食品微生物學第六章詳解演示文稿

食品微生物學第六章詳解演示文稿第一頁，共一百三十五頁。優(yōu)選食品微生物學第六章第二頁，共一百三十五頁。傳統(tǒng)食品微生物檢測：以分離、純化、培養(yǎng)為基礎現(xiàn)代食品微生物檢測：新理論、新技術遺傳學特性、細胞組分、數(shù)值分類快速、靈敏、特異第三頁，共一百三十五頁。第一節(jié)食品中微生物數(shù)量的檢測方法檢測食品中微生物總數(shù)的方法：1）活細胞的標準平板計數(shù)法（Standardplatecount,SPC）2）最近似數(shù)測定法（mostprobablenumber,MPN）第四頁，共一百三十五頁。檢測食品中微生物總數(shù)的方法：3）染色還原技術估算具有還原能力的各種細胞的總數(shù)4）顯微鏡直接計數(shù)法（DMC）第五頁，共一百三十五頁。一、傳統(tǒng)的SPC方法活細胞的標準平板計數(shù)法（Standardplatecount,SPC）菌落總數(shù)計數(shù)法“活菌”標準方法意義：判定食品被微生物污染的程度及衛(wèi)生質量，也可觀察微生物在食品中生長繁殖的動態(tài)。第六頁，共一百三十五頁。菌落總數(shù)：在一定條件下（需氧、溫度、時間、pH…)每克（每毫升）食品檢驗所生長出來的CFU（菌落形成單位）。第七頁，共一百三十五頁。國標規(guī)定：在需氧條件下：細菌NA37℃48h霉菌酵母PDA25~28℃5天第八頁，共一百三十五頁。測定方法

檢測樣品的處理稀釋傾注（涂布）瓊脂平板計數(shù)報告第九頁，共一百三十五頁。（一）樣品采集1、采樣原則：代表性防止污染2、采樣的種類：大樣一整批樣品中樣200g小樣分析的樣品（檢樣）25g第十頁，共一百三十五頁。3、采樣方法：

無菌操作采樣用具必須無菌盡量采集有包裝的食品粉末狀樣品邊取樣邊混合液體樣品邊振搖邊混合冷凍食品保持冷凍狀態(tài)非冷凍食品保存在0~5℃

第十一頁，共一百三十五頁。4、采樣數(shù)量和部位：

200g/件乳制品一瓶（個、罐、聽）糧三層五點（表、中、下）油重點采取表層及底層油5、采樣標簽：名稱來源數(shù)量編號時間..（二）送檢從采樣到實驗室越快越好

不得超過3h第十二頁，共一百三十五頁。（三）樣品的處理和稀釋1）取樣無菌操作25g放入225mL滅菌生理鹽水的無菌瓶內（1：10稀釋液）2）均勻混合均質器第十三頁，共一百三十五頁。3）稀釋4）傾注1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml第十四頁，共一百三十五頁。5）傾注平板

稀釋液移入平皿后，將46℃~的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL,轉動平皿。空白對照第十五頁，共一百三十五頁。6）倒置

培養(yǎng)瓊脂凝固后，翻轉平板細菌37℃48h~霉菌28℃5天第十六頁，共一百三十五頁。（四）菌落計數(shù)法

肉眼觀察放大鏡TTC（氯化三苯基四氮唑)顯色（五）菌落計數(shù)的報告報告單位：cfu/g(mL)1、平板菌落數(shù)的選擇：30~3002、稀釋度的選擇：第十七頁，共一百三十五頁。（五）菌落計數(shù)的報告3、菌落數(shù)的報告：100以內時按實數(shù)報告大于100時兩位有效數(shù)字1640016000第十八頁，共一百三十五頁。涂布平板法

