毛果楊PP2C基因家族生物信息學(xué)分析

毛果楊PP2C基因家族生物信息學(xué)分析摘要：蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酯酶中的一大類,廣泛參與逆境信號的傳遞過程。本實(shí)驗采用比較基因組學(xué)的方法，利用已知的擬南芥PP2C蛋白序列為檢索序列，在全基因組水平上搜索毛果楊的PP2C基因的同源序列。最終確定了毛果楊45個PP2C候選基因。對同源序列作進(jìn)一步的多序列聯(lián)配、ESTs、MEME和系統(tǒng)發(fā)生表達(dá)分析。關(guān)鍵詞：毛果楊比較基因組學(xué)基因家族Abstract:Proteinphosphatase2C(PP2C)isaproteinphosphataseinalargeclass,thebroadparticipationofadversitysignaltransmissionprocess.Inthisstudy,wesearchedthehomologoussequencefromPopulustrichocarpaproteindatabasebasedonthecompletegenomebyusingcomparativegenomicsmethodsandtakingtheArabidopsisthalianaPP2Cproteinwhichhasbeenisolatedastheretrievalsequence.Theresultsshowedthat45PP2C-likeproteinwereidentifiedfromPopulustrichocarpa.Further,wealsoanalyzedthesequencealignment,MEME,ESTandphylogenetic.Keywords:Populustrichocarpacomparativegenomicsgennefamily真核生物基因組中，編碼蛋白磷脂酶的基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于蛋白激酶，一般只有蛋白激酶基因數(shù)的四分之一至三分之一。在過去的研究中，蛋白質(zhì)可逆磷酸化研究的重點(diǎn)主要針對蛋白激酶，不過，現(xiàn)在越來越多的研究顯示，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，蛋白磷酸酶和蛋白激酶同樣重要[1]。根據(jù)底物蛋白分子上去磷酸化的氨基酸殘基的種類，PP主要分為三個家族：酪氨酸蛋白磷酸酶（proteintyrosinephosphatases,PTPs）、絲氨酸蛋白磷酸酶（proteinserinephosphatases,PPPs）和雙特異性蛋白磷酸酶（dualspecificityphosphatases,PSPs）。根據(jù)酶對底物選擇的特異性和對抑制劑的敏感程度，PPPs分為PP1和PP2。根據(jù)亞基的結(jié)構(gòu)、二價離子的依賴性和底物特異性，PP2又可進(jìn)一步分為PP2A、PP2B和PP2C[2]。大量研究表明，PP2A在進(jìn)化過程中，高度保守且廣泛表達(dá)。PP2B是由催化亞基A和調(diào)節(jié)亞基B構(gòu)成的二聚體，也是唯一受Ca2+／CaM調(diào)節(jié)的絲氨酸蛋白磷酸酶，在介導(dǎo)Ca2+信號到細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用。在所有PSPs的亞類中，只有PP2C沒有調(diào)控亞基，是一種單體蛋白磷酸酶，活性依賴于Mg2+或Mn2+[4]。PP2C與其他類型的PPP類蛋白磷酸酶相比,沒有較明顯的氨基酸序列同源性，但是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的相似性卻揭示這些蛋白磷酸酶可能擁有相似的催化機(jī)制或相同的催化底物。PP2C類蛋白磷酸酶的一個重要的結(jié)構(gòu)特征是在其催化區(qū)域內(nèi)含有11個保守的結(jié)構(gòu)亞區(qū)[3]。與哺乳動物PP2Cs相比，植物PP2Cs具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)模式，即植物中多數(shù)PP2C類磷酸酶C端具有保守的催化區(qū)域，而N端卻是保守性不強(qiáng)、長度不一的延伸區(qū)域，在這些延伸區(qū)域內(nèi)，含有與胞內(nèi)信號相關(guān)的序列包括跨膜區(qū)域和激酶互作區(qū)域等，從而賦予了PP2C不同的功能[1]。