轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因技術(shù)概論分析研究 生物技術(shù)專業(yè)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因技術(shù)概論摘要：近年來生物科學(xué)技術(shù)飛快發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在研發(fā)方面取得了全球化性進(jìn)展，并已顯示了極高的效益，本文綜述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展歷史，重點(diǎn)闡述了轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于動(dòng)物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域的進(jìn)展及突破性成果,尤其在研究基因功能、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種（抗病育種和提高生產(chǎn)性能）、治療人類疾病（生產(chǎn)藥用蛋白和異種器官移植）等方面得到了廣泛的應(yīng)用，并提出了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)存在的一些技術(shù)難題和安全性問題，最后對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的未來發(fā)展進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；生物反應(yīng)器；疾病模型IntroductiontotransgenicanimalsandtechnologyAbstract:Inrecentyears,withtherapiddevelopmentofbiologicalscienceandtechnology,transgenictechnologyhasmadeglobalprogressinresearchanddevelopment,andhasshowngreatbenefits.Thispapersummarizestheprincipleoftransgenictechnologyandthedevelopmenthistoryoftransgenicanimals,focusingontheprogressandbreakthroughachievementsoftransgenictechnologyinvariousfieldsofanimalscience.

Inparticular,itiswidelyusedintheresearchofgenefunction,transgenicanimalbreeding(disease-resistancebreedingandimprovementofproductionperformance),treatmentofhumandiseases(productionofpharmaceuticalproteinandxenotransplantation).

Sometechnicalproblemsandsafetyproblemsoftransgenicanimaltechnologywereputforward.Finally,thefuturedevelopmentoftransgenictechnologywasprospected.Keywords:TransgenicTechnology;TransgenicAnimals;ExperimentalAnimals;Bioreactor;Diseasemodel引言20世紀(jì)生命科學(xué)與技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界對(duì)于生物體的研究從宏觀逐漸發(fā)展到微觀，對(duì)生物體的操作也從隨機(jī)逐漸變?yōu)槎ㄏ蚍肿由飳W(xué)迅速發(fā)展，DNA重組，細(xì)胞融合等技術(shù)日益成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得以誕生，到目前為止，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，其技術(shù)體系也日趨成熟[1]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將人為選擇的優(yōu)質(zhì)外源基因，通過剪切、修飾轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，而達(dá)到人為地改變受體生物性狀的目的。通過這種技術(shù)可將選定的個(gè)體的優(yōu)良基因由一個(gè)生物體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生物體，也可在不相關(guān)的物種之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。通過各種方法將外源性基因插入動(dòng)物生殖細(xì)胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimals）。動(dòng)物個(gè)體被認(rèn)為是生物學(xué)研究，藥物開發(fā)、毒理學(xué)和安全篩選研究中不可或缺的工具，而目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是生物科學(xué)最有效、最令人振奮的研究手段之一。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物品種的改良，生物反應(yīng)器的開發(fā)，人類模型和藥物篩選模型的的建立，以及異種器官供體的構(gòu)建等領(lǐng)域不斷發(fā)展。轉(zhuǎn)基因物種涉及了豬、牛、羊、雞、魚、家蠶、果蠅等，涉及的性狀囊括了生長(zhǎng)、繁殖、抗病、肉質(zhì)、人源化器官、新型藥物等，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所表現(xiàn)出的優(yōu)異表型，展示了其巨大的發(fā)展?jié)摿皬V闊的應(yīng)用前景。