生物醫(yī)療紡織品論文之人工韌帶

《生物醫(yī)用紡織品》課程論文姓名：張怡學(xué)號：222013323210083班級：2013級紡織工程2班論文題目：蠶絲蛋白人工韌帶的研究與實驗設(shè)計2014年11月10日蠶絲蛋白人工韌帶的研究及實驗設(shè)計作者：張怡【摘要】研究人工韌帶的發(fā)展背景以及人工支架的材料。目前用于組織工程韌帶的支架材料膠原蛋白、聚乳酸、聚羥基乙酸、小腸黏膜下層、聚糖及納米材料等均有降解速度快的特點,應(yīng)用于宿主后有一定炎癥反應(yīng)替代移植物韌。目前有自體移植物、異體移植物和人工韌帶3大類。自體移植物重建交叉韌帶在臨床上應(yīng)用較為廣泛，但存在自體移植物供區(qū)病損、自體移植物來源缺乏等問題。異體移植物潛在問題是有可能導(dǎo)致未知疾病的傳染，還有異體移植物的力學(xué)力量較弱，異體移植物重建的骨隧道會擴大，以及免疫排斥等。人工韌帶重建交叉韌帶的實驗結(jié)果和短期臨床效果令人滿意，遠期療效有待于進一步觀察，仍有許多問題有待于研.目的:觀察蠶絲支架的機械強度和體外降解性,了解蠶絲蛋白人工韌帶對人體的影響【關(guān)鍵詞】人工韌帶蠶絲蛋白膠原組織相容性一．人工韌帶的發(fā)展膝關(guān)節(jié)交叉韌帶斷裂是發(fā)生頻率較高且嚴重的運動創(chuàng)傷，治療不當(dāng)會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，并可繼發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)主要結(jié)構(gòu)損傷，嚴重影響膝關(guān)節(jié)功能。由于交叉韌帶自身愈合能力差，人們很早就放棄了單純縫合修復(fù)的方法，而多使用移植物重建。近20年來，交叉韌帶的修復(fù)與重建技術(shù)有了明顯的進步，貼別是關(guān)節(jié)鏡技術(shù)的發(fā)展對于交叉韌帶重建具有重要意義，關(guān)節(jié)鏡下重建交叉韌帶具有定位準(zhǔn)確、固定牢靠、關(guān)節(jié)整體損傷小、基本保持關(guān)節(jié)囊的完整等優(yōu)勢，是傳統(tǒng)手術(shù)方法所不可比擬的。目前常使用的移植物分為三種：自體移植物、同種異體移植物和人工韌帶。自體移植物應(yīng)用最廣，并取得了良好的臨床效果，但也有其缺點，如常用的骨-髕腱-骨供體部位會出現(xiàn)膝前疼痛、髕腱攣縮、髕腱炎等并發(fā)癥。同種異體移植物也存在疾病傳播、免疫排斥等問題。而且兩者作為生物移植物都要經(jīng)歷血管重建、細胞增殖和塑性成熟的過程，約一年的康復(fù)時間，對患者影響較大，尤其對運動員來說，還因為移植物強度下降、被拉長而影響術(shù)后效果。理想的材料，應(yīng)該具備持續(xù)高強度、耐磨損、無組織反應(yīng)等基本特性，并具有正常韌帶的功能，同時允許有生理排列、再生新韌帶傾向的組織逐漸長入。然而，完全符合上述條件的人工韌帶尚未面世。自上世紀60年代，人工韌帶已經(jīng)進入臨床應(yīng)用。70年代后的20年，有多種類型的人工韌帶被植入體內(nèi)。在材料選擇上，完全合成的碳纖維韌帶，因在關(guān)節(jié)和淋巴內(nèi)釋放磨損顆粒，引起顯著的炎性反應(yīng)。此后，以碳支架結(jié)合膠原或聚酯、聚四氟乙烯纖維束合成的聚合物，臨床成功率均不高。二．蠶絲蛋白的研究背景近年來，利用各種新材料制作的人工韌帶，為交叉韌帶的修復(fù)提供了新的選擇。生物大分子是目前高分子領(lǐng)域中很活躍而且富有挑戰(zhàn)性的一個研究領(lǐng)域，而蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子。蠶絲是人類最早利用的天然蛋白質(zhì)之一，隨著對其獨特氨基酸組成及結(jié)晶結(jié)構(gòu)等理化特性研究的深入，尤其是近年來蠶絲多用途開發(fā)向高新技術(shù)的滲透，國內(nèi)外對蠶絲的應(yīng)用正從傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域積極向化妝品、食品等領(lǐng)域擴展。作為一種性能優(yōu)良的纖維，它在應(yīng)用于生物技術(shù)、醫(yī)藥、材料等諸多方面，已取得了一系列的基礎(chǔ)研究成果，顯示了巨大的應(yīng)用潛力，引起了人們的廣泛關(guān)注。蠶絲廣泛存在于蠶繭中，蠶絲的粗絲包括兩個絲心蛋白和絲膠外殼，絲膠是支持絲心蛋白成纖維的類糖蛋白。絲素位于蠶絲中心，占70%~80%，絲膠包裹與絲素外周，占20%~30%。絲素蛋白由蠶繭繅絲脫膠而得到，來源豐富，是一種無生理活性的天然結(jié)構(gòu)性蛋白，主要有三種簡單的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，它們占蛋白總量的大概85%。在多年的應(yīng)用中，逐漸發(fā)現(xiàn)絲纖維和絲素蛋白有更多的潛力應(yīng)用于臨床修復(fù)和組織工程支架及作為改性材料，因為它們有著很多優(yōu)異的條件，例如：絲纖維容易大量得到；而將絲纖維直接溶在中性鹽溶液中后，經(jīng)透析就可以得到純的絲素蛋白水溶液；絲素蛋白有良好的生物相容性，無毒，無刺激性；由絲引起的炎癥反應(yīng)不會比一般用于縫合線的材料所引起的大。三．有關(guān)蠶絲支架的實驗（一）實驗?zāi)康谋緦嶒灳托Q絲絲狀支架的機械強度、體外降解性進行初步分析，以了解臨床應(yīng)用的可行性及其影響因素。