蛋白磷酸酶結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性是功能廣泛性的基礎(chǔ)。隨著植物中越來越多的蛋白磷酸酶基因及其相關(guān)蛋白的分離、純化與鑒定，以及基因特性與生理生化的深入研究，其眾多的功能也陸續(xù)的被確定。迄今為止，蛋白磷酸酶已經(jīng)被證實(shí)與植物的生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、滲透脅迫以及活性氧脅迫等各種抗逆性反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。如今，毛果楊的全基因組測序已經(jīng)完成，數(shù)據(jù)庫Populustrichocarpav1.1(/Poptrl_1/Poptrl_1.home.html)公布了全部序列。此后，在第一測序的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了第二次補(bǔ)充測序。毛果楊全基因組最新數(shù)據(jù)已經(jīng)包含在數(shù)據(jù)庫Phytozomev7.0(/poplar)。本實(shí)驗運(yùn)用生物信息學(xué)方法對毛果楊的PP2C基因家族進(jìn)行了初步分析鑒定[5]。1材料與方法1.1數(shù)據(jù)庫的搜索根據(jù)擬南芥只已分離出的PP2C基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列，在NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心，NationalCenterforBiotechnologyInformation,/）中通過blastp檢索毛果楊無榮譽(yù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，E≤10-26的序列被認(rèn)為是候選蛋白。利用Blastn程序?qū)@得的候選蛋白與擬南芥的PP2C基因作進(jìn)一步的匹配，采用默認(rèn)參數(shù)，取E≤10-10的擊中項為最終的候選蛋白，由相應(yīng)的程序和索引文件提取所有符合條件的蛋白序列，構(gòu)建列表。最后，從相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫中下載最終確認(rèn)的候選蛋白所對應(yīng)的CDS序列[5]。1.2序列聯(lián)配分析與系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建利用ClustalW軟件對搜索到的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列聯(lián)配分析。以序列聯(lián)配結(jié)果為基礎(chǔ)，用MEGA3.1軟件生成毛果楊PP2C蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹。進(jìn)化樹的生成采用鄰接法（Neighbor-joiningmethod)。具體參數(shù)設(shè)置TestofPhylogeny:Bootstrapmethod;Replications:1000;Method:Poissonmodel;Gaps:Pairwisedeletion;RatesamongSites:Uniformrates。其它為默認(rèn)參數(shù)[7]。1.3PP2C的motif分析毛果楊PP2C類型基因的預(yù)測motif分析通過MEME（/meme/cgi-bin/meme.cgi）在線分析[14]。1.4PP2C的EST分析毛果楊PP2C基因家族的EST分析是通過NCBI，在Expressedsequencetags(EST)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸比對，統(tǒng)計比對結(jié)果的組織類型的信息，進(jìn)而與預(yù)測每個基因在不同組織類型中的表達(dá)情況。2結(jié)果與分析2.1毛果楊PP2C的挖掘根據(jù)擬南芥PP2C基因編碼的蛋白質(zhì)檢索出毛果楊PP2C基因家族蛋白，之后去冗余共得到45條毛果楊候選PP2C氨基酸序列，都具有PP2C保守區(qū)域。從表可知，毛果楊的PP2C基因分布于第1至18號染色體上，除四號染色體上無表達(dá)基因外，其余都有所表達(dá)。從基因結(jié)構(gòu)看，毛果楊內(nèi)含子數(shù)目在2-10之間變化，并不包含沒有內(nèi)含子的基因，說明植物的PP2C基因，進(jìn)化過程中沒有發(fā)生內(nèi)含子的插入和缺失事件。