乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法課件

乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法1一、幾個(gè)相關(guān)問題簡介一、幾個(gè)相關(guān)問題簡介2什么是HBVcccDNA?

即共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并建立感染狀態(tài)，病毒松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）進(jìn)入細(xì)胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓?fù)涿傅取靶迯?fù)”形成的、結(jié)構(gòu)完整的、超螺旋雙鏈DNA分子。什么是HBVcccDNA?即共價(jià)閉合環(huán)狀DNA3乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖4乙型肝炎病毒的復(fù)制過程乙型肝炎病毒的復(fù)制過程5我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBVcccDNA?cccDNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，成為乙肝病毒的復(fù)制“池”目前尚沒有可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并能夠清除cccDNA

的藥物，這也是現(xiàn)有抗病毒藥物治療效果不佳和治療后容易復(fù)發(fā)的原因之一肝臟以外器官組織細(xì)胞可能存在cccDNA，成為肝臟移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的來源還沒有穩(wěn)定、可靠、敏感的cccDNA檢測試劑盒問世我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBVcccDNA?cccDNA存在于6為什么沒有cccDNA檢測試劑盒問世?·研究和開發(fā)該檢測技術(shù)的時(shí)間不長·檢測技術(shù)上的難度較大·前期研究主要集中于細(xì)胞模型和動(dòng)物肝臟模，不能滿足臨床檢驗(yàn)的需求·現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高，檢測低限104copy/ml左右·分研究機(jī)構(gòu)和學(xué)者對檢測技術(shù)的特異性認(rèn)識不足，存在缺陷為什么沒有cccDNA檢測試劑盒問世?·研究和開發(fā)該檢測技術(shù)7·多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、

rcDNA、ssDNA、整合的HBVDNA），必須有效地分離cccDNA和其他類型的病毒DNA·如何進(jìn)一步解決特異性的問題？·如何解決靈敏度不高的問題（細(xì)胞內(nèi)cccDNA

含量的較低），血清中含量？·如何簡化檢測步驟？建立cccDNA檢測技術(shù)必須克服的難點(diǎn)·多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、建立ccc8cccDNArcDNA核酸一級結(jié)構(gòu)完整的雙鏈兩條鏈均不完整核酸空間結(jié)構(gòu)閉合環(huán)狀，超螺旋松弛環(huán)狀，非超螺旋是否與蛋白質(zhì)結(jié)合不結(jié)合共價(jià)結(jié)合對某些核酸酶抗性強(qiáng)，不容易被降解弱，容易被降解分離cccDNA和rcDNA的分子基礎(chǔ)分離cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差異cccDNArcDNA核酸一級結(jié)構(gòu)完整的雙鏈兩條鏈均不完整核9二、HBVcccDNA檢測技術(shù)二、HBVcccDNA檢測技術(shù)101.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的11現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介選擇性PCR(普通PCR12設(shè)計(jì)一對特殊引物：跨雙缺口引物正義引物P1：與負(fù)鏈互補(bǔ)結(jié)合，位于正鏈缺口上游反義引物P2：與正鏈互補(bǔ)結(jié)合，位于負(fù)鏈缺口下游目的：rcDNA不被擴(kuò)增1.選擇性PCR設(shè)計(jì)一對特殊引物：跨雙缺口引物1.選擇性PCR13選擇性PCR：rcDNA不被擴(kuò)增選擇性PCR：rcDNA不被擴(kuò)增14選擇性PCR：cccDNA能被擴(kuò)增選擇性PCR：cccDNA能被擴(kuò)增15PCR產(chǎn)物自身退火（selfannealing）“選擇性”PCR：并非萬無一失PCR產(chǎn)物自身退火（selfannealing）“選擇性16rcDNA被大量擴(kuò)增，陽性結(jié)果不可靠，定量結(jié)果也不可靠

HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）

WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)Kock等：反應(yīng)管中rcDNA含量不能超過105copyHepatology

1996;23:405-413

血清HBVrcDNA超過108copy/ml，進(jìn)行熒光PCR可能會(huì)出現(xiàn)檢測結(jié)果假陽性“選擇性”PCR：并非萬無一失rcDNA被大量擴(kuò)增，陽性結(jié)果不可靠，定量結(jié)果也不可17

