常見生物相容性實驗匯總

1、常見生物相容性實驗匯總細胞復蘇材料準備：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15ml&50ml離心管實驗步驟：先將培養(yǎng)基配好并復溫，在15ml離心管中加入5ml培養(yǎng)基；準備37C的水浴，取出凍存管后立即置于水浴中融化，確保細胞全部浸入液面，快速搖動，1min內使管內的細胞融化，注意不要讓水沒過管口，液氮會從口子噴出，小心。把培養(yǎng)基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜內操作。小心打開凍存管，將細胞懸液轉移到有培養(yǎng)基的15ml離心管中。1200rpm離心3min,棄上清，加入6ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基，轉移至新培養(yǎng)瓶（小瓶6ml培養(yǎng)基，大瓶10ml培養(yǎng)基）中，做好標記（

2、細胞類型、傳代數、培養(yǎng)基、復蘇時間、復蘇人），置于CO2培養(yǎng)箱中37C培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后視情況換液。復蘇后細胞生長狀況正常后，進行常規(guī)培養(yǎng)，最好在第二次傳代后凍存若干管細胞，不可只取不存，在第三次傳代后可用于細胞實驗。TIPS：解凍細胞必須迅速，防止細胞低溫損傷，慢凍速融。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。細胞傳代（TE消化法）實驗前準備事項：預熱培養(yǎng)用液：把已經配制好的裝有培養(yǎng)基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴鍋內預熱（可以省去）。用75%酒精擦拭雙手，生物安全柜經過紫外線照射超過30min,實驗前通風至少開啟15分鐘讓空氣循環(huán)起來，櫥內不要使用火焰燈

3、，它們會影響櫥內空氣的流動方式。實驗前把可能用到的試劑、吸管及離心管等全部拿到廚內，并正確擺放使用的器械，保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。材料準備：TE消化液、FBS、對應培養(yǎng)基、50ml離心管若干、15ml離心管若干、一次性吸管若干、培養(yǎng)皿等實驗步驟：觀察細胞生長狀況后，取出實驗所需物品，可在50ml離心管中配制40ml培養(yǎng)基（4mlFBS+36mla-MEM）待用。用一次性吸管從細胞單層吸出培養(yǎng)基，緩慢加入PBS或者不含血清的培養(yǎng)基沒過細胞，搖晃洗滌培養(yǎng)皿12次。再吸出PBS或培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，6cm（10cm）培養(yǎng)皿中加入600山（800卩l(xiāng)）TE（胰蛋白酶），以剛

4、剛沒過細胞為宜。（視細胞種類也可不洗滌直接加入TE消化液）稍加搖勻，使TE消化液均勻覆蓋皿內所有細胞，置37C條件下溫育13分鐘。消化程度以用肉眼觀察當培養(yǎng)皿晃動時飄起單層細胞為準，可在顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度，視細胞不同而調節(jié)。消化適度后，加入適量培養(yǎng)基23ml于培養(yǎng)皿中終止消化，沿四個方向吹洗培養(yǎng)皿，確保細胞均從板上消化下來，最后全部轉移到15ml離心管中。用吸管將已經消化的細胞輕輕吹打成細胞懸液。精確配平后放入臺式離心機內1200rpm離心3分鐘。棄上清液，加入適量PBS,重懸后1200rpm離心3分鐘。棄上清液，先加入23ml含10%

5、血清的培養(yǎng)基于15ml離心管中，將適量細胞重懸液轉移至含有培養(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，做好標記（細胞類型、傳代數PxNy、培養(yǎng)基D-L-5、傳代時間、傳代比例1:5；操作人），置于CO2培養(yǎng)箱中37C培養(yǎng)，清理操作臺，處理垃圾，記錄筆記。TIPS：消化適度：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散，細胞從平板上脫落可以用槍頭吹打實現，但必須觀察到細胞間已經分離。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細

6、胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37C時，胰酶溶液的作用能力最強，針對不同細胞，建議初次消化時均在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)以確定消化程度。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，女如D-Hanks液。EDTA可以螯合2價金屬離子，故常用TE溶液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)基或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用，利用培養(yǎng)基稀釋也可以達到一定效果。每次傳代可以按1:31:10等比例進行，以ATCC數據建議和實際生長狀況考慮，請協(xié)商好細胞需要立