詳細(xì)信息如表1所示。表1毛果楊的PP2C候選蛋白及匹配EST的數(shù)量Table1ThePP2CcandidateproteinsandthehitsnumberofESTinPopulustrichocarpa基因Gene位點(diǎn)Locus蛋白質(zhì)長度（aa）Proteinlength(aa)染色體Chromosome匹配EST數(shù)量ThehitsnumberofEST內(nèi)含子IntronPPTP2C-1EEF02439397LGX1193PTPP2C-2EEE88105385LGIX1184PTPP2C-3EEE84651392LGI03PTPP2C-4ERP66114411LGI03PTPP2C-5EEF05571334LGXV1223PTPP2C-6EEE96607370LGXII1202PTPP2C-7EEE79084546LGIII1473PTPP2C-8ERP66113302LGI03PTPP2C-9EEE93007548LGVI1202PTPP2C-10EEF03306551LGXVIII1093PTPP2C-11EEE82783388LGI03PTPP2C-12ERP49654578LGXVIII1093PTPP2C-13ERP59565229LGVI1202PTPP2C-14EEF05989289LGXV1223PTPP2C-15ERP52444305LGXV1223PTPP2C-16EEE97078286LGXII1202PTPP2C-17EEF05572351LGXV1228PTPP2C-18EEE96604355LGXII1208PTPP2C-19EEE94467276LGV1447PTPP2C-20ERP61405273LGV1447PTPP2C-21EEF02923292LGXVIII1098PTPP2C-22EEE92243292LGVI1208PTPP2C-23ERP49572262LGXVIII1098PTPP2C-24EEE83289392LGI03PTPP2C-25ERP54886255LGXII1202PTPP2C-26EEE87942416LGIX1183PTPP2C-27EEF02373389LGX1193PTPP2C-28EEF01832397LGX1195PTPP2C-29ERP65062359LGI010PTPP2C-30EEE99269397LGXIV1313PTPP2C-31EEE97500282LGXI1594PTPP2C-32EEE88603380LGVIII1263PTPP2C-33ERP51920284LGXV1228PTPP2C-34ERP50526313LGXVII1894PTPP2C-35EEE79713359LGIII14710PTPP2C-36EEE92161382LGVI1203PTPP2C-37EEF04978661LGXVI13911PTPP2C-38EEF02837380LGXVIII1093PTPP2C-39EEF03484358LGXVIII10910PTPP2C-40EEE93202358LGVI10910PTPP2C-41EEE94216381LGV1443PTPP2C-42ERP53974446LGXIII1304PTPP2C-43EEE80809389LGII1123PTPP2C-44EEF03734338LGXVIII1094PTPP2C-45ERP58376384LGVII1174注：毛果楊染色體構(gòu)成LG_2.2毛果楊PP2C蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析為了對毛果楊PP2C蛋白的功能和特性作進(jìn)一步的了解，本實(shí)驗對預(yù)測的毛果楊45個PP2C基因與已經(jīng)鑒定出的擬南芥的所有蛋白序列的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了評估。由進(jìn)化樹可以看出(圖1)：毛果楊PP2C家族中可被分為7個亞族(A、B、C、D、E、F、G），其中A、D、E和G的Bootstrap在85％以上，基因PP2C-36為獨(dú)立的分枝。7個亞族中共有45個基因形成15個同源基因?qū)?Bootstrap大于85％)，其中15對的Bootstrap為100％?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，毛果楊PP2C基因的長度在0.2kb-0.7kb之間，內(nèi)含子數(shù)量在2-10間，不同亞族間有較大變化（表1）。由此可見，內(nèi)含子和非翻譯區(qū)長度的變化也是引起基因結(jié)構(gòu)變化的原因之一[15-16]。