藥品微生物檢驗特點和過程控制課件

藥品微生物檢驗特點及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗方法驗證過程控制1中國藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗特點及過程控制藥品因素方法驗證過程控制1中國藥無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷2中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢微生物檢查的過程控制一、實驗設施（硬件——物質保障）二、檢驗程序（軟件——有效的結果）三、結果判斷（調查——可靠的結論）3中國藥品生物制品檢定所微生物檢查的過程控制一、實驗設施（硬件——物質保障）3中國藥一、實驗設施實驗室系統(tǒng)操作環(huán)境關鍵設備對照培養(yǎng)基物質保障4中國藥品生物制品檢定所一、實驗設施實驗室系統(tǒng)物質保障4中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗室系統(tǒng)潔凈實驗條件有效性：整體10000級、局部100級。安全性：保護樣品、人員和環(huán)境。可操作性：方便、快捷、順暢。潔凈實驗條件的維護、驗證陽性菌實驗室達到P2生物安全標準5中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗室系統(tǒng)潔凈實驗條件5中國藥品生物制品檢定所實驗室改造示例：原布局圖

擬定布局圖

建議布局圖1

建議布局圖2

實驗室系統(tǒng)——中檢所微生物實驗室6中國藥品生物制品檢定所實驗室改造示例：原布局圖

（一）、實驗室系統(tǒng)實驗室系統(tǒng)的管理與維護：1、屏障系統(tǒng)的有效性壓差、風速、微粒、照度（外包服務合同）2、清潔、靜態(tài)與動態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物7中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗室系統(tǒng)實驗室系統(tǒng)的管理與維護：7中國藥品生物制品環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）8中國藥品生物制品檢定所環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：8中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺9中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器9中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點評隔離器？驗證困難，滅菌不徹底：假陽性滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動態(tài)驗證困難，不適合多任務的檢驗活動超凈工作臺經(jīng)典、廉價、適合多任務的檢驗活動。提高實驗室新風供給、加強實驗室監(jiān)控可以揚長避短10中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點評隔離器？驗證搽拭實驗菌株菌液計數(shù)回收計數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%11中國藥品生物制品檢定所搽拭實驗菌株菌液計數(shù)回收計數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7（三）、關鍵設備微生物檢查薄膜過濾儀一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應急檢驗用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器12中國藥品生物制品檢定所（三）、關鍵設備微生物檢查薄膜過濾儀12中國藥品生物制品檢（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標準化）。對照培養(yǎng)基理化評價（可控性）生物學評價（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評價某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法13中國藥品生物制品檢定所（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；對照培養(yǎng)基理化評二、檢驗程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷14中國藥品生物制品檢定所二、檢驗程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法二、檢驗程序接受任務實驗方案實驗準備樣品核對實驗操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結果物質保障15中國藥品生物制品檢定所二、檢驗程序接受任務有效的結果物質保障15中國藥品生物實驗室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實驗室質量管理體系編寫說明及批準頁1實驗室概況1.1實驗室簡介1.2實驗室通訊資料1.3實驗室認可項目/參數(shù)表1.4實驗室平面圖及功能區(qū)域1.5儀器設備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7實驗室發(fā)展目標2管理規(guī)范2.1安全管理2.2業(yè)務流程2.3人員管理（6個SOP）2.4樣品管理（3個SOP）3標準操作規(guī)程3.1檢驗工作SOP（13個）3.2儀器操作SOP（30個）3.3實驗記錄SOP（9個）4實驗室保障4.1實驗室設施、設備及消耗品供應商確定原則4.2實驗室設施服務商4.3實驗設備供應商4.4實驗室消耗品供應商16中國藥品生物制品檢定所實驗室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實驗室質量管理體系（一）、實驗準備實驗準備應堅持“平戰(zhàn)結合”，物質準備有備無患，應隨時保證“來之能戰(zhàn)”。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實驗器材等。17中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗準備實驗準備應堅持“平戰(zhàn)結合”，物質準備有備無患實驗準備——無菌室專用酒精棉球制備

實驗準備——場地清潔

實驗準備——臺面清潔

18中國藥品生物制品檢定所實驗準備——無菌室專用酒精棉球制備

實驗準備——場地清潔

實（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；仔細核對樣品及樣品資料，高度關注媒體公布樣品（問題樣品），同時盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進行比較實驗、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。19中國藥品生物制品檢定所（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查——雙黃連