7、即使用還是長期培養(yǎng)，合理保持培養(yǎng)箱中不同細胞的平板數量。用一次性吸管吹勻細胞時，切勿產生大量氣泡，在氣泡破裂時產生的剪接力對活細胞有致命威脅。建議吸管在吸取液體前盡量排空氣體，緩慢松手以吸取更多液體，繼而以合適的力度吹勻細胞。細胞凍存材料準備：TE消化液、FBS、對應培養(yǎng)基、50ml離心管若干、15ml離心管若干、一次性吸管若干、專用凍存塑料管（1ml）等實驗步驟：1、將細胞凍存液（10%DMSO+90%FBS）配好并放置冰箱預冷；2、當10cm培養(yǎng)皿中的RBMSC細胞匯合到80%-90%時，用胰蛋白酶將細胞消化下來，1200rpm離心，去上清；3、加入PBS重懸細胞，以洗去殘留的胰蛋白酶，1

8、200rpm離心，去上清；4、加入1ml細胞凍存液重懸后，將細胞重懸液放入凍存管中，凍存管必須將蓋子蓋緊，防止液氮侵入，并做好標記（細胞類型、培養(yǎng)代數、培養(yǎng)基、凍存時間、凍存人、編號）。按下列順序梯度降溫：室溫-4C（1020min）f冰箱冷凍室-20C（0.51.5h）低溫冰箱-80C（過夜）液氮罐-196C（長期）（冰上轉移）。5、整理，做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄（細胞信息、具體凍存位置、管數等）。TIPS：欲冷凍保存之細胞應在生長良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80-90%致密度。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞

9、活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數生長期細胞。DMSO稀釋時會放出大量熱能，為了防止局部DMSO濃度過高，請滴加培e.f.g.養(yǎng)基并且不時搖晃，當然，最佳的是配制好凍存培養(yǎng)基，加入離心管中對細胞沉淀小心吹打制懸。梯度降溫轉移細胞時注意放置冰盒上

10、，避免敏感溫度變化。不宜將凍存細胞放置在0C-60C這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內,是“危險溫區(qū)”。注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。專用凍存塑料管，帶有螺旋的平底塑料蓋，并且可以耐受低溫，注意凍存時擰緊。細胞計數材料準備：細胞計數器、Eppendorf管等實驗步驟：制備細胞懸液，可稀釋數倍以使每小格的細胞數可數。取潔凈的細胞計數板一塊，在計數區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。將懸液搖勻，用移液器吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多），讓懸液利用液體的表面張力充滿計數區(qū)，勿使氣泡產生，不要使計數區(qū)兩邊平臺沾上懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區(qū)深度

11、的升高，可用吸水紙吸去溝槽中流出的多余懸液。靜置片刻，使細胞沉降到計數板上，不再隨液體漂移。將細胞計數板放置于顯微鏡的載物臺上，先在低倍鏡下找到計數區(qū)后，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。細胞計數時，計數區(qū)是由4個16格小方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（A、B、C、D）的細胞數，數完計4個大方格讀數的平均數。為了保證計數的準確性，避免重復計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統(tǒng)計應有統(tǒng)一的規(guī)定。如細胞位于大方格的粗線上計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。測數完畢，取下蓋玻片，噴酒精將細胞計數

12、板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干、濾紙吸干或用吹風機吹干，放入盒內保存細胞計數板-計數公式：計算公式：細胞數/ml=16小格內細胞總數x104x稀#倍數1mmAFBG細網格線.006mm粗網格線0P014mmffTRSD幼鼠骨髓間充質干細胞提取準備好已滅菌的手術器械和需要用到的離心管、培養(yǎng)皿等器材，于紫外照射30min滅菌。2.先將培養(yǎng)基配好，并在培養(yǎng)皿中加入PBS和10%FBSMedium。將出生7-8天的SD幼鼠處死，噴酒精后放入超凈臺的培養(yǎng)皿中。左手拿鑷子將SD幼鼠后腿腳掌夾起，右手持剪刀沿著SD幼鼠后腿將皮剪開，且將皮剪至股骨部分，要將皮剪開點，以免沾

