農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法及轉(zhuǎn)基因植物檢測方法

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法及轉(zhuǎn)基因植物檢測方法摘要：近年來，植物基因工程技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物在很多領(lǐng)域的研究推廣取得了令人矚目的成績。植物基因工程中常用的轉(zhuǎn)化方法一般是通過土壤農(nóng)桿菌系統(tǒng)、植物病毒系統(tǒng)和DNA直接導入法這三種方法進行。另外，轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展的同時轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)也在不斷地進步和完善，目前被廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因植物檢測方法有三類：整合水平上的檢測、轉(zhuǎn)錄水平上的檢測和表達水平上的檢測。本文著重對農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)基因植物的檢測兩方面進行綜述。關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植物，檢測方法伴隨著生命科學的飛速發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)以及植物組織分化、植物基因重組等技術(shù)發(fā)展迅速并得到廣泛應(yīng)用。1984年轉(zhuǎn)基因煙草的誕生［1］,使外源基因?qū)胫参锛毎麖亩@得轉(zhuǎn)基因新品種的設(shè)想成為現(xiàn)實。隨后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個方面如：植物新品種的改良、植物性狀改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等［2-4］0新型轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因番茄及轉(zhuǎn)基因玉米等轉(zhuǎn)基因新品種陸續(xù)面世［5］0植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)不但能夠打破植物的物種界限，還能夠使物種基因彼此進行交流。使植物育種年限縮短，植物育種進程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使來自于不同生物種類的優(yōu)良目的基因?qū)胫参锊⒌玫絻?yōu)良植物新品種。同時，運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究植物自身基因結(jié)構(gòu)組成及其基因功能調(diào)控等方面也取得了一定成果；運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)還研制出生物反應(yīng)器和雄性不育系［6］。目前，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)胫参锘蚪M中的常用方法主要有：土壤農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化、DNA直接導入和植物病毒系統(tǒng)介導法。本文著重介紹土壤農(nóng)桿菌介導的目的基因轉(zhuǎn)化法，同時也對目前轉(zhuǎn)基因植物的檢測進行適當總結(jié)。土壤農(nóng)桿菌介導系統(tǒng)的種類土壤農(nóng)桿菌中的發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌能夠侵染植物傷口并形成與土壤農(nóng)桿菌中大質(zhì)粒有關(guān)的植物月中瘤和冠嚶能夠誘發(fā)此類月中瘤的根瘤農(nóng)桿菌中常常農(nóng)桿菌中大質(zhì)粒有關(guān)的植物月中瘤和冠嚶能夠誘發(fā)此類月中瘤的根瘤農(nóng)桿菌中常常帶有分子量為200-250kb的Ti質(zhì)粒。研究者對不同株系的根癌農(nóng)桿菌進行比較得出結(jié)論：Ti質(zhì)粒通常有四個同源區(qū)，T-DNA和Vir區(qū)與植物月中瘤的形成有關(guān)，另外兩個區(qū)與目的基因的接合轉(zhuǎn)移以及質(zhì)粒自身復制有關(guān)。根癌農(nóng)桿菌中的T-DNA進入植物細胞后，可以自行插入植物染色體的基因組，改變基因組結(jié)構(gòu)組成。而發(fā)根農(nóng)桿菌侵染寄主植物后，Ri質(zhì)粒將會誘發(fā)植物被侵染部位產(chǎn)生大量毛狀根。Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)根癌農(nóng)桿菌侵染植物細胞時將根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA插入植物基因組中，以此來改變植物基因組的組成。