先倒平板待凝固后，吸取0.1ml稀釋液于平板表面上，用滅菌涂布棒在整個平板上均勻涂布，培養(yǎng)觀察。第十九頁，共一百三十五頁。涂布法的優(yōu)缺點可檢測到熱敏性菌體菌落形態(tài)比較明顯更適合于嚴格的好氧菌沒有傾注法簡便，易出現(xiàn)菌落重疊、混雜現(xiàn)象第二十頁，共一百三十五頁。二、旋轉接種法（Spiralplatemethod）

1970年FDA原理：接種針將樣品液以螺旋方式從平板中央往外連續(xù)接種。接種量：0.05mL第二十一頁，共一百三十五頁。優(yōu)點：可測定50~500000cfu/mL的菌數(shù)樣品不需事先稀釋不需做2個重復接種速度快結果可人工計數(shù)，也可用激光計數(shù)器計數(shù)人力與物力花費成本低廉測定結果與傳統(tǒng)方法相關性高第二十二頁，共一百三十五頁。缺點：設備投資較高含顆粒樣品容易堵塞管道如果樣品的帶菌量超出范圍則結果準確性降低對瓊脂平板表面要求高第二十三頁，共一百三十五頁。菌落計數(shù)的其它方法膜過濾MPN染色還原計數(shù)法DMC第二十四頁，共一百三十五頁。三、膜過濾SPC方法的改良過濾膜的孔徑0.45um收集菌體提高檢出率直接顯微計數(shù)膜過濾與熒光染色方法結合第二十五頁，共一百三十五頁。直接熒光膜技術計數(shù)法（DEFT）

DirectEpifluorescentFilterTechnique第二十六頁，共一百三十五頁。DEFT—微菌落計數(shù)

僅用于活細胞的檢測原理：食品勻液經(jīng)DEFT膜過濾，膜放在培養(yǎng)基表面，恒溫培養(yǎng)至微菌落長出，顯微鏡觀察G-3hG+6h第二十七頁，共一百三十五頁?？焖贆z測技術特殊濾膜（0.5um）過濾樣品液濾膜經(jīng)啶橙染色紫外光顯微鏡觀察活細胞橙色熒光死細胞綠色熒光20~30min第二十八頁，共一百三十五頁。四、最近似數(shù)測定法（MPN）

選擇3個稀釋梯度的稀釋液，每種稀釋液接種3管（5管）裝有培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，根據(jù)實驗結果查MPN檢索表，得到樣品中微生物數(shù)量。第二十九頁，共一百三十五頁。

1915年McCrady發(fā)明MPN的優(yōu)點：方法相對簡單與SPC相比，相似率較高用選擇性培養(yǎng)基可檢測特殊的微生物類群測定大腸菌群數(shù)量的方法第三十頁，共一百三十五頁。

MPN的缺點：需要大量的玻璃器皿（特別是5試管實驗）不能觀察微生物菌落的形態(tài)準確性不高第三十一頁，共一百三十五頁。1、大腸菌群（coliformgroup）

領域用語與糞便污染有關的細菌定義：一群需氧及兼性厭氧，在37℃經(jīng)24h能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

第三十二頁，共一百三十五頁。主要包括：大腸埃希氏菌屬（Escherichia）檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）克雷氏菌屬（Klebsiella）產(chǎn)氣腸桿菌屬（Enterobacter）非典型大腸桿菌典型大腸桿菌第三十三頁，共一百三十五頁。目前，大腸菌群已被我國和許多國家用作食品質量評價的指示菌。一般認為，大腸菌群都是直接或間接來自人與溫血動物的糞便。