13、到毛發(fā)。找到股骨與身體相連的關節(jié)處剪斷，取出后腿，并將腳掌與脛骨相連位置的皮剪掉，去除腳掌,余下部分放置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中。重新取新一套鑷子與剪刀，用鑷子將腿夾起，在脛骨與股骨關節(jié)相連處用剪刀剪斷，得到分離的脛骨與股骨。左手用鑷子將脛骨節(jié)氣，右手持剪刀對骨頭進行剔肉，盡量將骨頭上的肉剔干凈后，剪斷脛骨兩端的關節(jié)，使脛骨兩端相通后放入裝有10%FBSMedium的培養(yǎng)皿中，股骨處理與脛骨相同。用lml注射器插入到骨髓腔中，并不斷用medium進行吹打，直至腔體發(fā)白為止，再用lml槍頭吹打培養(yǎng)皿中的細胞，以免細胞成團。用細胞濾網對培養(yǎng)皿中的細胞懸液進行過濾，去除液體中的組織和肉末，將濾液放入l

14、0cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。第二天，去除上清液，PBS清洗兩次（要沿壁加PBS,以免將貼壁不牢固的細胞吹起），再加入10%FBSMedium培養(yǎng)。（由于剛提取的細胞中含有多種雜質，剛提取的細胞經過過夜培養(yǎng)后，細胞上清液渾濁屬于正?，F象，在提取后的兩天內，細胞要每天換液，且換液時候加PBS和10%FBSMedium時候必須緩慢沿壁加入，以免將細胞吹起。）2天換液一次，等到細胞長滿之后，對細胞進行傳代，傳至第三代即可進行凍存和做實驗用。CCK-8實驗目的：考察合金改性前后對對細胞毒性的變化細胞：小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1,大鼠骨髓間充質干細胞RBMSC實驗原理：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被

15、活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物（formazan）。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。保存條件：4C干燥避光保存，有效期一年（推薦）。-20C干燥避光保存，有效期二年。直接在材料上種細胞的CCK8實驗方案準備一個小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,用75%的乙醇滅菌10min，將材料轉移至24孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時間，再用培養(yǎng)基清洗一遍，加入

16、800卩1培養(yǎng)基使材料浸沒在培養(yǎng)基中（若材料為鈦合金，可把75%滅菌后的材料放置于超凈臺，再用紫外照射一段時間后，將材料放置于24孔板中，用PBS清洗后，再用培養(yǎng)基進行清洗。）取70%-80%對數生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清a-MEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數，在材料上種細胞，密度為3*104/孔（可根據材料調整細胞密度），使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面（先加入800l培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。若有氣泡，戳破。再以轉圈的方式加入200l細胞重懸液至材料表面，輕微震蕩），5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細胞貼壁。每個材料4個復孔（若材料為鈦合金

17、，則可將細胞懸液配成配制濃度為2X104個/mL的細胞懸液，分別注入已置入材料的無菌24孔板，每孔500口L。48孔板，每孔300p!。）由于鎂合金與CCK8會產生假陽性結果，所以在檢測吸光度的時候，需要將細胞消化后再與CCK8進行孵育：待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)1,3,7天（每天需更換新鮮培養(yǎng)基），棄培養(yǎng)基，PBS洗2次（PBS需吸干），清洗后，將材料轉移至別的空白孔中，每孔加入200卩1胰酶消化1-2min后，在顯微鏡下觀察control組的細胞是否消化下來，如沒有消化下來,用槍吹打至細胞完全消化后，每孔加入500卩110%胎牛血清a-MEM培養(yǎng)液終止消化，120

18、0rpm離心5min,棄上清，加入400卩l(xiāng)10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng),于酶標儀450nm波長測定其吸光度（其他材料：待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)1,3,7天，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次（PBS需吸干），清洗后，將材料轉移至別的空白孔中，每孔加入400pl10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng),于酶標儀450nm和650nm波長測定其吸光度。）實驗對照組：種3*104/孔細胞于24孔板中，加入培養(yǎng)基分別孵育1,3,7天后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2-3次（PBS需吸

19、干），每孔加入與實驗組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度。（若為鎂合金的control組，則應將control組中的細胞消化下來，再與CCK8進行孵育?？瞻讓φ眨涸诳瞻卓字屑尤肱c實驗組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度即為空白對照。備注：一個方塊材料為1cm2，一塊材料消耗1ml培養(yǎng)基在材料上培養(yǎng)細胞時，需每天進行換液，防止鎂合金腐蝕對細胞造成影響。當在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。特別重要的是，在加入CCK8之前，必須把材料轉移至其