位于T-DNA上的基因能夠編碼控制植物生長素和植物細胞分裂素的合成，使被侵染的植物細胞過度增殖而產(chǎn)生瘤。同時T-DNA編碼合成的Opines化合物，可以被農(nóng)桿菌利用并作為碳氮來源。因此農(nóng)桿菌和寄主植物能夠形成彼此互利和共生的密切關(guān)系。大量研究數(shù)據(jù)表明，農(nóng)桿菌中負責T-DNA轉(zhuǎn)移的有三種組分：Ti質(zhì)粒上的T-DNA、Ti質(zhì)粒上的vir基因序列和chv基因序列。由25個不完整的堿基對順向重復構(gòu)成了T-DNA,通常T-DNA編碼產(chǎn)生的基因序列不能促使自身轉(zhuǎn)移，因此在插入目的基因的過程中可以去掉T-DNA原有內(nèi)部基因；vir基因序列通常位于T-DNA外。寄主植物被農(nóng)桿菌侵染后，傷口會分泌出許多化合物，這些化合物與編碼vir基因的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生T-DNA拷貝并被導入寄主細胞中。Chv基因通常與細菌趨化性和受傷植物細胞粘附性有關(guān)，與T-DNA的轉(zhuǎn)移也有著密切聯(lián)系。但在轉(zhuǎn)基因過程中，將野生型Ti質(zhì)粒作為植物載體存在著很多弊端：Ti質(zhì)粒的分子量過大，常規(guī)實驗方法難以操作，在T-DNA片段上無法找到用于插入外源DNA片段的單一限制性內(nèi)切酶位點；另外將可能誘發(fā)冠嚶病的Ti質(zhì)粒導入健康的植物細胞組織后，很大可能會導致植物的病態(tài)。因此，經(jīng)過改良后的Ti質(zhì)粒才能夠被運用于基因克隆中。目前，對野生型Ti質(zhì)粒進行改良得到兩種載體系統(tǒng)：共和載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。共和載體系統(tǒng)共和載體系統(tǒng)又被稱作one-載體法，此方法將Ti質(zhì)粒作為給體載體，利用給體載體上的Vir區(qū)域進行T-DNA轉(zhuǎn)移。將外源目的基因與大腸桿菌的常用質(zhì)粒pBR322進行連接，形成中間載體，將給體載體與中間載體進行同源重組以此替代給體載體中可缺失的T-DNA片段，最終形成共合體載體。共和載體中包含了目的基因片段及全部的中間質(zhì)粒片段，這樣會導致后期的結(jié)果分析復雜化。而隔端載體的出現(xiàn)很好地解決了這一難題。隔端載體是將兩個T-DNA上的LB和RB分別放置于給體載體和中間載體上，進行同源重組后，目的基因便只存在于轉(zhuǎn)移片段上，此方法優(yōu)化了裝個轉(zhuǎn)化體系[7]o雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)由輔助載體和雙向載體兩個載體組成，這兩種載體是彼此相容的兩個Ti質(zhì)粒。輔助載體上的Vir區(qū)域可輔助T-DNA的轉(zhuǎn)移，雙向載體通常寄主范圍廣，帶有T-DNA片段并可作為DNA轉(zhuǎn)移載體。當外源基因連接到雙向載體后，雙向載體因其分子量小具備易于復制的優(yōu)點，在大腸桿菌中大量復制，從而得到更多的目的基因。雙元載體在不用構(gòu)建質(zhì)粒共合體的同時避免了共和載體系統(tǒng)可能出現(xiàn)的同源區(qū)問題。雙元載體上的多克隆位點和植物選擇標記基因有利于后期的植物篩選，細菌選擇標記基因有利于對轉(zhuǎn)化菌種的選擇，達到了“三菌結(jié)合”。隨著雙元載體系統(tǒng)的快速發(fā)展，PART27通用雙元載體質(zhì)粒應(yīng)運而生。該質(zhì)粒上帶有CaMV35S啟動子、RK和ColEl復制子、多克隆位點以及章魚堿合成酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列，其中RK和ColEl復制子能夠應(yīng)用于高拷貝復制中。此外PART27通用雙元載體質(zhì)粒上的壯觀霉素和鏈霉素抗性基因可以輔助在大腸桿菌中的篩選。當今，雙元載體系統(tǒng)在農(nóng)桿菌介導系統(tǒng)中已被廣泛應(yīng)用網(wǎng)。Ri質(zhì)粒載體系統(tǒng)發(fā)根農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)?？梢詷?gòu)建出完整的onc+載體，Ti質(zhì)粒則不能進行。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物時，在Ri質(zhì)粒的誘導作用下，傷口產(chǎn)生大量毛狀根，毛狀根在植物激素的進一iM乍用下分化，形成可育的完整個體。但目前對于發(fā)根農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)粒的研究還只停留在研究次生代謝物和根瘤形成原因上，Ri質(zhì)粒系統(tǒng)的研究較少。