但其作為一門新興技術(shù)也給我們帶來了巨大的挑戰(zhàn)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也存在諸多問題，如畸形、生長(zhǎng)遲緩、不育、抗病力差等[2]。所以這些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品如果為人所用，必須通過國(guó)家相應(yīng)的安全評(píng)定[3]。1轉(zhuǎn)基因技術(shù)1.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將人為選擇的優(yōu)質(zhì)外源基因，通過剪切、修飾轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，而達(dá)到人為地改變受體生物性狀的目的。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)在于各種生物的遺傳密碼都是統(tǒng)一的。都是以3個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時(shí)各種生物從DNA到蛋白質(zhì)合成都服從“中心法則”，當(dāng)一個(gè)物種的細(xì)胞內(nèi)加入另一物種或人工合成的DNA（即基因）后就可能產(chǎn)生新的性狀。

1.2轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段轉(zhuǎn)基因技術(shù)涉及外源基因的獲得，DNA的重新組建、重組基因的導(dǎo)入、及轉(zhuǎn)基因受體胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)等方面的研究?jī)?nèi)容。通過基因組編輯技術(shù)（ZFN、TALEN與CRISPR/Cas9）可實(shí)現(xiàn)人為可控地在確定的DNA序列上制造雙鏈斷裂，并定向轉(zhuǎn)入基因。而將基因?qū)胧荏w中并使其發(fā)揮作用主要的技術(shù)包括顯微原核注射法[4]，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法[5]，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法[6]，體細(xì)胞核移植技術(shù)[7]，精子載體法[8]，胞漿內(nèi)單精子注射法[9]，卵母細(xì)胞載體法[10]等。近年來，研究者們?yōu)榱颂岣咿D(zhuǎn)基因效率并將目的片段準(zhǔn)確的整合到特定的基因位點(diǎn)，做了大量的研究工作。2轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因研究的歷史及發(fā)展1966年小鼠卵母細(xì)胞顯微注射開始興起；1968年美國(guó)科學(xué)家Cohen等在研究細(xì)菌的時(shí)，慢慢發(fā)展起來了“重組DNA技術(shù)”；1969年科學(xué)家成功分離出第一個(gè)基因；隨著基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，1974年Jaenisch和Mintz將猿猴空泡病毒（SV40)的DNA注入小鼠胚泡，發(fā)現(xiàn)40％子代鼠的器官中整合有外源基因，并且它們長(zhǎng)至1歲仍沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤跡象，創(chuàng)造了首只轉(zhuǎn)基因小鼠，開啟了科學(xué)技術(shù)的新大門；1980年Gordon等科學(xué)家育成帶有人胸苷激酶(ThymidineKinase，TK)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠;1982年美國(guó)科學(xué)家Palmiter等人采用顯微注射法將大鼠的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥蝎@得了生長(zhǎng)速率快2-4倍，體型大一倍的轉(zhuǎn)基因“超級(jí)小鼠”，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)轟動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)界。此后，轉(zhuǎn)基因迅速發(fā)展并逐步改進(jìn)，廣泛應(yīng)用于生物界，轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物并取得了眾多的矚目成果。1985年獲得了轉(zhuǎn)基因家畜；1987年成功利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了動(dòng)物生物反應(yīng)器；1992年獲得了首只抗病轉(zhuǎn)基因豬；1997年，Wilmut等通過體細(xì)胞核移植技術(shù)率先制作出世界上第一頭轉(zhuǎn)基因克隆羊“多莉”，這是人類首次對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核進(jìn)行移植，同時(shí)也改善了轉(zhuǎn)基因效率低等問題，該實(shí)驗(yàn)也直接證明了轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在更接近人的高等動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)，從而使該技術(shù)更好地為人類服務(wù)[11]。2000年科學(xué)家們利用基因編輯技術(shù)獲得了基因敲除家畜；2001年獲得了首只靈長(zhǎng)類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該成果的突破有利于構(gòu)建更接近人的疾病模型。