樣品完整性真空檢漏

20中國藥品生物制品檢定所樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查—（三）、實驗操作不斷完善標準化操作規(guī)程（SOP），嚴格避免實驗室污染。實驗人員培養(yǎng)基實驗器材實驗環(huán)境檢驗結果待檢樣品原料輔料設備環(huán)境藥品（食品）人員藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)21中國藥品生物制品檢定所（三）、實驗操作不斷完善標準化操作規(guī)程（SOP），嚴格避免實實驗操作——物料進場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風淋、紫外照射）雙層無菌包裝核心區(qū)外圍實驗操作——人員進場一更二更核心操作區(qū)實驗操作——無菌操作技術22中國藥品生物制品檢定所實驗操作——物料進場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風淋、紫外（四）、實驗過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控無菌檢驗框架示意圖23中國藥品生物制品檢定所（四）、實驗過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控無菌檢驗框架示三、結果判斷長菌與否分離鑒定溯源調查結果報告可靠的結論有效的結果物質保障24中國藥品生物制品檢定所三、結果判斷長菌與否可靠的結論有效的結果物質保障24中三、結果判斷

是不是微生物？是什么微生物？微生物來自哪里？幾點思考

參見：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環(huán)境菌的相似性考察》《藥學學報》，2007，42（11）：1189～1194《判斷無菌檢查陽性結果有效性的實驗探討》《藥物分析雜志》，2008，28（05）：66～71

25中國藥品生物制品檢定所三、結果判斷是不是微生物？25中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗二靠實驗三靠嚴格程序控制避免干擾26中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?一靠經(jīng)驗26中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁物理變化？化學變化？生物學變化？（2）、平板上的菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層

菌落or藥渣？27中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁27中國藥品生物制品檢定菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗延長培養(yǎng)時間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢28中國藥品生物制品檢定所菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗28中國藥品生2、分離鑒定（1）立即轉接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應進一步鑒定，并逐一保藏。29中國藥品生物制品檢定所2、分離鑒定（1）立即轉接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD）核酸鑒定（16sRNA、DNA）……30中國藥品生物制品檢定所是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)30中國藥品生物制品檢定所3、溯源調查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠期）現(xiàn)場調查收集菌株鑒定與相似性分析相結合傳統(tǒng)方法與新技術相結合不同方法的交叉驗證31中國藥品生物制品檢定所3、溯源調查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株鑒定與相似性分析相結合傳統(tǒng)微生物來自哪里？

相似性分析同源性分析脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）

32中國藥品生物制品檢定所微生物來自哪里？相似性分析32中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關系33中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmTheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells34中國藥品生物制品檢定所TheInfraredSpectrumlipidspro35中國藥品生物制品檢定所35中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件

圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢36中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G渾濁，劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L渾濁（Alcaligenesfaecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenesfaecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）37中國藥品生物制品檢定所編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。監(jiān)測到的環(huán)境菌株38中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staph溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/無菌室4C.urealyticum無菌室5K.kristinae無菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鑒定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%雙黃連注射液利巴韋林注射液FTIR相似性分析DuPontRiboPrinter基因指紋分析39中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilus走廊2M幾點思考（1）、怎樣才算是同一株菌？

需要深入認識微生物本身微生物變異與保守的相對性；分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學先鋒琳恩·馬古利斯(LynnMargulis)曾表示：“如果將一個特殊的質粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。40中國藥品生物制品檢定所幾點思考（1）、怎樣才算是同一株菌？40中國藥品生物制品檢定幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？

需要深入認識分析微生物的技術和手段形態(tài)學分析與相似性分析（生化反應譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），在權衡方法本身的邊界和微生物變異性邊界的基礎上，似乎更適合對親緣關系下一個否定的結論，即排除法，在這個意義上是否可以引入化學分析的3δ概念、精密度概念？

41中國藥品生物制品檢定所幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？41中國藥品生物制品檢定4、幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？16sRNAcDNA序列，需要研究，太保守不利于區(qū)分；變異率太高（高到普通傳代、培養(yǎng)難以控制）則沒有意義。但一般來說16sRNAcDNA序列水平具有確定意義，困難在于確定足夠長。溯源分析不僅僅是鑒定到種，而是到株，對菌株的穩(wěn)定性認識？與之相關的技術粗放性問題。