20、他空白孔中,以免貼壁在材料外的細胞造成的實驗誤差。材料浸提液CCK8的實驗方案1、對材料先進行封膠處理，封膠時底面只弄一次，盡量平整、薄。封膠完畢后，在干燥箱中存放3天，多余的膠用手術刀切掉，盡量使底部保持平整。在用于浸泡之前，用2000#砂紙對WE43再次進行打磨，以去除表面的氧化膜。2、準備一個小燒杯，在燒杯中滅菌，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物。將材料于75%的乙醇中滅菌10min,再用PBS清洗3次，轉移至24孔板中，加入培養(yǎng)基后在桌面來回動10-20s。3、材料與a-MEM+雙抗培養(yǎng)基在5%CO2，37C條件下孵育3天（lml/cm2）。4、提取上層液在4C中保存，使用前用0.22

21、pm的濾頭過濾除菌（加過雙抗可不滅菌），離心去上清液（液體有揮發(fā)就補齊），4C保存，材料回收。5、細胞用a-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+100U/ml雙抗培養(yǎng)。6、取70%-80%對數生長期細胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清-MEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，計數，在96孔板上種細胞，密度為5*103/孔，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細胞貼壁。24h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入材料提取液90pl+10plFBS（10%）。進一步稀釋成50%，25%，10%的提取溶液，以加入90卩l(xiāng)培養(yǎng)基和10plFBS位對照組，每一樣品設5個復孔。37C培養(yǎng)1,3,7天，棄提取液，PBS洗2-3次，每

22、孔加入100卩l(xiāng)不含血清的10%CCK8培養(yǎng)4h,終止培養(yǎng)，于酶標儀450nm波長測定其吸光度?？瞻讓φ?在空白孔中加入與實驗組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度即為空白對照。按細胞增值度法計算細胞相對增值率（Relativegrowthrate，RGR），并按表1的要求，將RGR值轉化成六級，評定材料毒性。RGR（%）=（材料組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）X100%表1分級標準和評定結果0級1級2級3級4級5級RGR(%)210075-9950-7425-491-240評定結合格合格結合細胞不合不合格不合格果形態(tài)綜合格評價注意事項：由

23、于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內水源的地方，以緩解蒸發(fā)。本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，所以還原劑（例如一些抗氧化劑）會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。細胞CCK8實驗結果參照下圖:1B014080IncubationTime(day)Fig.15.InvitrocellviabilityofMC3T3-E1pre-oteoblastscu

24、lturedintheextractionmediumoftheuntreatedandNd-implantedWE43for1and3days.100Extract70%ExtractRW50%Extract010%Extractaba&cWE43b&dNd-implantedWE43如圖所示，相同濃度浸提液與細胞共培養(yǎng)1天和3天后，100%WE43浸提液對細胞的毒性比較大，細胞存活率分別為60%和40%左右，而釹元素等離子注入WE43100%浸提液與細胞共培養(yǎng)1天和3天后，細胞存活率分別為90%和100%左右，且在低濃度情況下釹元素等離子注入WE43能夠促進細胞增殖，表明經過改性后的WE4

25、3具有良好的生物相容性。Improvementofcorrosionresistanceandbiocompatibilityofrare-earthWE43magnesiumalloybyneodymiumself-ionimplantation,CorrosionScience94(2015)142-55.細胞骨架和DAPI染色（細胞粘附測試）定義：細胞骨架是由蛋白質絲搭建起的骨架網絡結構,主要包括微管，微絲，中間纖維。它們對細胞形態(tài)的維持，細胞的生長、運動、分裂、分化、物質運輸、能量轉換、信息傳遞、基因表達等都起到重要作用。實驗目的：比較材料表面改性前后早期細胞直接粘附的狀態(tài)細胞：小鼠胚