2006年世界首個(gè)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物—重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名:ATryn）獲得歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(huì)的上市許可，標(biāo)志著通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行藥物生產(chǎn)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段。2015年世界上首例導(dǎo)入外源基因使生長(zhǎng)速度變快的轉(zhuǎn)基因三文魚（商品名:AquAdvanage三文魚）獲得美國(guó)食品和藥品管理局（FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)銷售，是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)層層檢測(cè)最終認(rèn)定其安全性并可供人類食用邁出的關(guān)鍵一步。轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的30余年，培育出的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不計(jì)其數(shù)?？茖W(xué)家們通過體細(xì)胞克隆等技術(shù)培育了轉(zhuǎn)基因等魚、兔子、豬、牛、羊等20多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。其中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究在疾病模型的建立、作為器官移植的供體、動(dòng)物生物反應(yīng)器的構(gòu)建、新品種的培育、以及通過轉(zhuǎn)基因和基因編輯等技術(shù)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)動(dòng)物抗病能力等研究領(lǐng)域都有著深遠(yuǎn)的意義。3轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要應(yīng)用及突破性進(jìn)展3.1轉(zhuǎn)基因在動(dòng)物育種領(lǐng)域的應(yīng)用目前的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育工作主要改針對(duì)善動(dòng)物自身生存能力如提高其對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力、以及增加其抗病及抗寄生蟲能力等、此外也致力于提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生長(zhǎng)速度、提高動(dòng)物源性產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量、減少動(dòng)物排泄物對(duì)環(huán)境污染等工程。3.1.1動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀改良我國(guó)作為人口大國(guó)，食品資源的產(chǎn)量及品質(zhì)是大家一直關(guān)注的話題，提高動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)及產(chǎn)量也一直是科學(xué)研究的重點(diǎn)課題。從人們認(rèn)識(shí)到雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象后，雜交育種作為品種改良的重要手段長(zhǎng)期以來一直被普遍采用，但由于兩親本間的基因交換和轉(zhuǎn)移重組是隨機(jī)發(fā)生的，在親本優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移的同時(shí)，也伴隨其他非優(yōu)良基因的轉(zhuǎn)移，器件還會(huì)發(fā)生大量不定向的變異和非預(yù)期的性狀重組，優(yōu)良品種的選擇不僅耗費(fèi)大量的人力和物力，其育種周期也很長(zhǎng)，很難達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。轉(zhuǎn)基因技術(shù)自開發(fā)以來在改善動(dòng)物各類經(jīng)濟(jì)性狀，如生長(zhǎng)速度加快、瘦肉率提高，肉質(zhì)品質(zhì)提高，飼料利用率提高和抗病力增強(qiáng)等方面不斷取得新進(jìn)展[12]。利用基因敲除、轉(zhuǎn)入功能基因或性狀基因等，可培育出產(chǎn)肉量增加、肉品質(zhì)、產(chǎn)毛率及毛品質(zhì)改善的家畜新品種。豬肉作為我國(guó)主要的肉類食品來源，提高豬的產(chǎn)肉量和瘦肉率是豬育種工作的重要目標(biāo)。2015年，Qian等利用ZFN技術(shù)成功獲得MSTN突變的基因編輯梅山豬，目前已經(jīng)繁育第5代，雙等位突變基因編輯豬育種群瘦肉率顯著提高[13]。Myostatin(MSTN)基因是目前為止發(fā)現(xiàn)唯一對(duì)肌肉生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用，可控制豬個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪沉積，從而改善豬產(chǎn)肉性能。此后，科學(xué)家們通過各種技術(shù)手段獲得MSTN基因編輯豬，有些獲準(zhǔn)開展轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)的中間試驗(yàn)。對(duì)于該基因的編輯也對(duì)牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物實(shí)施操作，并已得到預(yù)期的結(jié)果。2018年，Xiang等利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了IGF2基因第3個(gè)內(nèi)含子一個(gè)保守的SNP位點(diǎn)編輯的巴馬豬。與野生型巴馬豬相比，IGF2基因編輯豬顯著提高了產(chǎn)肉量和瘦肉率[14]。