根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方式根癌農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，將T-DNA導入植物基因組中，這個過程非常復雜。植物傷口處會分泌一些小分子酚類化合物，這些化合物能夠?qū)⑥r(nóng)桿菌粘連在植物細胞表層類似玻連蛋白的分子。植物傷口附近是一種高濃度酸性環(huán)境，并且有大量多酚化合物，這些因素能夠促使農(nóng)桿菌中vir基因表達。VirA接收這一信號后，Vir蛋白自發(fā)地酸化，同時VirG也發(fā)生酸化，進而形成VirA-VirG雙組分轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)。各vir基因啟動子區(qū)域的共有序列vir框在VirG作用后，其它vir基因也發(fā)生表達。產(chǎn)生具有內(nèi)切酶活性的VirDl/VirD2,VirDl作用于T-DNA右端使其形成切口，VirD2蛋白隨即結(jié)合于T-DNA切口處5-端，形成“引導末端”，最后形成的單鏈T-DNA很可能帶有單鏈結(jié)合蛋白VirD2。VirD2蛋白與T-DNA結(jié)合后，使T-DNA在一定程度上避免核酸酶降解。virB位點的11個ORF能夠合成蛋白通道，T-DNA經(jīng)過此通道進入植物細胞，最后在VirD2和VirE2發(fā)出的核蛋白信號指引下進入細胞核，整合入植物染色體基因組。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化就是通過細菌間接合，利用大腸桿菌將帶有目的基因的克隆載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，以農(nóng)桿菌為媒介最終進入植物細胞。將外源目的基因?qū)胫参锘蚪M的方法主要有三種：活體接種法、共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法和葉盤轉(zhuǎn)化法?；铙w接種法活體接種法是利用儀器在植物幼株表皮形成傷口，在植株傷口處直接涂抹大量新鮮培養(yǎng)的土壤農(nóng)桿菌菌液，傷口感染農(nóng)桿菌后將產(chǎn)生月中瘤。近年來運用微波轟擊法在煙草和向日葵頂端制造細小傷口用于農(nóng)桿菌侵染，轉(zhuǎn)化效率明顯提高[9]共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法依據(jù)受體水平的不同，共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法可分為愈傷組織共培養(yǎng)、原生質(zhì)體共培養(yǎng)和懸浮細胞共培養(yǎng)。原生質(zhì)體共培養(yǎng)能形成單細胞愈傷組織，即形成的轉(zhuǎn)基因植株由一個轉(zhuǎn)化細胞增殖產(chǎn)生，大多發(fā)生在單細胞或者雙細胞階段，這種方法具有很好的轉(zhuǎn)化效率，使用較廣泛。葉盤法選取植物無菌的葉片，剪成1cm2左右的葉盤，放入事前準備好的一定濃度的農(nóng)桿菌菌液中進行侵染處理。將處理完的葉盤依次放入濾菌培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)，直到長出幼嫩植株后移入土壤中進行培育。由于葉盤法操作簡單，周期短易于重復操作，目前己被廣泛應(yīng)用于實驗室常規(guī)培育。其它運用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方法電穿孔法是將Ti質(zhì)粒作為一種DNA分子，導入花粉后利用花粉的再生能力獲得完整植株。利用電穿孔技術(shù)使植物細胞在一定程度上損傷，用土壤農(nóng)桿菌對其進行感染，從而達到農(nóng)桿菌侵染的目的。在帶有冠嚶組織的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)白蠅，白蠅吸收的營養(yǎng)成分中帶有用于轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌，利用白蠅的傳播過程將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入植株［10］。但是在單子葉植物中農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法往往不能發(fā)揮作用。當根癌農(nóng)桿菌感染大多單子葉植物傷口時，傷口處沒有發(fā)生任何變化。有報道指出，單子葉植物中用于轉(zhuǎn)化的靶組織或者細胞與細菌不能有效的進行粘連，如果選取分生能力強的靶組織細胞將能^^有效地解決這一難題。另外，T-DNA在雙子葉植物和單子葉植物中存在著一定的整合差異。近年來利用農(nóng)桿菌LBA4404侵染多種水稻盾片的愈傷組織獲得很大成功，使農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法在單子葉植物中的研究進展更進一步［11］。