第三十四頁，共一百三十五頁。2、檢測大腸菌群的意義

糞便污染食品的指示菌大腸菌群數(shù)的高低，表明糞便污染的程度和對人體健康危害性的大小腸道致病菌污染食品的指示菌

大腸菌群數(shù)的高低，表明腸道致病菌存在的可能性大?。ú⒎且欢ㄆ叫校。?/p>

第三十五頁，共一百三十五頁。3、大腸菌群檢測方法與檢驗結果

檢驗結果：用每100mL（g）樣品中大腸菌群最近似數(shù)來表示，簡稱大腸菌群MPN.檢測方法：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)、證實試驗見GB4789.3-1994第三十六頁，共一百三十五頁。五、染色還原計數(shù)法一種估計活性微生物數(shù)量的方法。原理：活細胞內含有還原酶，可把特定的染料從一種顏色還原為另外一種顏色。第三十七頁，共一百三十五頁。亞甲基藍（蘭色）白色刃天青（暗蘭色）粉紅色或白色染色還原的時間與樣品中微生物濃度成反比兩種染料：第三十八頁，共一百三十五頁。應用：乳品工業(yè)上原料乳中的微生物檢測優(yōu)點：簡便、快捷和經(jīng)濟缺點：不同的微生物還原能力不同，給估算帶來了一定的困難。不適用于含有還原酶的食品應用及優(yōu)、缺點第三十九頁，共一百三十五頁。六、顯微直接計數(shù)法

（Directmicroscopecount,DMC）一定量的食品（0.001mL）顯微鏡載玻片（1cm2）烘干、固定、脫脂、染色復式顯微鏡計數(shù)換算第四十頁，共一百三十五頁。DMC方法的優(yōu)點快捷、簡便能對細胞形態(tài)進行分析載玻片易保存，作參考可使用熒光技術增強效果第四十一頁，共一百三十五頁。DMC方法的缺點僅適于檢含大量菌體的樣品準確性差易造成操作人員的疲勞第四十二頁，共一百三十五頁。七、棉拭子涂抹法

表層微生物的檢測應用于食品、公共場所第四十三頁，共一百三十五頁。方法：1）無菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水（10mL試管）均勻涂抹樣品表面一定面積（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回試管中，及時送檢；第四十四頁，共一百三十五頁。2）試管振蕩，使微生物懸浮于稀釋液中；3）按SPC方法進行梯度稀釋、培養(yǎng)、計數(shù)。

此外，紙片法……第四十五頁，共一百三十五頁。第二節(jié)物理、化學、分子和免疫方法第四十六頁，共一百三十五頁。一、物理方法阻抗測定法微量量熱法第四十七頁，共一百三十五頁。（一）阻抗測定法（impedance）

1899年G.N,Stewart估算20世紀70年代應用阻抗：交流電路中導電物質對電流所起的阻礙和抵抗作用，可由電導和電容計算。第四十八頁，共一百三十五頁。原理：微生物可使培養(yǎng)基中電惰性底物，如碳水化合物、蛋白質等營養(yǎng)物質代謝成為電活性產(chǎn)物（乳酸鹽或氨等）當微生物生長繁殖時，培養(yǎng)基中的電惰性分子即為許多電活性分子所取代，從而使培養(yǎng)基的電導性增大，培養(yǎng)基的阻抗降低。第四十九頁，共一百三十五頁。檢測時間（detectiontime)樣品接種后從開始培養(yǎng)到阻抗值發(fā)生急劇變化的時間。與原始菌數(shù)成反比Bactomer細菌計數(shù)器準確率93%10~100個5h~第五十頁，共一百三十五頁。（二）微量量熱法（Microcalorimetry）細菌生長時產(chǎn)生熱量測定微小溫度變化的儀器—量熱計批次型：早期應用流動型：靈敏、快速第五十一頁，共一百三十五頁。二、化學方法（一）熱穩(wěn)定性核酸酶（DNAse）

S.aureusG（+）凝固酶（+）產(chǎn)腸毒素菌株95%產(chǎn)熱穩(wěn)定性核酸酶耐高溫第五十二頁，共一百三十五頁。原理：檢測食品中熱穩(wěn)定性核酸酶的含量，可以精確計算出金黃色葡萄球菌的數(shù)量。第五十三頁，共一百三十五頁。

