免疫學實驗設計課件

IL-35對小鼠的Ⅰ型糖尿病的治療效果評定及免疫機制的研究目錄1.立題依據(jù)2.實驗目的3.實驗對象4.實驗材料5.實驗步驟及方法6.預期結果及結論7.實驗可行性分析8.參考文獻自身免疫性疾?。ˋutoimmunediseases）是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應而導致自身組織損害所引起的疾病。如今越來越多的自身免疫性疾病被不斷發(fā)現(xiàn)和認識，也越來越引起人們的關注。Ⅰ型糖尿病(T1DM自身免疫性胰腺炎)就是其中的一員，其機制是體內除了抗原提呈細胞（APC）和活化的T淋巴細胞外正常細胞幾乎不表達MHC-Ⅱ類分子，研究表明IFN-γ轉基因小鼠的胰島β細胞分泌IFN-γ，由于IFN-γ刺激MHC-Ⅱ分子的表達這種小鼠的胰島β細胞高表達MHC-Ⅱ類分子，這樣以來免疫細胞就會結合并識別胰島β細胞然后對其進行攻擊，使其喪失胰島素分泌活性，最終導致體內胰島素缺乏。臨床發(fā)現(xiàn)人體發(fā)病機制與鼠基本相同，患者往往需要終生注射外源性胰島素來控制體內的血糖水平。Ⅰ型糖尿病的發(fā)病率雖然較低，在全球大約有2000萬患者，中國至少有100萬的患者，但是Ⅰ型糖尿病常常在幼兒和青少年時期發(fā)生且為一種多基因遺傳病有較高的遺傳度（75%），表現(xiàn)為明顯的家族遺傳性。同時，Ⅰ型糖尿病患者如治療不善將引發(fā)嚴重的并發(fā)癥，如失明、腎衰竭、心臟病、截肢等。因此如果能正確了解Ⅰ型糖尿病的免疫學機制，制定更加有效治療及預防方案，對于患者本身乃至整個家族的身體和生活質量的提高意義重大。關于Ⅰ型糖尿病的介紹調節(jié)性T細胞（Treg)是近年來研究的熱點，是一些CD4+Tcell還可高表達IL-2受體的α鏈（CD25）分子，胞質中表達Foxp3轉錄因子的T細胞分化亞群。它的主要功能是通過抑制CD4+Tcell和CD8+Tcell的活化與增殖從而達到免疫的負調節(jié)作用。

關于調節(jié)性T細胞本實驗就是通過提高NOD系小鼠（Ⅰ型糖尿病患鼠）體內的IL-35水平，觀測小鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的Ⅰ型糖尿病發(fā)病率、胰島炎評分等，評定IL-35對Ⅰ型糖尿病的預防及治療效果，并與其它一些免疫抑制性的藥物（環(huán)孢菌素A）等，進行藥敏對比；體外測定小鼠體內IL-4及干擾素-γ（IFN-γ）的等含量及T淋巴細胞的亞群分化情況及調節(jié)性T淋巴細胞的含量等，對小鼠的免疫體質及IL-35對Ⅰ型糖尿病作用的免疫學機制有大體認識及方向把握，為以后的研究打下基礎。為免疫抑制性新藥（聯(lián)合藥）的開發(fā)及免疫抑制領域的深入研究有一定意義。實驗目的NOD系和NON系（正常不患病個體）小鼠

起源

在對ICR/Jcl小鼠進行近郊培育的第6代，從白內障易感亞系分離出非肥胖糖尿病品系（NOD）和非肥胖正常品系（NON）。在近交20代時，首先發(fā)現(xiàn)NOD雌鼠有胰島素依賴性糖尿病。特征

自發(fā)Ⅰ型糖尿病以及多種自身免疫疾病小鼠。通過病理學觀察發(fā)現(xiàn)，NOD小鼠自身免疫性胰島炎發(fā)生于4周齡。NOD小鼠發(fā)病后，充分呈現(xiàn)該品系小鼠糖尿病的生理生化特征即：尿頻·多飲·高血糖癥狀。在幾周的時間內，血糖迅速升高，飲水量劇增，大量的排尿，體重迅速下降，在這個過程中，患鼠血糖呈現(xiàn)迅速上升，后逐步下降，但仍維持高于正常值的狀態(tài)，體重直線下降，最后昏迷而死亡。于12周齡時出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀，至30周齡時雌性小鼠累計發(fā)病率可達到80％。知己知實驗對象試劑及儀器IL-35試劑，磷酸鹽緩沖液(PBS),酶聯(lián)免疫吸附試驗（ElISA）試劑盒，流式細胞儀，CD8及CD4單克隆抗體，注射器等基礎實驗器械。實驗材料小鼠的分組與處理

30周后，頸椎脫臼法處死各組小鼠，取各組小鼠胰島做HE色切片進行病理性胰島炎評分。評分標準：1>0級：胰島完整無淋巴細胞浸潤，計0分；2>1級：有胰島周圍淋巴細胞浸潤（即胰島周圍炎）或<25%的胰島面積受累，計1分；3>2級：浸潤至胰島內，25%→50%的面積受累,計2分；4>3級：>50%的面積受累，計3分。記錄各組小鼠評分值胰腺炎嚴重程度評分

取各組小鼠脾臟制成單核細胞懸液，應用細胞流式法進行T淋巴細胞亞群（主要是細胞免疫）計數(shù)，結果用百分比表示。T淋巴細胞亞群測定

分選提取大鼠脾臟和淋巴結CD4+CD25+調節(jié)性T（Treg）細胞

并進行純度和活性檢測。用免疫磁珠兩步法既陰性選擇和陽性

選擇分選提取小鼠CD4+CD25+調節(jié)性T細胞,流式細胞儀檢測細胞

純度,臺盼藍染色法觀察計算細胞存活率。

細胞CD4+CD25+調節(jié)性T（Treg）細胞

應用實驗常用統(tǒng)計學軟件（SAS,SPSS等）進行大量數(shù)據(jù)的后處理，整理待分析。統(tǒng)計學處理分析預期結果

實驗組小鼠的發(fā)病率遠低于對照組小鼠發(fā)病率，體重較對照組重；且對照組飲食飲水量遠多于實驗組和正常對照組；血糖和尿糖含量比對照組低并接近于正常對照組（可偏高）；IL-4及干擾素-γ（IFN-γ）的含量實驗組數(shù)據(jù)遠低于對照組和正常對照組鼠，提示實驗組發(fā)生了免疫的抑制（免疫的耐受）；實驗組T淋巴細胞亞群分化度和活性較對照組和正常對照組明顯偏低；調節(jié)性T（Treg）細胞實驗組計數(shù)和活性較對照組和正常對照組高，提示有免疫抑制及耐受。預期結果及結論預期結論

IL-35對Ⅰ型糖尿病有明顯的抑制或治療作用；由于IL-35使Th0細胞向調節(jié)性T（Treg）細胞分化（優(yōu)勢分化方向）從而抑制T淋巴細胞的其他效應性分化（主要有Th1和Th2方向）使IL-2、IL-4及IFN-γ等主要免疫增強因子的分泌減少，有效抑制了荷主的免疫能力，從整體水平上降低自身免疫病的發(fā)生；

Treg的活性增值又能分泌IL-35和促進Fas、Fasl途徑激活相關基因致使T淋巴細胞凋亡，以上兩項從整體水平上降低自身免疫病的發(fā)生；IFN-γ分泌的減少還能抑制胰島β細胞產(chǎn)生MHC-Ⅱ類分子使T淋巴細胞不能對其產(chǎn)生殺傷作用，從而不會引起免疫細胞對自體胰島β細胞識別與破壞，保證了胰島β細胞的正常胰島素分泌功能，維持血糖的正常。【1】金伯泉·醫(yī)學免疫學·第五版·北京：人民衛(wèi)生出版社，2008【2】宋文剛·免疫學實驗教材·北京：北京大學醫(yī)學出版社，2010【3】孫黎飛·細胞免疫學實驗研究方法·北京：人民軍醫(yī)出版社，2009【4】王培林，傅松濱·醫(yī)學遺傳學·第三版·北京科學技術出版社2011【5】哈佛醫(yī)學院BrighamandWomen’s醫(yī)院，eBioscience公司的科學家·Nature·罕見的抑制性因子·美國·2007【6】王嘉軍·微生物學免疫學新進展·第37卷，第4期·2011【7】周國慶，唐琴，黃麗，孫保亮·泰山醫(yī)學院學報，Treg的免疫磁珠提取純化方法【8】姜小麗，楊婷等·中