轉(zhuǎn)基因植株檢測技術(shù)隨著植物基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗病蟲等優(yōu)良特性的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物出現(xiàn)，同時轉(zhuǎn)基因植物的檢測技術(shù)也得到快速發(fā)展和提高。轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)通常在整合水平、轉(zhuǎn)錄水平和表達水平三個方面進行。整合水平上的檢測有PCR檢測、Southernblot檢測和染色體原位雜交檢測；轉(zhuǎn)錄水平上的檢測有RT-PCR檢測、Northernblot檢測；表達水平上的檢測有組織化學染色檢測、Westernblot檢測、熒光蛋白檢測、ELISA檢測、葉片涂抹除草劑檢測和葉片退綠檢測等。下面著重介紹整合水平上的檢測。PCR檢測20世紀80年代Mullis發(fā)明了一種體外核酸擴增技術(shù)即聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。該技術(shù)用少量外源DNA作為模板，加入該基因的特異性引物，在DNA聚合酶的作用下經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適度延伸的循環(huán)反應(yīng)，使目的基因得以快速擴增。根據(jù)目的基因或標記基因設(shè)計出PCR引物，從轉(zhuǎn)基因作物中能夠擴增出外源目的基因片段，而非轉(zhuǎn)基因作物則不能。目前PCR技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于外源目的基因檢測、目的基因標記、基因分離克隆等多個領(lǐng)域。Southernblot檢測1975年Southern提出DNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)即Southernblot[12],是將DNA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后進行瓊脂糖凝膠電泳，待變性后用高鹽緩沖液將凝膠中DNA片段轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上，變性后的DNA單鏈即與薄膜結(jié)合，經(jīng)過烘烤單鏈固定在膜上，最后與帶有放射性標記的探針雜交，檢測與探針有同源性的DNAo之后Sambrook對Southernblot檢測技術(shù)進行了一定的改進[13],在目的基因附近選擇具單切位點的內(nèi)切酶對基因組DNA酶切，將標記好的基因片段作為探針與處理過基因組DNA進行雜交。含目的基因的基因組片段與探針能夠發(fā)生同源重組并顯示出雜交信號，利用雜交信號便可以分析出轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的拷貝數(shù)。Ortiz利用Southernblot檢測技術(shù)對使用基因槍法轉(zhuǎn)入小麥中的hpt基因和bar基因進行檢測，得出外源基因在小麥中能進行穩(wěn)定整合且hpt作為篩選標記可行。Cheng利用Southernblot檢測技術(shù)對農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因小麥進行檢測，得知外源基因穩(wěn)定整合且單拷貝整合植株達到了35%[14]。Hu利用Southernblot檢測技術(shù)對農(nóng)桿菌介導法和基因槍法進行比較得出：農(nóng)桿菌介導法得到的轉(zhuǎn)基因植株整合拷貝數(shù)少，質(zhì)量高[15-16]。葉興國對多種轉(zhuǎn)基因作物進行Southernblot檢測得出了大量外源基因拷貝數(shù)在寄主植物中的遺傳規(guī)律[17]0染色體原位雜交技術(shù)染色體原位雜交技術(shù)是以Southernblot和Northernblot技術(shù)為基礎(chǔ)形成的，是細胞學、分子生物學和組織化學三者共同結(jié)合的產(chǎn)物，在重復DNA序列物理作圖、多拷貝基因家族物理作圖、低拷貝或單拷貝DNA序列定位等多方面得到應(yīng)用。染色體原位雜交技術(shù)是根據(jù)堿基互補配對原理，將DNA用熒光素、同位素和Gimsa進行標記做成探針，再將標記好的探針與變性后的DNA染色體雜交，具有同源序列的DNA進行配對后,目標DNA在染色體上面的物理位置即清晰可見。早期，植物染色體附加系、代換系和易位系的鑒定通常需要使用原位雜交技術(shù)，近年來原位雜交技術(shù)同時被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物檢測中。位置效應(yīng)通常在植物基因表達中非常重要，外源基因在寄主細胞中的具體位置不但影響外源基因在植物中的表達，同時對植物自身內(nèi)在基因的表達也有著一定影響。通過原位雜交檢測技術(shù)得到的雜交信號能夠充分證明外源基因已成功轉(zhuǎn)入植物染色體上，再利用核型分析和分子標記法就能夠確定外源基因的具體位置[18]°Pederde制究出轉(zhuǎn)基因大麥、轉(zhuǎn)基因小黑麥和轉(zhuǎn)基因小麥中外源基因的具體位置、包含外源基因的染色體、外源基因的整合位點及整合形式[19]。