2003年，研究人員在奶牛的胚胎細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了兩種額外的基因：β-酪蛋白和K-酪蛋白，由此培育的轉(zhuǎn)基因奶牛所產(chǎn)的奶中β-酪蛋白含量提高了20%，K-酪蛋白的含量也增加了一倍。該基因牛已完成安全性評(píng)價(jià)，正在推進(jìn)產(chǎn)業(yè)化[15]。不飽和脂肪酸包括ω-3和ω-6，其中ω-3在改善心血管病癥中扮演著重要角色，但由于作為人們使用的動(dòng)物豬牛等牲畜體內(nèi)缺乏將ω-6脂肪酸轉(zhuǎn)化成ω-3脂肪酸的酶[16-17]，導(dǎo)致肉質(zhì)中ω-3含量較低，不能滿足人類健康飲食的需求。2006年，Lai等在豬中過表達(dá)秀麗線蟲Fat-1基因，使豬肉中ω-6脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?3脂肪酸，成功培育出了富含ω-3脂肪酸的轉(zhuǎn)基因豬，在肌肉和脂肪中不飽和脂肪酸含量大幅提高，從而大大提高了豬肉的營(yíng)養(yǎng)健康價(jià)值[18]。最值得一提的是由AquaBountyTechnologoes公司所培育的轉(zhuǎn)基因三文魚（AquAdvantage），該魚主要是應(yīng)用原核注射的技術(shù)，巧妙的將奇努克三文魚的生長(zhǎng)激素基因、大洋鱈魚的抗凍蛋白基因注射到大西洋三文魚的受精卵中，從而獲得的性狀優(yōu)良的新品種[19-20]。野生大西洋三文魚的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)水溫要求高，適應(yīng)環(huán)境能力差，生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)．研究人員將奇努克三文魚的生長(zhǎng)激素基因以及大洋鱈魚的抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入野生三文魚制備了AquAdvantage三文魚，使其適應(yīng)環(huán)境能力更強(qiáng)，生長(zhǎng)速度更快，體型更大，且可全年生長(zhǎng)，上市時(shí)間大大縮短[21-22]。2015年11月16日，美國(guó)FDA發(fā)布公告確定水優(yōu)三文魚與非轉(zhuǎn)基因三文魚一樣安全可以商業(yè)銷售和食用，該轉(zhuǎn)基因三文魚在美國(guó)已經(jīng)獲得權(quán)威機(jī)構(gòu)的最終批準(zhǔn)，首個(gè)獲批供食用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品被端上人類的餐桌，這是世界轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種研究與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的歷史性突破和里程碑事件[23]。世界上第一批轉(zhuǎn)基因魚是由我國(guó)科學(xué)家朱作言率先培育的，這些轉(zhuǎn)基因魚導(dǎo)入了人生長(zhǎng)激素基因后生長(zhǎng)速度增快，餌料轉(zhuǎn)化效率提高，體重均顯著提升，從而降低了成本，縮短了飼養(yǎng)時(shí)間，具有極其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。經(jīng)過后續(xù)發(fā)展，科學(xué)家對(duì)于轉(zhuǎn)基因魚研究使用的過表達(dá)生長(zhǎng)激素基因的載體經(jīng)歷了從使用哺乳動(dòng)物載體到應(yīng)用魚類生長(zhǎng)激素基因及調(diào)控元件的載體這樣一個(gè)過程，從而減弱了對(duì)環(huán)境及生物安全的影響。我國(guó)科學(xué)家已成功獲得多種“全魚”（即轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的構(gòu)成元件均來自于魚類．）轉(zhuǎn)基因魚，如泥鰍、鯉魚、鲇魚、青鳉魚等。這些轉(zhuǎn)基因魚具有很大的發(fā)展空間，將會(huì)創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。3.1.2動(dòng)物轉(zhuǎn)基因抗病育種牲畜及禽類等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物傳染病的爆發(fā)不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且人畜共患病也嚴(yán)重威脅人類的安全。禽流感、布病、瘋牛病和SARS等動(dòng)物源性人畜共患病的多次、重復(fù)性爆發(fā)，引起了全球恐慌?？股氐拇罅渴褂茫瑢?dǎo)致抗生素的殘留及環(huán)境的污染，許多傳染病疫苗的嚴(yán)重匱乏，以及所制備的疫苗頻繁失效，科研人員逐漸意識(shí)到，單純依靠疫苗和藥物治療已經(jīng)無法徹底防控各種傳染病利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)強(qiáng)抗病力新品種成為抗病育種的全新手段與方法。近年來，科研人員在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因抗病育種領(lǐng)域做了大量的研究工作，利用轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)，已在各種牲畜及禽類抗病育種中獲得了突破性的進(jìn)展。豬作為重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物是人類肉類產(chǎn)品的主要來源，豬傳染病的爆發(fā)給人類社會(huì)造成了巨大的損失。其中豬的幾種常見疾病已有重大突破，有些轉(zhuǎn)基因豬已進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn)。