26、胎成骨細胞MC3T3-E1原理：利用抗原-抗體反應原理，就是以一抗作為探針，它與目的蛋白作用并連接，再用帶有熒光（或同位素）標記的二抗與一抗作用，最后顯色，發(fā)光位置就有目的蛋白。羅丹明熒光物質標記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細胞的F-actin結合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布。DAPI為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發(fā)揮標記的作用，在熒光顯微鏡下可以看到到細胞核的形態(tài)變化，固定過和沒有固定過的活細胞均可用DAPI染色。實驗方案：準備一個小燒杯，將材料浸沒在裝有乙醇的小燒杯中滅菌10-15min。將材料放置24孔板中用PBS震蕩洗兩次，培養(yǎng)基洗一次。材料放置孔板中部。細

27、胞以5*104/孔接種，使細胞懸液均勻的鋪滿整個材料表面，孵育5h。（先加入800卩1培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。若有氣泡，戳破。再加入200卩l(xiāng)細胞重懸液至材料表面，輕微震蕩。）（若材料為鈦合金，則可將細胞懸液配成配制濃度為2X104個/mL的細胞懸液，分別注入已置入材料的無菌24孔板。）細胞孵育5h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS震蕩清洗兩次（24h時間點：加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，用PBS振蕩清洗兩次），3.7%甲醛（PBS中）在室溫下固定5min，吸出固定液，PBS清洗2次。加入0.1%（體積比）TritonX-100（PBS中）破膜5-8min，棄去T

28、ritonX-100上清液，PBS洗3次。在暗室中，取5卩16.6pM羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽用PBS稀釋至200卩1（終濃度為165nM，加入鬼筆環(huán)肽（覆蓋即可，用完可以回收利用），室溫避光孵育40min,吸出染液，用PBS清洗洗3次。6.加入DAPI溶液室溫下染色3-5min,棄去染液，用PBS洗3次，加入PBS,熒光顯微鏡觀察，并拍照記錄。省染料的做法：取封口膜一塊，滴加染料在封口膜上，倒扣材料，使細胞直接接觸染料染色，注意過程中染料不能干。正置熒光顯微鏡觀察法：取干凈載玻片，將材料放在載玻片上（事先泡在PBS中，取出時用吸水紙輕輕拭干，有細胞的表面朝上放置）。打開顯微鏡，熒光，電腦。先在顯

29、微鏡以（X100。即（10倍物鏡。觀察整體情況。熒光：1通道：DAPI，2通道：FITC,3通道：羅丹明觀察：1.細胞骨架形態(tài)是否發(fā)生變化肌動微絲是否出現增粗細胞間連接是否增多細胞形態(tài)：多角形變成梭形，偽足明顯增多注意：DAPI和鬼筆環(huán)肽具有劇毒性，在使用的時候應盡量小心，一定要帶手套操作，避免將染料弄到皮膚上。細胞骨架和DAPI熒光染色圖片結果如下圖：Zn-PIIIAg-PIII*4SOjua亀.*%摯琴.iA*仏.1*e廠b,SOiaZn/Ag630AnnexinV-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測，PI紅色熒光(流式Ex=488，Em630)通過FL2或FL3檢測，建議使

30、用FL3。熒光補償調節(jié)：使用經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償去除光譜重疊和設定十字門的位置。結果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為FITCLOGFLUOR(FITC+/PI+)；而右下象限為凋亡細胞，顯現(FITC+/PI-)。rai.AnnexinV-FITC和碘

31、化丙頊染色后的沐式削胞僅卷測效呆屈正常的活細胞不被A肋芒inV-FITC和膜猶丙呢染色圏中左下部井h罰亡早朋的細胞僅趙AnnatinV-FTTC色.他化丙噬勢色呈陰性(圖呼右下部分h壞死細胞和時亡晚期的細胞可低同時feAiinrxinV-FITC和碘化丙喘錨色(昭中右上部井h罔中左上卻分出現的是許可范圍內的栓測溟芒，熒光顯微照相操作方法：滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡;應同時設置陰性對照。a.將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組;b.用冰冷PBS洗滌細胞兩次;在500yL的B

32、indingBuffer中加入2yLAnnexinV-FITC,5yLPI，混勻；將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；避光、室溫反應5min。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片(FITC和Rhodamine)觀察AnnexinV-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色結果判斷：結合AnnexinV-FITC的凋亡細胞的質膜將顯示綠色光圈；膜結構不完整的壞死細胞和晚期凋亡細胞在整個核區(qū)被PI染成紅色而質膜為AnnexinV-FITC陽性呈現為綠色光圈。Anrwxin仏FH匸和讀比禹瞅肥觸色妊黑國.隅巾鰥色黃怎*3Annesin仏FJPC酗色陰性伺軋紅色