圖1毛果楊PP2C基因家族蛋白的進(jìn)化樹Picture1ThephylogenetictreeoftheproteinofPP2CgenefamilyinPopulustrichocarpa2.3PP2C蛋白的基序分布為了進(jìn)一步了解毛果楊PP2C基因家族的系譜發(fā)生和功能，就毛果楊的45個PP2C蛋白序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，并利用MEME在線軟件對其motif進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，毛果楊PP2C基因家族被分為7個亞族。在該motif分析中，在該家族中共找到45個motif。MEME分析表明（表3）：毛果楊的PP2C基因家族蛋白的結(jié)構(gòu)域具有很強(qiáng)的保守性，由表3可知：毛果楊除PP2C-7、PP2C-12、PP2C-13、PP2C-14、PP2C-15、PP2C-24、PP2C-32、PP2C-44外，其余候選蛋白都存在1、2、3號基序（表2），且PP2C-7、PP2C-13、PP2C-14、PP2C-15、PP2C-24、PP2C-32缺失3號基序，PP2C-12缺失2號基序，PP2C-44缺失2號和3號基序。這就說明在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基序的部分功能喪失突變。表2MEME分析提取的保守序列Table2ConservedmotifsretrievedbyMEMEanalysis基序編號Motif.No一致序列Consensussequence1GSTAVTALICGDHLIVANCGDCRAVLCRGGKAIPLSVDHKP2HFFGVYDGHGGAHVAEYCKENLHKNILEH3KQWVIAEPEIMFMKLTPEDEFLILACDGLWDVMSNQ表3毛果楊PP2C蛋白序列的基序及排列順序Table3MotifsanddistributionofPP2CcandidateproteinsinPopulustrichocarpa名稱Name最低聯(lián)合概率combinedp-value基序與排列順序motifandarrangementPPTP2C-11.1e-812-1-3PTPP2C-21.5e-862-1-3PTPP2C-31.7e-852-1-3PTPP2C-41.9e-852-1-3PTPP2C-54.7e-722-1-3PTPP2C-61.6e-822-1-3PTPP2C-72.5e-562-1PTPP2C-82.9e-872-1-3PTPP2C-91.4e-862-1-3PTPP2C-106e-712-1-3PTPP2C-111.6e-862-1-3PTPP2C-123.2e-541-3PTPP2C-133.5e-572-1PTPP2C-144e-572-1PTPP2C-152.1e-572-1PTPP2C-168.3e-802-1-3PTPP2C-171.5e-802-1-3PTPP2C-189.4e-532-1-3PTPP2C-197.9e-342-1-3PTPP2C-202.8e-782-1-3PTPP2C-212.3e-782-1-3PTPP2C-222e-782-1-3PTPP2C-238.6e-782-1-3PTPP2C-243e-542-1PTPP2C-251.9e-722-1-3PTPP2C-264.7e-752-1-3PTPP2C-273.5e-662-1-3PTPP2C-289.1e-822-1-3PTPP2C-291.8e-732-1-3PTPP2C-303.2e-522-1-3PTPP2C-311.1e-752-1-3PTPP2C-324.7e-542-1PTPP2C-332.1e-562-1-3PTPP2C-342.2e-772-1-3PTPP2C-355.6e-752-1-3PTPP2C-361.3e-602-1-3PTPP2C-371.7e-742-1-3PTPP2C-381.9e-792-1-3PTPP2C-393.1e-762-1-3PTPP2C-404.5e-712-1-3PTPP2C-413e-592-1-3PTPP2C-422.6e-692-1-3PTPP2C-432.1e-722-1-3PTPP2C-444.1e-351PTPP2C-452.7e-702-1-32.4PP2C的EST表達(dá)部位分析EST（expressedsequencetags）是指來源于不同的組織的cDNA序列，不同的EST在發(fā)掘過程中面對整個cDNA文庫的機(jī)會均等，所以通過BLAST在數(shù)據(jù)庫中搜索EST，其數(shù)量的多少可以反映相應(yīng)的基因在不同的組織中的表達(dá)情況，從而分析基因的組織特異性。