藍(lán)耳病全稱豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS），是一種由PRRS病毒引起的繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的傳染病，我國(guó)將其列為二類\t"/item/%E7%8C%AA%E8%93%9D%E8%80%B3%E7%97%85/_blank"傳染病，該病接觸傳染性很高，且具有持續(xù)性感染的特征，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的病毒性疫病之一。研究表明，清道夫受體超家族成員CD163被認(rèn)為是豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）被PRRSV感染和內(nèi)化最重要的受體[24-25]。從2013年起，Prather團(tuán)隊(duì)針對(duì)PRRSV的受體構(gòu)建了多種基因敲除豬[26-28]，發(fā)現(xiàn)CD163第7外顯子結(jié)構(gòu)域5可作為病毒結(jié)合位點(diǎn)，該雙等位基因敲除豬攻毒后未表現(xiàn)出臨床癥狀，具有良好的抗藍(lán)耳病能力。此后，抗豬藍(lán)耳病基因編輯豬育種經(jīng)多家科研機(jī)構(gòu)以及科研院所研究并逐漸發(fā)展成熟，現(xiàn)已成功獲得了抗豬藍(lán)耳病豬群體[29-32]。CD163基因編輯豬與野生型對(duì)照相比，在感染PRRSV后不表現(xiàn)高熱、呼吸障礙癥狀等臨床癥狀，血清指標(biāo)及抗體指標(biāo)均保持正常水平?？谔阋呤怯煽谔阋卟《?Footandmouthdiseasevirus，F(xiàn)MDV)引起的一種偶蹄動(dòng)物急性、高度傳播性疾病。2015年Hu等人成功制備了針對(duì)豬整合素β6亞基FMDV受體的轉(zhuǎn)干擾RNA的轉(zhuǎn)基因豬，該轉(zhuǎn)基因豬有效表達(dá)了針對(duì)豬整合素β6亞基的siRNA，豬整合素β6的RNAi可抑制病毒在豬成纖維細(xì)胞中的繁殖，且該轉(zhuǎn)基因豬不表現(xiàn)出感染病毒后的臨床癥狀和病理特征[33]；隨后Xie等科學(xué)家利用同樣的方法，成功獲得定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)shRNA的抗豬瘟轉(zhuǎn)基因豬，該豬可有效抵抗豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CFSV)的感染[34]。此外，Yan等人通過超表達(dá)抗黏液病毒基因(Myxovirusresistancegene，Mx1)也成功制備有效抑制CFSV繁殖的轉(zhuǎn)Mx1基因豬[35]。非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，阻礙了全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。尤其近些年由于非洲豬瘟的爆發(fā)已嚴(yán)重影響豬養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)狀況。2018年8月3日，首例非洲豬瘟疫情在中國(guó)遼寧省沈陽市確診，隨后迅速蔓延至全國(guó)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。盡管研究人員在免疫佐劑、DNA疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗等方面做了大量的研究工作，但臨床結(jié)果表明這些疫苗均不能發(fā)揮良好的作用[36]。2016年，Lillico等科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，非洲疣豬可攜帶非洲豬瘟病毒卻不發(fā)病，而家豬在感染非洲豬瘟病毒后，死亡率高達(dá)100%。通過基因組測(cè)序分析，家豬和非洲疣豬在RELA基因上存在3個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳差異，這可能是家豬易感ASFV的一個(gè)重要原因。隨后該團(tuán)隊(duì)利用ZFN技術(shù)成功制備將家豬RELA基因的3個(gè)SNP精確替換為非洲疣豬的SNP的基因編輯豬，但其抗病效率還需要進(jìn)一步確認(rèn)。對(duì)于畜牧業(yè)同樣重要的牛也有許多傳染病阻礙著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。乳腺炎是一種由病原體通過乳頭管進(jìn)入乳腺腔引起的乳腺疾病。對(duì)于通過產(chǎn)奶獲得經(jīng)濟(jì)效益的奶牛，乳腺感染會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2005年，DonovanDM等人創(chuàng)造了可在乳腺上皮中表達(dá)溶菌酶并將抗菌肽分泌到牛奶中的轉(zhuǎn)基因奶牛，使奶牛產(chǎn)的乳汁以劑量依賴的方式殺死細(xì)菌，在一定程度上保護(hù)牛免受乳腺炎侵害[37]。瘋牛病(MadCowDisease)，又稱為牛海綿狀腦病(BovineSpongiformEncephali-tis，BSE)，是動(dòng)物傳染性海綿樣腦病(TransmissibleSpongiformEncephalitis，TSE)中的一種，為嚴(yán)重的人畜共患病，它是由朊病毒引起的一種亞急性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其癥狀以神經(jīng)錯(cuò)亂為主并伴隨全身癥狀，以潛伏期長(zhǎng)、死亡率高、傳染性強(qiáng)為特征。2007年，Richt等利用基因打靶技術(shù)獲得了瘋牛病相關(guān)基因（PRNP）雙位點(diǎn)敲除的轉(zhuǎn)基因牛，牛的臨床、生理、組織病理、免疫和繁殖正常，且其腦組織勻漿對(duì)朊病毒的體外繁殖有抵抗力[38]。此外在羊，雞等常見畜牧業(yè)動(dòng)物中抗病育種的研究也取得了較大的成果。2011年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得過表達(dá)TLR4基因的轉(zhuǎn)基因綿羊，該轉(zhuǎn)基因羊在病毒攻擊后，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的急性炎癥反應(yīng)，從而加大了對(duì)病原體的清除能力；英國(guó)羅斯林研究所獲得了表達(dá)抗IBV的小RNA轉(zhuǎn)基因雞，對(duì)轉(zhuǎn)基因雞免疫細(xì)胞體外進(jìn)行IBV攻毒后，IBV病毒的復(fù)制明顯減弱，急性期的炎癥因子明顯降低，表現(xiàn)出了良好的抗病毒復(fù)制特征。