分光光度法

熱穩(wěn)定性核酸酶是S.aureus生長的標志凝固酵素是產(chǎn)腸毒素菌株的標志第五十四頁，共一百三十五頁。（二）ATP的測定生命體的主要能源細胞中ATP含量恒定ATP測定計數(shù)法的原理根據(jù)ATP可與從熒火蟲中提取的熒光素酶作用發(fā)光，發(fā)光的總光量與ATP的量成正比。第五十五頁，共一百三十五頁。

光強度推算出細菌細胞數(shù)液體發(fā)光分光計照度計結果與SPC法一致10~25min第五十六頁，共一百三十五頁。ATP檢測法的應用：

檢測微生物數(shù)量的快速方法醫(yī)學：尿樣的檢驗環(huán)境衛(wèi)生：表面微生物的測定第五十七頁，共一百三十五頁。（三）輻射測量法（Radiometric）原理

利用細菌在代謝碳水化合物時產(chǎn)生CO2的原理，把微量元素標記到葡萄糖或其他糖類分子中。放射能計數(shù)器第五十八頁，共一百三十五頁。放射物的種類C-14葡萄糖C-14甲酸鹽C14-谷氨酸鹽放射量與菌數(shù)成正比檢測C-14所需的時間與食品中微生物的含量成反比。第五十九頁，共一百三十五頁。應用醫(yī)學：“吹口氣，查胃病”30min食品：微生物含量高5~6h微生物含量低更廠第六十頁，共一百三十五頁。三、食品微生物的指紋識別和鑒定

“指紋”概念由于每種微生物的化學組分（DNA、蛋白質）結構、性能有差別及其特異性代謝產(chǎn)物等通過分析技術出現(xiàn)的特征性的圖譜第六十一頁，共一百三十五頁。（一）血清學方法特殊的抗體鑒定同源抗原G-菌體（O）抗原鞭毛（H）抗原熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性差第六十二頁，共一百三十五頁。抗原（Antigen，Ag）Antigensaremacromoleculesthatelicitanimmuneresponseinthebody.Antigenscanbeproteins

polysaccharides

conjugatesoflipidswithproteins(lipoproteins)andpolysaccharides(glycolipids).第六十三頁，共一百三十五頁。Antibodiesareimmunesystem-relatedproteinscalledimmunoglobulins（Ig）.Eachantibodyconsistsoffourpolypeptides–twoheavychainsandtwolightchainsjoinedtoforma"Y"shapedmolecule.抗體（Antibody，Ab）第六十四頁，共一百三十五頁。Structureofantibody第六十五頁，共一百三十五頁。（二）噬菌體（phage）類型原理：根據(jù)噬菌體和它的宿主細菌之間的特殊關系，用已知的噬菌體鑒定其特定的宿主細菌。第六十六頁，共一百三十五頁。（三）分子生物學方法基因探針技術DNA擴增法限制性片段長度多態(tài)性技術脈沖場凝膠電泳第六十七頁，共一百三十五頁。1.基因探針技術探針（Probe）：經(jīng)過標記的一段短核苷酸，用于檢測與之同源的核苷酸序列。Probeisashortlabellednucleotideusedtodetecthomologousnucleotidesequence.第六十八頁，共一百三十五頁。Lengthofprobe：

20-1000bpTypeofprobe：

Oligonucleotideprobes（20-40bp）SinglestrandedDNAprobes（200-500bp）DoublestrandedDNAprobes