本實(shí)驗通過BLAST搜索對數(shù)據(jù)庫中毛果楊中所有的候選PP2C蛋白序列進(jìn)行EST分析，結(jié)果顯示（表4），僅有三個組織被檢測到，分別為芽、葉和莖。除此之外，僅有39個候選蛋白序列找到相應(yīng)的表達(dá)部位，且候選蛋白序列在這些組織中呈現(xiàn)不均勻分布，具有特異性[8-14]。表4毛果楊PP2C基因家族基因的EST表達(dá)情況Table4ThedistributionfortheexpressedESTsofpartPP2CgenneinPopulustrichocarpa基因（gene）器官（Apparatus）芽(Bud)葉(Leaf)莖(Stem)PPTP2C-1√√√PTPP2C-2√√√PTPP2C-3PTPP2C-4PTPP2C-5√√PTPP2C-6√√√PTPP2C-7√√√PTPP2C-8PTPP2C-9√√√PTPP2C-10√√√PTPP2C-11PTPP2C-12√√√PTPP2C-13√√√PTPP2C-14√√√PTPP2C-15√PTPP2C-16√√√PTPP2C-17√PTPP2C-18√√√PTPP2C-19√√PTPP2C-20√√√PTPP2C-21√PTPP2C-22√√√PTPP2C-23√√√PTPP2C-24PTPP2C-25√√√PTPP2C-26√√√PTPP2C-27√√√PTPP2C-28√√√PTPP2C-29PTPP2C-30√√√PTPP2C-31√√√PTPP2C-32√√√PTPP2C-33√PTPP2C-34√√√PTPP2C-35√√√PTPP2C-36√√PTPP2C-37√√√PTPP2C-38√PTPP2C-39√√√PTPP2C-40√√√PTPP2C-41√√√PTPP2C-42√√PTPP2C-43√√√PTPP2C-44√√√PTPP2C-45√3討論毛果楊全基因組序列圖譜的成功構(gòu)建使我們得以有機(jī)會對該物種進(jìn)行初步的比較基因組學(xué)的分析。楊屬物種在歷經(jīng)全基因組復(fù)制，染色體重建，以及串聯(lián)重復(fù)等一系列復(fù)雜事件后煙花形成我們現(xiàn)在所觀察到的基因組。運(yùn)用已知的楊屬基因組序列，進(jìn)一步開展楊屬與其他不同植物間基因組的比較分析，將有效地促進(jìn)這些物種基因組結(jié)構(gòu)及基因家族進(jìn)化的研究。蛋白磷酸酶2C（PP2C）是植物中最大的蛋白磷酸酶家族，現(xiàn)在已經(jīng)在擬南芥和水稻基因組中分別鑒定出80和78個成員，進(jìn)化樹分析分別將它們歸為13個和11個亞族，基因組進(jìn)化過程中發(fā)生的基因組和染色體片段的重復(fù)是導(dǎo)致該家族成員眾多的主要因素。作為植物體內(nèi)重要的信號分子，PP2C為數(shù)眾多，且有保守的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)。大量的PP2C基因已經(jīng)被克隆到[17]，目前研究主要集中在不同信號途徑的角色，尋找PP2C的作用受體成為蛋白磷酸酶的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗的進(jìn)行，為以后研究毛果楊PP2C基因家族的后續(xù)分析提供了理論依據(jù)。實(shí)驗結(jié)果中，毛果楊EST表達(dá)只出現(xiàn)在根、莖、芽中，對于為什么沒出現(xiàn)在其他組織中，且根、莖、芽中有些未表達(dá)，有待作進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)[1]薛彤彤.棉花金屬硫蛋白基因GhMT3α的功能分析及擬南芥與水稻蛋白質(zhì)磷酸酶PP2C基因家族分析.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)[D].2009.[2]胡曉麗,李德全.植物蛋白磷酸酶2C(PP2C)及其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用.植物生理學(xué)通訊[J].2007,43(3):407-412.[3]阮海華.植物PP2C蛋白磷酸酶負(fù)調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)[J],2007,35(3):652-653.[4]周旺,亓?xí)云G,張應(yīng)玖.蛋白磷酸酶2C(PP2C)的表達(dá)、純化與催化活性.吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)[J].2009