我國(guó)是世界上畜禽養(yǎng)殖數(shù)量最多的國(guó)家，高密度、集約化飼養(yǎng)為病原體快速傳播與突變提供了合適條件，各種傳染病的爆發(fā)對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)，社會(huì)等方面都造成巨大影響，因此抗病育種研究十分重要。3.2轉(zhuǎn)基因在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用3.2.1生物反應(yīng)器應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因藥物是一種全新的生物藥物生產(chǎn)模式具有成本低，效益高和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展和人們對(duì)重組蛋白藥物的接受逐漸提高，利用動(dòng)物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白的研發(fā)工作已在各領(lǐng)域取得進(jìn)展。從1987年Gordon等人在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中得到人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子，到現(xiàn)在已有數(shù)十種人體蛋白在家畜乳腺中表達(dá)，這些蛋白可以用于治療人類相關(guān)疾病，其中組織溶酶原激活因子（tPA）、a1胰蛋白酶（a1-AT）及抗凝血酶Ⅲ、人血紅蛋白（Hb）、人乳鐵蛋白（LF）等已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，其中血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶等表達(dá)已經(jīng)達(dá)到商業(yè)化水平。目前，國(guó)際上主要的動(dòng)物生物反應(yīng)器包括山羊、奶牛、豬、兔、小鼠、家蠶等，主要利用血液系統(tǒng)、動(dòng)物膀胱、禽類的卵及哺乳動(dòng)物乳腺等生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物[39]。1990年12月，荷蘭Pharming公司用酪蛋白啟動(dòng)子與人乳鐵蛋白(hLF)的cDNA構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體，并通過顯微注射法獲得了世界上第一頭轉(zhuǎn)基因公牛。該公牛與非轉(zhuǎn)基因母牛生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因后代中1/4后代母牛乳汁中表達(dá)了人乳鐵蛋白[40]。2006年6月，美國(guó)GTC公司利用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的世界首個(gè)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥物-重組人抗凝血酶Ⅲ（ATryn，一種可供人類使用的抗凝血藥，既能用于冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)，又能治療燒傷、敗血病等）已在歐洲和美國(guó)上市。人血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，在維持血液滲透壓、體液平衡和營(yíng)養(yǎng)供給等方面具有重要功能，在臨床上可以治療失血、創(chuàng)作等引起的休克或水腫等病癥[41]。Peng等人，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，首次構(gòu)建豬乳腺反應(yīng)器，生產(chǎn)人重組血清白蛋白[42]，此后Li等，利用TALEN技術(shù)成功制備在血液中高表達(dá)人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因豬[43]。我國(guó)在醫(yī)藥保健和疫苗制備等領(lǐng)域開展轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研發(fā)，并取得了驚人的成成就，我國(guó)已經(jīng)在牛、羊、豬等動(dòng)物體內(nèi)成功表達(dá)了許多貴重的藥用蛋白，如抗腫瘤蛋白、提高免疫力蛋白、疾病治療相關(guān)蛋白等。1983年我國(guó)成功獲得表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧院士等在2005年利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)，分別獲得了導(dǎo)入“人乳鐵蛋白”、“人α-乳清白蛋白”、“溶菌酶”及“巖藻糖化蛋白”的轉(zhuǎn)基因牛，這幾種蛋白是人乳中重要的營(yíng)養(yǎng)保健成分，有多種抗菌和抗癌等藥用功能，這些成果為開發(fā)“人乳化”牛奶提供了航向。2008年獲得首例胚胎冷凍保存的體細(xì)胞克隆牛和首例攜帶有人胰島素基因的轉(zhuǎn)基因克隆牛。此外我國(guó)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)還獲得了乳腺中高表達(dá)可治療人B淋巴細(xì)胞癌等惡性腫瘤的CD20蛋白的轉(zhuǎn)基因牛以及含有轉(zhuǎn)乳糖分解酶基因的克隆牛。2009年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得富含人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因牛，該轉(zhuǎn)基因牛分泌乳鐵蛋白含量達(dá)到目前國(guó)際報(bào)道的最高水平，在國(guó)際上處于領(lǐng)先地位[44-45]。