RNAprobesorRiboprobes第六十九頁，共一百三十五頁。

Radioactive：32P、35S、3H、14CDigoxigenin（Dig）BiotinFluorescentdyeChoiceofLabelling：

Non-radioactive：第七十頁，共一百三十五頁。UnknownDNA第七十一頁，共一百三十五頁。Colony

hybridization第七十二頁，共一百三十五頁?？蓹z測的細胞數(shù)量：106-107

必須進行細胞富集！

探針檢測的靈敏度與檢測時間細胞數(shù)量為108，檢測需要10-12h第七十三頁，共一百三十五頁。2.DNA擴增法（1）多聚酶鏈反應PolymeraseChainReaction，PCR1985年，美國PE-Cetus公司人類遺傳學研究室的KaryMullis發(fā)明1993年，Mullis獲得諾貝爾化學獎第七十四頁，共一百三十五頁。PCR的基本原理DNA的結構DNAdoublehelix第七十五頁，共一百三十五頁。DNA的復制DNAsemi-conservedreplication第七十六頁，共一百三十五頁。第七十七頁，共一百三十五頁。第七十八頁，共一百三十五頁。三步曲：變性（Denaturation）退火（Annealling）延伸（Extension）一個循環(huán)（cycle）一般進行25-30個循環(huán)PCR反應的三步曲與五要素第七十九頁，共一百三十五頁。Step1：雙鏈DNA熱變性（94℃）；Step2：引物與模板單鏈DNA退火（55℃）；Step3：DNA的聚合延伸反應（72℃）；Step4：擴增的雙鏈DNA再次熱變性（返回Step1）。第八十頁，共一百三十五頁。五要素：●模板DNA（template）●引物（Primer）●DNA聚合酶（Polymerase）●緩沖液（Buffer，Mg++）●脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）第八十一頁，共一百三十五頁。第八十二頁，共一百三十五頁。循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物的量實際：Nf=N0（1+Y）N其中Y為擴增效率理論：Nf=N0X2N

其中N為循環(huán)次數(shù)，N0為起始拷貝數(shù)，Nf為最終拷貝數(shù)第八十三頁，共一百三十五頁。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳第八十四頁，共一百三十五頁。Denaturing94oCTemperature100055Time5’3’3’5’第八十五頁，共一百三十五頁。PCRDenaturing94oCTemperature100055Time3’5’5’3’Heat第八十六頁，共一百三十五頁。Denaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time3’5’5’3’5’5’Denaturing94oC第八十七頁，共一百三十五頁。Denaturing94oCDenaturingng94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’HeatHeat5’5’5’第八十八頁，共一百三十五頁。Denaturing94oCDenaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’第八十九頁，共一百三十五頁。PCRProductsWithEachThermalCycle0CyclesNumber1382412416532664第九十頁，共一百三十五頁。（2）隨機擴增的多態(tài)性DNA

RandomAmplifiedPolymorphicDNA

（RAPD）DevelopedbyWilliamsetal.(1990)using10baseprimerstogeneraterandomfragmentsfromtemplateDNAsRAPDfragmentscanbeseparatedandusedasgeneticmarkersorakindofDNAfingerprint第九十一頁，共一百三十五頁。Tworelatedtechniques:

1.ArbitraryPrimedPCR(AP-PCR)WelshandMcClelland(1990)longerprimers(18-25bases)2.DNAAmplificationFingerprinting(DAF)Caetano-Anollesetal.(1991)veryshortprimers(8bases)第九十二頁，共一百三十五頁。ComponentsofPCRandRAPDRAPD1.Buffer(Mg++)–usuallyhighMg++concentration2.TemplateDNA1shortprimer(10bases)annealstoanyspecificpartofthetemplateDNA4.dNTPs5.TaqPCR1.Buffer(Mg++)2.TemplateDNA2PrimersthatflankthefragmentofDNAtobeamplifieddNTPs5.Taq第九十三頁，共一百三十五頁。TwomodificationsmadetotypicalthermalcyclingwhenRAPDisbeingdone:Annealingtemperaturesaregenerallyverylow,around36°C-ThisallowsveryshortprimerstoannealtotemplateDNAMorethermalcyclesareused,typically45-Thiscompensatesfortheinefficiencywhichresultsfromusingsuchshortprimers.第九十四頁，共一百三十五頁。TemplateDNAPrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplaceRAPD第九十五頁，共一百三十五頁。TemplateDNAPrimerspointawayfromeachother,soamplificationwon’thappenRAPD第九十六頁，共一百三十五頁。TemplateDNAPrimerspointinthesamedirection,soamplificationwon’thappenRAPD第九十七頁，共一百三十五頁。TemplateDNAPrimerstoofarapart,soamplificationwon’thappen>2,000basesRAPD第九十八頁，共一百三十五頁。TemplateDNAPrimersarejusttherightdistanceapart,sofragmentisamplified100-1,500basesRAPD第九十九頁，共一百三十五頁。MM2345678910RAPD產(chǎn)物的電泳圖譜第一百頁，共一百三十五頁。PCRMachine第一百零一頁，共一百三十五頁。3.限制性片段長度多態(tài)性技術（RFLP）RestrictionFragmentLengthPolymorphism（1）限制性內切酶