與定性法比較增加了一個(gè)熒光探針，探針位于擴(kuò)增片段區(qū)（負(fù)鏈缺口下游），與cccDNA的負(fù)鏈互補(bǔ)。選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA與定性法比較增加了一個(gè)熒光探針，探針位于擴(kuò)增片段區(qū)（18rcDNA不能被擴(kuò)增無熒光信號EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被擴(kuò)增檢測到熒光信號選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNArcDNA不能被擴(kuò)增EcoRI5‘+P1P23219實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理20實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理21實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理22

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy

相關(guān)指數(shù)：R2=0.995

靈敏度至少可以達(dá)到103copy/ml結(jié)果：選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程YCt=42.0827-3.5554logX23·同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA

非特異性擴(kuò)增的問題·由于靈敏度較普通PCR高，假陽性率比普通PCR更高缺陷：選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA·同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA缺陷：選擇性實(shí)時(shí)24質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品107copy/ml3.5×108copy/ml攜帶者血清質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品105copy/ml105~107copy/ml攜帶者血清選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品107copy/ml3.5×108copy/ml攜25解決方案

特異性抽提分離cccDNA與其它形式的病毒DNA

采用沉淀法或質(zhì)粒抽提試劑盒抽提法酶切純化cccDNA

采用綠豆核酸酶或ATP依賴的plasmid-safeDNA酶選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA解決方案特異性抽提分離cccDNA與其它形式的病毒DNA選261.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的272.侵入者探針法(Invaderassay)兩個(gè)體系：兩種特殊的探針：invaderprobe和primaryprobe，后者含與待測模板無關(guān)的5’側(cè)翼的堿基片段。熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)：被核酸內(nèi)切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特異地切割5’側(cè)翼堿基片段作為第二個(gè)invader，與熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒（FRETC）結(jié)合，裂解酶切割FRETC上含有熒光基團(tuán)的短臂，發(fā)出熒光信號。特點(diǎn)：一個(gè)模板可以重復(fù)使用，每“結(jié)合—裂解—結(jié)合—裂解”一次為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次產(chǎn)生一個(gè)熒光信號，呈線性信號放大2.侵入者探針法(Invaderassay)兩個(gè)體系：28乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法課件29乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法課件30侵入者探針法定量檢測cccDNA的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：線性信號放大，特異性比熒光

PCR法強(qiáng)缺點(diǎn)：靈敏度低：104copy/ml侵入者探針法定量檢測cccDNA的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：線性信號放大，311.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的323.嵌合引物熒光PCR法Shao,etal.JVirolMethods2003；

112：45-52+PNN：與HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNA3.嵌合引物熒光PCR法Shao,etal.JVi33PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物熒光PCR法PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物熒光PCR法34

嵌合引物熒光PCR的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：克服了熒光PCR法的部分缺陷，靈敏度比侵入法提高

缺點(diǎn)：仍不能完全避免待測標(biāo)本中存在的

rcDNA被非特異性擴(kuò)增嵌合引物熒光PCR的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：克服了熒光PCR法的部35