目前，進(jìn)入臨床試驗(yàn)的動(dòng)物生物反應(yīng)器重組蛋白藥物已達(dá)100多種，全球從事動(dòng)物生物反應(yīng)器研發(fā)的企業(yè)有20多家，包括5家上市公司?？梢姡ㄟ^轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建動(dòng)物生物反應(yīng)器具有重大的科學(xué)意義以及廣闊的發(fā)展前景。3.2.2異種器官移植器官移植供體短缺一直是人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大難題，而異種器官移植可能是解決此問題的有效途徑。動(dòng)物異種器官移植供體研究主要是建立基因改造的克隆豬作為異種移植的供體。以豬作為異種器官移植的供體不僅因?yàn)槠湓隗w型大小、生理?xiàng)l件、器官發(fā)育和疾病發(fā)展等方面與人類相似，而且豬易于繁殖，供應(yīng)量大，費(fèi)用低廉，產(chǎn)業(yè)化的前景甚為樂觀，以豬作為器官供體還可避免靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為異種供體源的倫理問題，因此豬是人類異種器官來源的良好供體。但以異種動(dòng)物豬作為器官移植的供體面臨著許多問題，如會(huì)發(fā)生超急性排斥反應(yīng)(hyperacuterejection，HAR)、急性血管性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)等，并且豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Porcineendogenousretroviruses，PERVs)對(duì)病人也具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此科學(xué)家通過基因編輯轉(zhuǎn)基因等技術(shù)建立“器官巢”，并排除可能阻礙器官移植的干擾因素，為下一步利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得異種器官移植供體豬奠定了基礎(chǔ)。隨著動(dòng)物基因編輯和胚胎發(fā)育基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展，豬人源化器官再造技術(shù)為人類器官移植提供了一個(gè)新的解決思路。2010年，Kobayashi等人用大鼠ESCs囊胚嵌合彌補(bǔ)了Pdx1基因敲除小鼠的胰腺缺陷，獲得了長(zhǎng)有大鼠胰腺的小鼠[46]；2013年，Matsunari等人利用豬正常裂球彌補(bǔ)了Pdx1基因敲除豬的胰腺缺陷[47]。從理論上講，使用人的胚胎干細(xì)胞或iPS細(xì)胞系與人源化器官缺失動(dòng)物嵌合，可以獲得由人細(xì)胞組成的胰腺器官，該器官在向人移植是可以避免異種移植時(shí)免疫排斥危害。2003年，美國(guó)密蘇里大學(xué)哥倫比亞分校研究團(tuán)隊(duì)培育的a-1，3-半乳糖苷酶基因（α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除豬，基本上解決了異種器官移植超急性排斥反應(yīng)。2017年云南大學(xué)魏紅江課題組生產(chǎn)出世界首例內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcineendogenousretroviruses，PERVs）基因敲除豬，研究團(tuán)隊(duì)通過CRISPR/Cas9技術(shù)在整個(gè)基因組同時(shí)滅活了PERVs的全部62個(gè)拷貝，被編輯細(xì)胞的PERVs轉(zhuǎn)染效率降低了1000倍[48]。來自這些低免疫排斥無內(nèi)源病毒的基因修飾豬的多種器官，例如肝、腎、肺和胰腺等已被嘗試移植至多種靈長(zhǎng)類動(dòng)物，并成功延長(zhǎng)多種受體動(dòng)物的存活時(shí)間。此外科研人員也通過各種轉(zhuǎn)基因及基因編輯手段提高基因編輯后供體器官在受體中正常存活并發(fā)揮功能的能力。3.2.3人類疾病模型及藥物篩選模型的構(gòu)建目前，很多研究表明絕大多數(shù)疾病與基因遺傳均有一定程度的相關(guān)性，通過以轉(zhuǎn)基因可以精確地失活或增強(qiáng)某些基因的表達(dá)，以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為疾病模型研究遺傳與疾病的關(guān)系，比其他方法有優(yōu)勢(shì)，它可以在動(dòng)物原來遺傳背景的基礎(chǔ)上，通過改變某種基因的表達(dá)水平而用以研究外源基因在整體動(dòng)物中的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，對(duì)于開展病理研究與新藥篩選，闡明遺傳改變所產(chǎn)生的效應(yīng)，確定致病基因的功能和致病機(jī)理，從而預(yù)防與治療疾病有重要意義，且具有篩選準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、試驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)勢(shì)[49]。目前已經(jīng)建立起了各種人類遺傳病的模型，包括老年性癡呆癥、帕金森病、關(guān)節(jié)炎、肌肉營(yíng)養(yǎng)缺乏癥、腫瘤發(fā)生、高血壓模型等；此外還有許多藥物篩選模型。豬的生理學(xué)、解剖學(xué)和遺傳學(xué)特征與人類非常接近，是一種研究人類疾病的最佳動(dòng)物模型。2011年，Yang等利用ZFN技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功構(gòu)建出PPARγ基因敲除豬，研究發(fā)現(xiàn)該豬較好地?cái)M合了人類心血管疾病病癥，為研究PPARγ在人類心血管疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)[50]。2014年，Hai等通過基因編輯高效制備了vWF雙等位敲除基因的廣西巴馬小型基因編輯豬，該豬出現(xiàn)嚴(yán)重的凝血功能障礙，與血管性血友病患者的臨床表現(xiàn)相似，這將為人類Ⅰ型和Ⅲ型血管性血友病的病理研究及治療提供重要的模型支撐[51]。