42中國藥品生物制品檢定所4、幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？42中國藥品生物制品4、幾點思考（3）、怎樣下結論？

分析的根本目的是要下一個結論

以檢驗活動為中心、以檢驗過程為線索、以實驗事實為依據(jù)，根據(jù)所有信息的綜合分析能力。對陽性檢出菌的技術分析最終要回到檢驗活動本身，技術分析結論

43中國藥品生物制品檢定所4、幾點思考（3）、怎樣下結論？43中國藥品生物制品檢定所4、結果報告綜合分析慎下不合格結論不放過任何一個陽性信息44中國藥品生物制品檢定所4、結果報告綜合分析44中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷45中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢實驗操作的標準化驗證試驗的系統(tǒng)化制定標準的嚴謹化完備的實驗室保障系統(tǒng)最終目標：一次檢驗即可得到準確結果。46中國藥品生物制品檢定所實驗操作的標準化46中國藥品生物制品檢定所謝謝大家！47中國藥品生物制品檢定所謝謝大家！47中國藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗特點及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗方法驗證過程控制48中國藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗特點及過程控制藥品因素方法驗證過程控制1中國藥無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷49中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢微生物檢查的過程控制一、實驗設施（硬件——物質保障）二、檢驗程序（軟件——有效的結果）三、結果判斷（調查——可靠的結論）50中國藥品生物制品檢定所微生物檢查的過程控制一、實驗設施（硬件——物質保障）3中國藥一、實驗設施實驗室系統(tǒng)操作環(huán)境關鍵設備對照培養(yǎng)基物質保障51中國藥品生物制品檢定所一、實驗設施實驗室系統(tǒng)物質保障4中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗室系統(tǒng)潔凈實驗條件有效性：整體10000級、局部100級。安全性：保護樣品、人員和環(huán)境。可操作性：方便、快捷、順暢。潔凈實驗條件的維護、驗證陽性菌實驗室達到P2生物安全標準52中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗室系統(tǒng)潔凈實驗條件5中國藥品生物制品檢定所實驗室改造示例：原布局圖

擬定布局圖

建議布局圖1

建議布局圖2

實驗室系統(tǒng)——中檢所微生物實驗室53中國藥品生物制品檢定所實驗室改造示例：原布局圖

（一）、實驗室系統(tǒng)實驗室系統(tǒng)的管理與維護：1、屏障系統(tǒng)的有效性壓差、風速、微粒、照度（外包服務合同）2、清潔、靜態(tài)與動態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物54中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗室系統(tǒng)實驗室系統(tǒng)的管理與維護：7中國藥品生物制品環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）55中國藥品生物制品檢定所環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：8中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺56中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器9中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點評隔離器？驗證困難，滅菌不徹底：假陽性滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動態(tài)驗證困難，不適合多任務的檢驗活動超凈工作臺經(jīng)典、廉價、適合多任務的檢驗活動。提高實驗室新風供給、加強實驗室監(jiān)控可以揚長避短57中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點評隔離器？驗證搽拭實驗菌株菌液計數(shù)回收計數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%58中國藥品生物制品檢定所搽拭實驗菌株菌液計數(shù)回收計數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7（三）、關鍵設備微生物檢查薄膜過濾儀一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應急檢驗用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器59中國藥品生物制品檢定所（三）、關鍵設備微生物檢查薄膜過濾儀12中國藥品生物制品檢（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標準化）。對照培養(yǎng)基理化評價（可控性）生物學評價（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評價某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法60中國藥品生物制品檢定所（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；對照培養(yǎng)基理化評二、檢驗程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷61中國藥品生物制品檢定所二、檢驗程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法二、檢驗程序接受任務實驗方案實驗準備樣品核對實驗操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結果物質保障62中國藥品生物制品檢定所二、檢驗程序接受任務有效的結果物質保障15中國藥品生物實驗室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實驗室質量管理體系編寫說明及批準頁1實驗室概況1.1實驗室簡介1.2實驗室通訊資料1.3實驗室認可項目/參數(shù)表1.4實驗室平面圖及功能區(qū)域1.5儀器設備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7實驗室發(fā)展目標2管理規(guī)范2.1安全管理2.2業(yè)務流程2.3人員管理（6個SOP）2.4樣品管理（3個SOP）3標準操作規(guī)程3.1檢驗工作SOP（13個）3.2儀器操作SOP（30個）3.3實驗記錄SOP（9個）4實驗室保障4.1實驗室設施、設備及消耗品供應商確定原則4.2實驗室設施服務商4.3實驗設備供應商4.4實驗室消耗品供應商63中國藥品生物制品檢定所實驗室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實驗室質量管理體系（一）、實驗準備實驗準備應堅持“平戰(zhàn)結合”，物質準備有備無患，應隨時保證“來之能戰(zhàn)”。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實驗器材等。64中國藥品生物制品檢定所（一）、實驗準備實驗準備應堅持“平戰(zhàn)結合”，物質準備有備無患實驗準備——無菌室專用酒精棉球制備