無論是選擇性熒光PCR，還是侵入者探針法或嵌合引物熒光PCR，本身都不能解決在高rcDNA背景條件下的假陽性問題，必須結(jié)合抽提分離、酶切純化等步驟，以提高特異性。無論是選擇性熒光PCR，還是侵入者探針法或嵌合引物熒36三、影響cccDNA池的因素三、影響cccDNA池的因素371.cccDNA池的自身恒定cccDNA池：感染肝細(xì)胞核內(nèi)HBVcccDNA的含量在無外來干擾的情況下保持恒定(5－50copy/cell)病毒自身調(diào)節(jié)：關(guān)于病毒的進(jìn)化關(guān)于病毒的“思維”病毒自身的調(diào)節(jié)外來壓力：打破病毒含量自身恒定的結(jié)果1.cccDNA池的自身恒定cccDNA池：感染肝細(xì)胞核382.抗病毒藥物對cccDNA的影響現(xiàn)有抗病毒藥物，包括干擾素和各種核苷類似物，可以一過性地減少cccDNA，但均不能清除cccDNA細(xì)胞核內(nèi)cccDNA含量的相對穩(wěn)定性，決定了長療程抗病毒治療的必要性2.抗病毒藥物對cccDNA的影響現(xiàn)有抗病毒藥物，包括干擾素393.肝外組織也是cccDNA的儲(chǔ)存池？·肝外組織細(xì)胞中HBV標(biāo)志的存在情況：腎、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃腸黏膜、皮膚、睪丸、前列腺、唾液腺等組織或細(xì)胞中均檢測到HBV的標(biāo)志物·HBV吸附？暫居？建立感染狀態(tài)？依據(jù)：從上述組織細(xì)胞中檢測到cccDNA，但必須解決檢測技術(shù)問題3.肝外組織也是cccDNA的儲(chǔ)存池？·肝外組織細(xì)胞中HBV40(2)關(guān)于血清中是否存在cccDNA的問題·“血清中rcDNA含量越高，cccDNA陽性率越高和含量越高”的現(xiàn)象，使我們對方法學(xué)提出質(zhì)疑·肝衰竭的病人在一定病期有可能大量釋放

cccDNA入血·細(xì)胞壞死后，cccDNA釋放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少時(shí)間？(2)關(guān)于血清中是否存在cccDNA的問題·“血清中rcD41乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法42一、幾個(gè)相關(guān)問題簡介一、幾個(gè)相關(guān)問題簡介43什么是HBVcccDNA?

即共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并建立感染狀態(tài)，病毒松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）進(jìn)入細(xì)胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓?fù)涿傅取靶迯?fù)”形成的、結(jié)構(gòu)完整的、超螺旋雙鏈DNA分子。什么是HBVcccDNA?即共價(jià)閉合環(huán)狀DNA44乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖45乙型肝炎病毒的復(fù)制過程乙型肝炎病毒的復(fù)制過程46我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBVcccDNA?cccDNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，成為乙肝病毒的復(fù)制“池”目前尚沒有可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并能夠清除cccDNA

的藥物，這也是現(xiàn)有抗病毒藥物治療效果不佳和治療后容易復(fù)發(fā)的原因之一肝臟以外器官組織細(xì)胞可能存在cccDNA，成為肝臟移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的來源還沒有穩(wěn)定、可靠、敏感的cccDNA檢測試劑盒問世我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBVcccDNA?cccDNA存在于47為什么沒有cccDNA檢測試劑盒問世?·研究和開發(fā)該檢測技術(shù)的時(shí)間不長·檢測技術(shù)上的難度較大·前期研究主要集中于細(xì)胞模型和動(dòng)物肝臟模，不能滿足臨床檢驗(yàn)的需求·現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高，檢測低限104copy/ml左右·分研究機(jī)構(gòu)和學(xué)者對檢測技術(shù)的特異性認(rèn)識不足，存在缺陷為什么沒有cccDNA檢測試劑盒問世?·研究和開發(fā)該檢測技術(shù)48·多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、

rcDNA、ssDNA、整合的HBVDNA），必須有效地分離cccDNA和其他類型的病毒DNA·如何進(jìn)一步解決特異性的問題？·如何解決靈敏度不高的問題（細(xì)胞內(nèi)cccDNA

含量的較低），血清中含量？·如何簡化檢測步驟？建立cccDNA檢測技術(shù)必須克服的難點(diǎn)·多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、建立ccc49cccDNArcDNA核酸一級結(jié)構(gòu)完整的雙鏈兩條鏈均不完整核酸空間結(jié)構(gòu)閉合環(huán)狀，超螺旋松弛環(huán)狀，非超螺旋是否與蛋白質(zhì)結(jié)合不結(jié)合共價(jià)結(jié)合對某些核酸酶抗性強(qiáng)，不容易被降解弱，容易被降解分離cccDNA和rcDNA的分子基礎(chǔ)分離cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差異cccDNArcDNA核酸一級結(jié)構(gòu)完整的雙鏈兩條鏈均不完整核50二、HBVcccDNA檢測技術(shù)二、HBVcccDNA檢測技術(shù)511.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的52現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介選擇性PCR(普通PCR53設(shè)計(jì)一對特殊引物：跨雙缺口引物正義引物P1：與負(fù)鏈互補(bǔ)結(jié)合，位于正鏈缺口上游反義引物P2：與正鏈互補(bǔ)結(jié)合，位于負(fù)鏈缺口下游目的：rcDNA不被擴(kuò)增1.選擇性PCR設(shè)計(jì)一對特殊引物：跨雙缺口引物1.選擇性PCR54選擇性PCR：rcDNA不被擴(kuò)增選擇性PCR：rcDNA不被擴(kuò)增55選擇性PCR：cccDNA能被擴(kuò)增選擇性PCR：cccDNA能被擴(kuò)增56PCR產(chǎn)物自身退火（selfannealing）“選擇性”PCR：并非萬無一失PCR產(chǎn)物自身退火（selfannealing）“選擇性57rcDNA被大量擴(kuò)增，陽性結(jié)果不可靠，定量結(jié)果也不可靠

HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）

WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)Kock等：反應(yīng)管中rcDNA含量不能超過105copyHepatology

1996;23:405-413

血清HBVrcDNA超過108copy/ml，進(jìn)行熒光PCR可能會(huì)出現(xiàn)檢測結(jié)果假陽性“選擇性”PCR：并非萬無一失rcDNA被大量擴(kuò)增，陽性結(jié)果不可靠，定量結(jié)果也不可58

與定性法比較增加了一個(gè)熒光探針，探針位于擴(kuò)增片段區(qū)（負(fù)鏈缺口下游），與cccDNA的負(fù)鏈互補(bǔ)。選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA與定性法比較增加了一個(gè)熒光探針，探針位于擴(kuò)增片段區(qū)（59rcDNA不能被擴(kuò)增無熒光信號EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被擴(kuò)增檢測到熒光信號選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNArcDNA不能被擴(kuò)增EcoRI5‘+P1P23260實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理61實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理62實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理63

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy

相關(guān)指數(shù)：R2=0.995

靈敏度至少可以達(dá)到103copy/ml結(jié)果：選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程YCt=42.0827-3.5554logX64·同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA

非特異性擴(kuò)增的問題·由于靈敏度較普通PCR高，假陽性率比普通PCR更高缺陷：選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA·同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA缺陷：選擇性實(shí)時(shí)65質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品107copy/ml3.5×108copy/ml攜帶者血清質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品105copy/ml105~107copy/ml攜帶者血清選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品107copy/ml3.5×108copy/ml攜66解決方案

特異性抽提分離cccDNA與其它形式的病毒DNA

采用沉淀法或質(zhì)粒抽提試劑盒抽提法酶切純化cccDNA

采用綠豆核酸酶或ATP依賴的plasmid-safeDNA酶選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測cccDNA解決方案特異性抽提分離cccDNA與其它形式的病毒DNA選671.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的682.侵入者探針法(Invaderassay)兩個(gè)體系：兩種特殊的探針：invaderprobe和primaryprobe，后者含與待測模板無關(guān)的5’側(cè)翼的堿基片段。熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)：被核酸內(nèi)切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特異地切割5’側(cè)翼堿基片段作為第二個(gè)invader，與熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒（FRETC）結(jié)合，裂解酶切割FRETC上含有熒光基團(tuán)的短臂，發(fā)出熒光信號。特點(diǎn)：一個(gè)模板可以重復(fù)使用，每“結(jié)合—裂解—結(jié)合—裂解”一次為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次產(chǎn)生一個(gè)熒光信號，呈線性信號放大2.侵入者探針法(Invaderassay)兩個(gè)體系：69乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法課件70乙型肝炎病毒cccDNA檢測方法課件71侵入者探針法定量檢測cccDNA的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：線性信號放大，特異性比熒光

PCR法強(qiáng)缺點(diǎn)：靈敏度低：104copy/ml侵入者探針法定量檢測cccDNA的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：線性信號放大，721.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的733.嵌合引物熒光PCR法Shao,etal.JVirolMethods2003；

112：45-52+PNN：與HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNA3.嵌合引物熒光PCR法Shao,etal.JVi74PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物熒光PCR法PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物熒光PCR法75

嵌合引物熒光PCR的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：克服了熒光PCR法的部分缺陷，靈敏