（二）材料和方法1．1主要實驗儀器HFl51UV型二氧化碳培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡IMT一2，AGS—H材料實驗機，YJ21450型醫(yī)用凈化工作臺，電子天平，酶標(biāo)儀，LSY型恒溫器。1．2主要實驗材料由市場購得白色家蠶蠶絲(20／22D)，每30根蠶絲平行排列為一束支架。將蠶絲支架置入煮沸的0．5％Na：C03中進行脫膠，Na：C0。溶液體積(單位為毫升)與生絲的質(zhì)量(單位為克)之比為1000，煮沸30rain，重復(fù)2次，三蒸水漂洗后于真空干燥器中干燥。鼠科巨噬細胞RAW264.7。胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，脂多糖(LPS)，多粘菌素B，膠原酶IA。小鼠TNF一ⅡELISA檢測試劑盒購自晶美生物工程(武漢)有限公司。1．3體外降解實驗8cm長脫膠蠶絲支架在真空干燥器中干燥96h，測初重(wo)后分別浸泡于PBS溶液和用PBS配制的1．Omg／ml膠原酶中，置于LSY型恒溫器中(37±O．5℃)，每周換一次溶液，并每組分別取出4個樣品，用三蒸水漂洗后，進行如下測試：(I)真空干燥96h稱取殘重(Wr)，計算失重率W1％=100(Wo_Wr)／Wo，取平均值(n=4)；(2)試件自溶液中取出后在AGS—H材料試驗機上進行拉伸試驗，夾具間距為lOm，樣品的拉伸速度為0．Imm／s，測量樣品的極限抗拉強度(UTS)，直至斷裂，取平均值(n．4)。1．4單核細胞株RAW264．7的培養(yǎng)用0．25％的胰酶消化對數(shù)生長期的單核細胞株RAW264．7，用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度為I×109／m1，將I×lOg／ml的細胞接種在改良的Petri皿中用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于二氧化碳水套式培養(yǎng)箱5％c02％培養(yǎng)。1．5絲狀支架體外與RAW264．7細胞混合培養(yǎng)RAW264．7傳代三次后，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2X105／ml。將載有8咖蠶絲支架的玻片經(jīng)消毒后置入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔放入一束，共8孔，并將2×105／ml巨噬細胞混懸液Iml加入到玻片表面，靜置15min至巨噬細胞貼附后置于5％C0。，37。C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。同一培養(yǎng)板上另外8孔中僅加入2×105／m1巨噬細胞混懸液iml作為對照組。以上每孔加入5pg／ml多粘菌素B用于抑止脂多糖的污染。余下8孔加入2×lOS／ml巨噬細胞混懸液Iml，孵育15h后去上清，再加含LPSO．Iug／ml的DMEMlml／孔孵育。（三）.實驗結(jié)果1.絲狀支架失重率變化肉眼觀察到膠原酶組1周后溶液變渾濁，可發(fā)現(xiàn)微粒碎片，PBS組lO周后仍未見明顯碎片。12周內(nèi)絲狀支架失重率數(shù)據(jù)見表1，可以看出膠原酶組9周后重量減少已超過50％，PBS組失重率小于3％。失重率變化曲線如圖1所示，可見PBS組的失重率明顯低于膠原酶組。結(jié)果表明，膠原酶對絲狀支架的酶解消化作用較強，而支架在PBS中呈現(xiàn)穩(wěn)定和緩慢降解的趨勢。2.絲狀支架極限抗拉強度(UTS)變化顯示12周內(nèi)絲狀支架在PBS和膠原酶中UTS的數(shù)據(jù)，可見8周后膠原酶消化后支架的UTS下降超過原來的50％，而PBS組未見明顯變化。從曲線中我們可以看到，隨著酶的消化，絲狀支架UTS呈明顯下降趨勢，結(jié)果表明，膠原酶破壞了蠶絲的纖維結(jié)構(gòu)，分子間的作用力被削弱，從而使部分絲素溶解，纖維的強度下降；而PBS對蠶絲纖維結(jié)構(gòu)影響較小。參考文獻：謝麗娜.劉秀華.XIELi-na.LIUXiu-hua前脂肪細胞與蠶絲支架體外復(fù)合培養(yǎng)的實驗研究[期刊論文]-淮海醫(yī)藥2007,25(1)2.劉慶鵬．BMP加強型蠶絲人工韌帶重建兔ACL的實驗研究．2009，泰山醫(yī)學(xué)2009屆碩士碩士學(xué)位畢業(yè)論文．WangHong，'fanLi-jun，YangShu。hua，ZhangQing-song，MengChun-qing，DuanDe—yu，HeYu，MeiRong-cheng蠶絲支架韌帶材料的機械強度和體外降解性【J】．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(19)：3770-3774楊緒峰，賈慶衛(wèi)蠶絲人工韌帶復(fù)合骨髓基質(zhì)干細胞的實驗研究．論文康建敏，左健人工韌帶材料與膝關(guān)節(jié)韌帶損傷.中國組織工程研究第16卷第12期2012–03–18出版6.秦江輝，王駿飛，史冬泉，蔣青\t"/qk/97753A/201308/_blank"《蠶絲帶韌帶支架材料研究進展》[J].中國矯形外科雜志,2008(10).7.于淼，劉憶冰.人工韌帶修復(fù)膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷.中國組織工程研究第17卷第8期2013–