lán)，室溫下長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。

Bradford工作液：425ml雙蒸水；15ml95％乙醇；30ml88％磷酸；30mlBradford儲(chǔ)存液濾紙過濾，棕色瓶中室溫保存，可保存數(shù)周，但在使用前需要過濾。

1mg/ml牛血清蛋白（BSA）實(shí)驗(yàn)試劑45蛋白質(zhì)樣品制備蛋白質(zhì)定量（Bradford法）蛋白質(zhì)分離獲得感興趣蛋白質(zhì)組分雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程樣品的制備一向等電聚焦一向等電聚焦到二向電泳的平衡SDS電泳凝膠的染色凝膠的圖像處理分析46（1）取植物材料放入預(yù)冷研缽后，加入液氮，充分研磨至粉末狀。（2）于1.5mL離心管中加入3倍體積的提取緩沖液，將粉末加入到離心管中，混勻后在-20℃的條件下過夜。（3）4℃，40000g，離心1hr，棄上清。(4）使沉淀重懸浮于等體積的預(yù)冷丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）中，4℃，40000g，離心1hr（可重復(fù)一次）。（5）真空干燥沉淀。（6）將沉淀用最小體積的裂解液充分溶解，其間可漩渦振蕩助溶。（7）15℃，40000g，離心1hr，上清即為獲得的蛋白質(zhì)樣品，可分裝放入-80℃?zhèn)溆?，臨時(shí)保存可在4℃。（8）Brandford法蛋白定量。實(shí)驗(yàn)步驟－蛋白質(zhì)樣品制備471．上樣：一般采取加樣品溶漲法，取大約30-60μg的蛋白與溶脹液混合，總體積為250μL。蛋白與溶脹液混合物加入膠條槽從酸性端去掉膠條的保護(hù)膜放置膠條：膠條酸性端（尖端）朝膠條槽陽極（尖端）方向放入膠條槽，慢慢下壓，最后放下膠條堿性端（平端），使溶液浸濕整個(gè)膠條，避免生成氣泡。在膠條上覆蓋適量的覆蓋油，蓋上蓋子。將膠條槽平放于IPGphor儀器上，與水平方向垂直，如是多個(gè)膠條槽注意相互平行實(shí)驗(yàn)步驟－一向等電聚焦482．第一向等電聚焦設(shè)置IPGphor儀器的運(yùn)行參數(shù)。工作溫度20℃，每膠條最大電流50μA，以下為電壓設(shè)定情況：電壓（V）升壓模式電泳時(shí)間30Step-n-hold12hr200Step-n-hold1hr500Step-n-hold1hr1000Step-n-hold1hr8000Gradient3hr3．一向到二向膠條的平衡將膠條放入10mL平衡緩沖液Ⅰ中（含1%DTT）封口，在搖床上振蕩15min。將膠條取出放入10mL平衡緩沖液Ⅱ中（含2.5%碘乙酰胺）封口，在搖床上振蕩15min。去離子水潤(rùn)洗膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾min，以去除多余的液體。實(shí)驗(yàn)步驟一向等電聚焦4950514．二向電泳（SDS）（1）灌膠模具的安裝：按儀器說明書裝好灌膠模具。（2）凝膠濃度確定：根據(jù)預(yù)分離蛋白質(zhì)分子量范圍確定需配置的凝膠濃度，主要指分離膠濃度（表4-3-1）。一般實(shí)驗(yàn)中多采用濃度10％或12.5%的分離膠及濃度為5％的濃縮膠，制膠參照下表。表分離膠和濃縮膠的配制藥品濃度10％12.5%5％單體儲(chǔ)液13.3mL16.7mL1.064mL分離膠緩沖液10mL10mL－濃縮膠緩沖液－－2mL10×SDS0.4mL0.4mL0.4mL無菌水16.1mL12.8mL4.8mL10％過硫酸銨200μL200μL80μLTEMED13.3μL13.3μL40μL實(shí)驗(yàn)步驟－二向SDS5253（3）灌注分離膠：按配比配制分離膠，配制完成后即可加入到制作好的制膠模具中，該過程需均勻注入，防止產(chǎn)生氣泡，同時(shí)動(dòng)作要迅速。灌注一定量的分離膠后迅速注入水覆蓋在凝膠溶液上層，將“三明治”充滿。（4）分離膠凝結(jié)后會(huì)形成清晰的膠平面，此時(shí)可參照濃縮膠配方配制濃縮膠。（5）灌注濃縮膠：倒掉覆蓋液，注入濃縮膠。（6）放入平衡好的膠條，并用瓊脂糖封頂。實(shí)驗(yàn)步驟－二向SDS54（7）將固定制膠模具與底座的凸輪取下，用其將上層電