(Restrictionendonuclease）保護細菌不受外來DNA侵入來自細菌的一種內切酶第一百零二頁，共一百三十五頁。限制性內切酶的特點：識別4-8bp特定序列(sitespecific)兩股DNA上各產(chǎn)生一個切口回文序列(palindromesequence)5’-GTTACATGAGATCACGGATTC-3’3’-CAATGTACTCTAGTGCCTAAG-5’第一百零三頁，共一百三十五頁。產(chǎn)生粘性末端(cohesiveend,stickyend)5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAEcoRI5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCMspIAATTCACGGATTC-3’GTGCCTAAG-5’CGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAAATTCACGGATTC–3’GTGCCTAAG-5’5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCCGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’第一百零四頁，共一百三十五頁。5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAHpaI5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCHaeIIIAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’CCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’產(chǎn)生平末端(bluntend)5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCCCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’第一百零五頁，共一百三十五頁。（2）限制性圖譜

(Restrictionmap）第一百零六頁，共一百三十五頁。（3）限制性片段長度多態(tài)性

(RFLP）第一百零七頁，共一百三十五頁。第一百零八頁，共一百三十五頁。4.脈沖場凝膠電泳技術PulsedFieldGelElectrophoresis（PFGE）第一百零九頁，共一百三十五頁。第一百一十頁，共一百三十五頁。四、免疫學方法精確性(Accurate)靈敏性(Sensitive)特異性(Specific)第一百一十一頁，共一百三十五頁。（一）熒光抗體法（FA）（Fluorescenceantibody）1942年創(chuàng)立，在食品和醫(yī)學微生物中應用廣泛。原理：抗體與熒光物質結合而帶有熒光，與相應抗原結合后，在熒光顯微鏡下可以觀察，也可計數(shù)。第一百一十二頁，共一百三十五頁。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）若丹名B（RhodamineB）第一百一十三頁，共一百三十五頁。（二）沙門氏菌1-2實驗（1-2Test）原理：血清學原理,即抗原抗體結合形成肉眼可見的免疫帶。一種檢測有動力的沙門氏菌的方法第一百一十四頁，共一百三十五頁。在一個特殊的含兩個容器的塑料設備中進行：一個容器中裝有選擇性液體培養(yǎng)基，另一個中裝有非選擇性運動性培養(yǎng)基（半固體），并含有鞭毛抗體。恒溫培養(yǎng)時，運動性沙門氏菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)后進入非選擇性培養(yǎng)基，并與其中的抗體結合形成免疫帶。第一百一十五頁，共一百三十五頁。Inoculationchamber第一百一十六頁，共一百三十五頁。優(yōu)點：將血清學反應和生化增菌過程結合起來，特異性強；不需特殊實驗室條件，簡便；8-14小時內得出結果，快速。缺點：不能檢測非運動型沙門氏菌，免疫條帶的判斷有主觀因素。第一百一十七頁，共一百三十五頁。（三）酶聯(lián)免疫吸附劑測定

EnzymeLinkedImmunosorbentAssay1971年Engvall和Perlmann（ELISA）canmeasureantibodiesorantigensinexpensive,rapid,quantitative,specificsensitive(pg/ml)expensiveequipmentnotrequiredcanbeautomated第一百一十八頁，共一百三十五頁。ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留