實驗準備——場地清潔

實驗準備——臺面清潔

65中國藥品生物制品檢定所實驗準備——無菌室專用酒精棉球制備

實驗準備——場地清潔

實（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；仔細核對樣品及樣品資料，高度關注媒體公布樣品（問題樣品），同時盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進行比較實驗、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。66中國藥品生物制品檢定所（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查——雙黃連

樣品完整性真空檢漏

67中國藥品生物制品檢定所樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查—（三）、實驗操作不斷完善標準化操作規(guī)程（SOP），嚴格避免實驗室污染。實驗人員培養(yǎng)基實驗器材實驗環(huán)境檢驗結果待檢樣品原料輔料設備環(huán)境藥品（食品）人員藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)68中國藥品生物制品檢定所（三）、實驗操作不斷完善標準化操作規(guī)程（SOP），嚴格避免實實驗操作——物料進場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風淋、紫外照射）雙層無菌包裝核心區(qū)外圍實驗操作——人員進場一更二更核心操作區(qū)實驗操作——無菌操作技術69中國藥品生物制品檢定所實驗操作——物料進場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風淋、紫外（四）、實驗過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控無菌檢驗框架示意圖70中國藥品生物制品檢定所（四）、實驗過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控無菌檢驗框架示三、結果判斷長菌與否分離鑒定溯源調查結果報告可靠的結論有效的結果物質保障71中國藥品生物制品檢定所三、結果判斷長菌與否可靠的結論有效的結果物質保障24中三、結果判斷

是不是微生物？是什么微生物？微生物來自哪里？幾點思考

參見：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環(huán)境菌的相似性考察》《藥學學報》，2007，42（11）：1189～1194《判斷無菌檢查陽性結果有效性的實驗探討》《藥物分析雜志》，2008，28（05）：66～71

72中國藥品生物制品檢定所三、結果判斷是不是微生物？25中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗二靠實驗三靠嚴格程序控制避免干擾73中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?一靠經(jīng)驗26中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁物理變化？化學變化？生物學變化？（2）、平板上的菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層

菌落or藥渣？74中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁27中國藥品生物制品檢定菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗延長培養(yǎng)時間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢75中國藥品生物制品檢定所菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗28中國藥品生2、分離鑒定（1）立即轉接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應進一步鑒定，并逐一保藏。76中國藥品生物制品檢定所2、分離鑒定（1）立即轉接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD）核酸鑒定（16sRNA、DNA）……77中國藥品生物制品檢定所是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)30中國藥品生物制品檢定所3、溯源調查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠期）現(xiàn)場調查收集菌株鑒定與相似性分析相結合傳統(tǒng)方法與新技術相結合不同方法的交叉驗證78中國藥品生物制品檢定所3、溯源調查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株鑒定與相似性分析相結合傳統(tǒng)微生物來自哪里？

相似性分析同源性分析脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）

79中國藥品生物制品檢定所微生物來自哪里？相似性分析32中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關系80中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmTheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells81中國藥品生物制品檢定所TheInfraredSpectrumlipidspro82中國藥品生物制品檢定所35中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件

圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢83中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G渾濁，劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L渾濁（Alcaligenesfaecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenesfaecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）84中國藥品生物制品檢定所編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。監(jiān)測到的環(huán)境菌株85中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staph溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilu