PCR學(xué)習(xí)-淺析PCR儀的分類

淺析PCR儀的分類、應(yīng)用及當(dāng)前市場品牌格局作者：佚名來源：維庫儀器儀表網(wǎng)2012-10-1023:39閱讀：442隨著生命科學(xué)研究不斷的突破性發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)也得到了大力發(fā)展，重要性日漸凸顯。這也使得PCR儀成為生命科學(xué)研究實驗室中不可缺少的一部分。PCR,中文稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其實是一種DNA的快速擴增技術(shù)，PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內(nèi)把特定的DNA量提高1000萬倍。PCR技術(shù)引起了分子生物學(xué)研究的一場革命，推動了微觀領(lǐng)域的生物學(xué)研究。現(xiàn)在PCR儀已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究、食品衛(wèi)生、醫(yī)療、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面。PCR儀一般分為普通PCR儀、梯度PCR儀、原位PCR儀以及實時熒光定量PCR儀四類。普通PCR儀是指一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，能夠應(yīng)用于簡單的目的基因退火溫度的擴增。梯度PCR儀則是設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），一次性PCR擴增，就可以篩選出表達量高的最適退火溫度，進行有效的擴增。梯度PCR儀主要用于快速、低成本的進行未知DNA退火溫度的擴增。原位PCR儀是用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細胞內(nèi)基因擴增儀，主要用于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變。在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR儀。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出。主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構(gòu)。目前在PCR儀市場中，較為有名的品牌及廠商有ABI美國應(yīng)用生物公司、ROCHE羅氏診斷、MJ、伯樂等，以及國內(nèi)的杭州博日、杭州朗基、上海楓嶺、廈門安普利等。ABI美國應(yīng)用生物公司在PCR儀市場中占據(jù)極其重要的地位，尤其是其收購了PCR儀的鼻祖PE公司，實力更為雄厚，有多款經(jīng)典PCR儀。ROCHE羅氏診斷推出的PCR儀相比較而言，更具有特色，以科研定位為主。MJ的PCR擴增儀在生命科研領(lǐng)域比較出名，其產(chǎn)品比較適合高通量檢測，常用于人類基因組計劃等。伯樂的PCR儀則性價比相對高一些，其擴增儀上往往會加裝定量模塊。消費者在選購時，可根據(jù)實際需求情況，標(biāo)本數(shù)量、參照每個標(biāo)本要分?jǐn)偟臉?biāo)準(zhǔn)曲線、對照成本、試劑選擇等進行綜合考慮。PCR熱蓋早期的PCR儀是沒有熱蓋的，通過在PCR反應(yīng)液中加入石蠟油（或礦物油）來防止PCR反應(yīng)液蒸發(fā)。但反應(yīng)完成后石蠟油不好除干凈（我做實驗時是將PCR反應(yīng)液與石蠟油一起冷凍,取出后用手將管捂熱，石蠟油先化開，立即將石蠟油用槍吸出。但并不能完全吸干凈）o后來出現(xiàn)了帶熱蓋的PCR儀，熱蓋的作用并不是防止蒸發(fā)，而是防止蒸發(fā)的水汽在管蓋上凝結(jié)。反應(yīng)液中的水份還是會有部分變成蒸汽在管中，只是不會凝結(jié)在管蓋上（如果沒有熱蓋也不加石蠟油，反應(yīng)管中的水份會全都凝結(jié)在管蓋上的）。PCR儀的熱蓋大致可以分為以下四種：非可調(diào)式熱蓋、可調(diào)節(jié)式熱蓋、自適應(yīng)式熱和自動式熱蓋1、非可調(diào)式熱蓋：即熱蓋并不能同時適用于高管和矮管，如AB的2720等只能用高管，用矮管得手工加鋁塊；2、可調(diào)節(jié)式熱蓋：即熱蓋的高度可以手工調(diào)節(jié)，同時適用于各種高管和矮管，但壓力需要自己感覺，用力過小或過大都可能會有麻煩，如MJ公司的PTC200o因為有這個問題，后來又出了力矩式可調(diào)熱蓋，即熱蓋旋轉(zhuǎn)到一定力矩后內(nèi)置機構(gòu)打滑，從而保證一定的熱蓋壓力。如東勝龍的黑金剛以及Biometra等。這類熱蓋打開前最好旋松蓋,否則下一個用戶如果直接下壓熱蓋，可能造成部分PCR管變型。但很多用戶會忘記松熱蓋。3、自適應(yīng)式熱蓋：即熱蓋自帶預(yù)壓緊的彈簧，通過與打開和關(guān)閉熱蓋的手柄機構(gòu)相結(jié)合，達到壓手柄時自動壓緊熱蓋，開手柄時自動松開熱蓋，自適應(yīng)高管和矮管，不用擔(dān)心壓力和沒有松開熱蓋等問題。如東勝龍二代的ETC811型PCR儀。4、自動式熱蓋：即熱蓋是由電機來控制的壓緊與松開的。一般用于與實驗室自動化相配合的PCR儀，或稱為全自動PCR儀，如原MJ公司以及Biometra公司都有此類PCR儀，但價格都較高。PCR擴增儀的熱蓋有什么作用？使用時應(yīng)注意什么？答：目前PCR儀通常都配備熱蓋，可使木品管頂部溫度達到150c左右，避免蒸發(fā)的反應(yīng)液凝集于管蓋而改變PCR反應(yīng)體積。無需加石蠟油，減少了后續(xù)實驗的麻煩。旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋需注意旋轉(zhuǎn)壓力的控制，過松則使熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；過緊則會導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機械故障。名詞解釋.PCR技術(shù)：通過加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs,Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)上述過程至25-40個循環(huán)，達到體外擴增核酸序列的目的。.TaqDNA聚合酶：一種從嗜熱水生菌(Thermusaquaticus)分離得到的熱穩(wěn)定DNA依賴的DNA聚合酶。.水浴鍋PCR基因擴增儀：屬于第一代PCR基因擴增儀，以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個控溫體系。.壓縮機PCR基因擴增儀：屬于第二代PCR基因擴增儀，由壓縮機自動控溫,金屬導(dǎo)熱。.Overshooting:指升溫過程中，由于一些加熱元件，比如半導(dǎo)體、金屬塊本身會積蓄能量，雖然溫度探頭探測到溫度到達了設(shè)定溫度，但半導(dǎo)體、金屬塊上積蓄的能量仍然會傳給PCR體系，造成實際的溫度高于設(shè)定的溫度。.Undershooting:在降溫過程中出現(xiàn)一個降溫慣性，從而造成實際溫度會短時間的低于設(shè)定的溫度。.半導(dǎo)體PCR基因擴增儀：屬于第三代PCR基因擴增儀，由半導(dǎo)體自動控溫,金屬導(dǎo)熱。.離心式空氣加熱PCR基因擴增儀：屬于第三代PCR基因擴增儀，由金屬線圈加熱，采用空氣作為導(dǎo)熱媒介。.梯度PCR儀：帶梯度PCR功能的基因擴增儀，在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。.原位PCR儀：帶原位擴增功能的基因擴增儀。.原位PCR技術(shù)：即在細胞內(nèi)進行PCR擴增，組織細胞的形態(tài)不被破壞，是原位雜交與PCR技術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)。.熒光實時定量PCR技術(shù)：在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，通過檢測熒光信號，實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析。.位置的邊緣效應(yīng)：指PCR基因擴增儀最外周的樣品孔溫度與中間的樣品孔有差異，不均一，從而導(dǎo)致外周樣品孔的PCR擴增效率不佳，該效應(yīng)稱為“位置的邊緣效應(yīng)”。.模塊溫控模式：儀器根據(jù)探測器直接探測承載樣品金屬基座的溫度進行控制，該模式適用于長時間的靜態(tài)孵育，如連接、酶切、去磷酸化等。.反應(yīng)管溫控模式：儀器根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出樣品管內(nèi)或PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進行控制。三、簡答題.什么是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)？答：PCR技術(shù)的本質(zhì)是核酸擴增技術(shù)，通過加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs,Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)上述“變性-退火-引物一延伸”過程至25-40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)，可以在體外對目的核酸進行大量復(fù)制。.PCR基因擴增儀的工作關(guān)鍵是什么？經(jīng)歷了怎樣一個發(fā)展過程？答：PCR基因擴增儀工作關(guān)鍵是溫度控制。其發(fā)展過程為：水浴鍋PCR儀屬于第一代PCR基因擴增儀，以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個控溫體系；壓縮機PCR儀屬于第二代PCR基因擴增儀，由壓縮機自動控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫較第一代PCR基因擴增儀方便；半導(dǎo)體PCR儀屬于第三代PCR基因擴增儀，由半導(dǎo)體自動控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好；離心式空氣加熱PCR儀屬于第三代PCR基因擴增儀，由金屬線圈加熱，采用空氣作為導(dǎo)熱媒介，溫度均一性好，各孔擴增效率高度一致。.PCR基因擴增儀按照變溫方式的不同可分哪幾類？分別有什么特點。答：PCR基因擴增儀按照變溫方式通常有以下三類：(1)水浴式PCR儀：變溫快、時間準(zhǔn)、溫度均一，但體積大，自動化程度不局。(2)變溫金屬塊式PCR儀：通過半導(dǎo)體加熱和冷卻，并由微機控制恒溫和冷熱處理過程。裝置比較牢固耐用，溫度變換平穩(wěn)，有利于保持TaqDNA聚合酶的活性。(3)變溫氣流式PCR儀：以空氣作為熱傳播媒介，由大功率風(fēng)扇及制冷設(shè)備提供外部冷空氣而制冷。成本較低；安全程度高。微機配上軟件，可靈活編程。.什么是梯度PCR儀？它有什么優(yōu)點？答：梯度PCR儀是由普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴增儀。在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。使用梯度PCR儀，多次實驗可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實驗時間，提高實驗效率，又節(jié)約實驗成本。.何謂熒光實時定量PCR(RQ-PCR)技術(shù)？答：熒光實時定量PCR(real-timequantitativePCR,RQ-PCR)技術(shù)即在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實的反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號，從而實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析。.實時熒光定量PCR儀有哪些種類，各有什么特點？答：目前市場上實時熒光定量PCR儀一般可分三類。(1)金屬板式實時定量PCR儀：可容納的樣本量大，無需特殊耗材，但溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致。(2)離心式實時定量PCR儀：能保障標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間反應(yīng)條件的一致性。但可容納樣品量少，有的需用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本。(3)各孔獨立控溫的定量PCR儀：各孔獨立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測。但是上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高。.PCR基因擴增儀的溫度控制包括哪些方面？答：PCR基因擴增儀的溫度控制是決定PCR反應(yīng)能否成功的關(guān)鍵，主要包括溫度的準(zhǔn)確性、均一性以及升降溫速度等方面。(1)溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性；(2)溫度的均一性是指樣品孔間的溫度差異，關(guān)系到不同樣品孔之間反應(yīng)結(jié)果的一致性；(3)升降溫的速度：升降溫速度快，可以縮短反應(yīng)進行的時間，提高工作效率，并提高PCR反應(yīng)特異性。對梯度PCR儀來說，除此以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。.為什么反應(yīng)管溫控比模塊溫控更準(zhǔn)確？答：反應(yīng)管溫控模式下，儀器根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出樣品管內(nèi)或PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進行控制。由于精確的算法能自動補償時間，確保反應(yīng)混合物按照程序設(shè)定的時間維持預(yù)設(shè)溫度，所以準(zhǔn)確度更高。.實時熒光定量PCR擴增儀的熒光檢測系統(tǒng)主要由哪兩部分組成？答：實時熒光定量PCR擴增儀的熒光檢測系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測器。(1)激發(fā)光源：一般為鹵鴇燈光源或發(fā)光二極管(LED)光源。(2)檢測器：常用的是超低溫CCD成像系統(tǒng)和光電倍增管(PMT)。.PCR擴增儀的熱蓋有什么作用？使用時應(yīng)注意什么？答：目前PCR儀通常都配備熱蓋，可使樣品管頂部溫度達到150c左右，避免蒸發(fā)的反應(yīng)液凝集于管蓋而改變PCR反應(yīng)體積。無需加石蠟油，減少了后續(xù)實驗的麻煩。旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋需注意旋轉(zhuǎn)壓力的控制，過松則使熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；過緊則會導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機械故障。.簡述PCR擴增儀的操作規(guī)程。答：普通PCR擴增儀的操作通常為打開電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲存的程序，運行即可。定量PCR擴增儀的操作一般都是先打開PCR儀電源,再打開相連電腦中的相應(yīng)軟件，分別設(shè)置溫度程序、采集通道，并可根據(jù)不同儀器的要求進行一些特殊設(shè)置，在儀器中放好PCR管，蓋好儀器，運行設(shè)置好的反應(yīng)程序。關(guān)機時通常先關(guān)軟件，再關(guān)PCR儀，最后關(guān)電腦。.定量PCR擴增儀常見故障有哪些，如何解決？答：定量PCR擴增儀常見故障及解決方法為：（1）熒光染料污染樣品孔，解決方法是請工程師清潔樣品孔；（2）PCR管融化，原因可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題，需工程師檢修；（3）個別孔擴增效率差異很大，需工程師檢修；（4