針對(duì)許多神經(jīng)退行性疾病，包括肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)、亨廷頓舞蹈癥(Huntington’sdisease，HD)的動(dòng)物疾病模型也已建立，并在病理研究及治療方面發(fā)揮了巨大作用。此外，2010年中科院昆明動(dòng)物研究所成功培育出中國(guó)首例轉(zhuǎn)基因獼猴，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的研制成功為人類重大疾病研究奠定了重要基礎(chǔ)。對(duì)于致癌試驗(yàn)常用的模型為轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括Tg，rasH2模型、p53+/-敲除小鼠模型、Tg，AC模型以及XPA敲除模型等[52]，但目前使用較為廣泛的模型是Tg，rasH2模型，其次是p53+/-敲除小鼠模型。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型開展致癌試驗(yàn)，較普通嚙齒類動(dòng)物而言具有動(dòng)物用量少、試驗(yàn)周期短、費(fèi)用低、特異性及敏感性高等多個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)，且該類模型符合國(guó)際上通行的3R原則要求。4轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)及安全性問題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的操作成功率極低，基因整合的機(jī)制尚不清楚，轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為難以控制。轉(zhuǎn)基因在插入宿主基組的過程中可能導(dǎo)致內(nèi)源基因的破壞或失活，也可能激活原本處于關(guān)閉狀態(tài)的基因（尤其是癌基因）。其結(jié)果將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體出現(xiàn)不育、胚胎死亡、四肢畸形等異常。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的外源基因轉(zhuǎn)入的效率低，且即使成功轉(zhuǎn)入的基因由于機(jī)體內(nèi)的排異機(jī)制很有可能不久后便沉默了；當(dāng)構(gòu)建生物反應(yīng)器時(shí)，存在轉(zhuǎn)基因效率低，外源基因表達(dá)量低以及蛋白質(zhì)沒有正確折疊等問題。而建立藥物篩選模型時(shí)也常常存在假陽性等問題，此外人們最關(guān)注的是轉(zhuǎn)基因的安全性問題，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物器官移植可能會(huì)增加“人獸共患”病的傳播機(jī)會(huì)，轉(zhuǎn)基因食品帶來的非期望效應(yīng)是不可預(yù)測(cè)的，如果不經(jīng)過嚴(yán)格的安全審查直接進(jìn)入市場(chǎng)，可能會(huì)帶來安全隱患如可能使食用者中毒或發(fā)生過敏反應(yīng)等，有人指出因?yàn)閯?dòng)物的生存周期長(zhǎng)，某些轉(zhuǎn)入基因的特征可能導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)對(duì)獸藥、重金屬等外源化學(xué)物質(zhì)的累積，從而增加人類患病風(fēng)險(xiǎn)。此外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物攜帶外源基因，釋放至環(huán)境中可能通過雜交導(dǎo)致“基因逃逸”，使外源基因轉(zhuǎn)到其野生近緣種造成“基因污染”，危及生物多樣性安全。5展望技術(shù)的發(fā)明和成果的創(chuàng)新都推進(jìn)人類及社會(huì)的發(fā)展，然而任何一種新技術(shù)都會(huì)存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)性?？刂频卯?dāng)會(huì)給生活帶了便利，相反，則有可能會(huì)帶來災(zāi)難性后果。面對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)，既要保障生物技術(shù)的健康發(fā)展，又要制定嚴(yán)格的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食用安全評(píng)價(jià)體系，全面的評(píng)估轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來的風(fēng)險(xiǎn)。從而公正科學(xué)地引導(dǎo)大眾了解轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品安全性，并可更好的推進(jìn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。首個(gè)被美國(guó)FDA獲批供食用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(水優(yōu)三文魚）產(chǎn)品被端上人類的餐桌，這是世界轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種研究與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的歷史性突破和里程碑事件，這很大程度上鼓舞了轉(zhuǎn)基因行業(yè)的發(fā)展。通過科學(xué)地使用新型技術(shù)手段并且制定嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u(píng)價(jià)體系，可讓新型技術(shù)更換好地為人類為社會(huì)服務(wù)。

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