針對轉(zhuǎn)GUS、bar、hpt的多基因水稻JDV88、92、105、JDTA44進行原位雜交檢測得出T-DNA的插入位點及其拷貝數(shù)[20]。Chen對轉(zhuǎn)GFP基因的4個大麥株系進行原位雜交試驗確定了GFP在各個株系中的整合染色體及拷貝數(shù)[21]。Anand對轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因和葡萄糖酶基因的兩種小麥進行熒光原位雜交檢測，得出外源基因全為單拷貝且全部整合到寄主染色體頂端田。參考文獻Herrera-EstrelIaL,VandenBroeckG,MaenhautR.Expressionofforeigngenesinregeneratedplantsandintheirprogeny[J].Nature,1984,310:115-120.DunsmuirP.Themolecularbasisofsulfonylureaherbicideresistanceintobacco[J].PlantMolecularBiologyManual,1988,1-17.SouthgateEM,DaveyMR,PowerJB.Factorsaffectingthegeneticengineeringofplantsbymicroprojectilebombardment[J].BiotechnologyAdvances,1995,13:631-651.GasserCS,FraleyRT.GeneticallyEngineeringPlantsforCropImprovement[J].Science,1989,244:1293-1299.AngelisK,BrizaJ,SatavaJ.T-DNAintegration:amodeof川egitimaterecombinationinplants[J].MutationResearch,1992,273(3):271-280.MarianiC,DeBeuckeerM,TruettnerJ.Inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene[J].Nature,1990,347:737-741.GriersonD[M].PlantGeneticEngineering.1991,(11):49-51.GleaveAP.AversatilebinaryvectorsystemwithaT-DNAorganisationalstructureconducivetoefficientintegrationofclonedDNAintotheplantgenome[J].PIantMolecularBiology,1992,20(6):1203-1207.BidneyD,ScelongeC,MartichJ.MicroprojectilebombardmentofplanttissuesincreasestransformationfrequencybyAgrobacteriumtumefaciens[J].PlantMolecularBiology,1992,18(2):301-313.ZeidanM,CzosnckH.Mappingandintrogressionofatomatoyellowleafcurlvirustolerancegene,TY-1[J].MolPlantMicrobeInteract,1994,7(6):792-798.HieiY,OhtaS,KomariT.EfficienttransformationofricemediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofT-DNA[J].PlantJournal,1994,6(2):271-282.SouthernEM.DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis[J].MolBiol,1975,98:503-517.SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning:ALaboratoryManual[M].NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989:281-289.ChengM,FryJE,PanS.GeneticTransformationofwheatmediatedbyAgrobacterium[J].PlantPhysiol,1997,15(3):971-980.HuT,MetzS,ChayC.Agrobacterium-mediatedlarge-scaletransformationofwheat(Triticumaestivum)usingglyphosateselection[J].PlantCellReports,2003,21:1010-1019.VladimirS,LarryG,PrinceA.Agrobacterium-mediatedtransformationofseedling-derivedmaizecallus[J].PlantCellRep