33、茨光為琪比丙味黑苗陽世卿fL儀刪色英光期色的為閒亡第胞，盛縫色卻紅魚熒itSSt的是壞視細胞未議蔬光熱色的為JE常第庖=HUVECScells實驗protocolTranswell1實驗用品：小室：coster的24孔板的transwell的8pm。上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2%BSA。基質膠：常用的是人工重構基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和W型膠原，Matrigel是BD公司生產的，是一種細胞外基質，4度時是液體，在37度會逐漸凝固成膠狀，不可逆。使用前于4C冰箱冰水混合物中融化過夜下層培養(yǎng)液：下層常用含5%10%FBS的培

34、養(yǎng)基，具體濃度根據細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認為，FBS仍是最合適的。包被基底膜：用50mg/LMatrigel1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4C風干。水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37C，30min。制備細胞懸液2.1制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓1224h，進一步去除血清的影響。2.2消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗12遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調整細胞密度至110X105，最好不要超過5

35、X105。接種細胞3.1取細胞懸液100200pl加入Transwell小室，24孔板小室一般200pl。3.224孔板下室一般加入500pl含FBS或趨化因子的培養(yǎng)基。（這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。）培養(yǎng)細胞常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。5細胞染色用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞染色：推薦采用0.1%結晶紫染色。(這種方法有如下優(yōu)勢：(1).

36、不需要固定細胞，直接染色即可。(2).配制簡單方便。(3).染色后可以用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm測其0D值，間接反映細胞數。)顯微鏡照相和細胞計數：取若干個視野計數細胞個數一般采用5-10個，隨機選取，統(tǒng)計計數。另：值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用于Transwel1侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP-2的表達。如果不清楚細胞MMPs的表達情況，就盲目進行Transwell侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費。此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白(fibronectin，FN,BD有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著

37、在膜上，也可用膠原(collagen)或明膠(gelatin)。細胞劃痕實驗鋪板前用記號筆在孔底部畫4-5條平行線(方便拍照時區(qū)域定位)；鋪滿六孔板細胞，貼壁；用10ul槍頭和直尺于垂直平行線方向進行劃痕，4-5條，PBS洗一遍；3換含不同藥物濃度的無/有血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；4.不同時間取不同位置觀察劃痕距離并顯微鏡拍照。免疫熒光一、實驗準備1、片子處理將新片子用1%的HCl泡片子1h,再用75%的乙醇溶液泡0.5h以上，用紗布擦干凈即可備用2、試劑配備透化液0.2%TritonX-100/PBS封閉液5%BSA/PBST(可以加0.2%TritonX-100)抗體稀釋液2%BSA/PBST(

38、可以加0.2%TritonX-100)DAPI染液0.2-lyg/yl一抗稀釋1:100-1:500（依據抗體說明書）1:100-1:500二抗稀釋（避光）注：DAPI先用超純水配成5mg/ml的儲存液，保存在-20C，此乃原始儲存液。將此原始儲存液1:50稀釋成100yg/ml的儲存液，染色時根據情況的不同1:100-1:500稀釋成工作液，此工作液現用現配。根據經驗，遺傳所四樓正置顯微鏡1:500稀釋即可；所里共聚焦顯微鏡稀釋比例需為1:100。二、實驗步驟1、培養(yǎng)基不棄，加27yl/ml的甲醛室溫固定10min2、PBS洗3次，5min/次，洗時輕輕搖晃3、用透化液室溫透化10min4、

39、PBS洗3次，5min/次5、用封閉液37C封閉1h6、PBS洗3次，5min/次7、加入一抗室溫孵育40min，如果雙標，這兩種一抗可以一起加8、PBST洗3次，5min/次9、加入二抗室溫孵育30min,此后的過程都需要避光10、PBST洗3次，5min/次11、稀釋DAPI染液（儲存液濃度lOOpg/pl）,加入DAPI染液室溫避光染色2-10min12、PBST洗3次，5min/次13、抗淬滅劑封片，必要時可用指甲油將邊緣封住，用正置顯微鏡或用共聚焦顯微鏡觀察即可。注：1、細胞數不用太多（約50%），細胞數過多會造成透化、抗體孵育等不充分2、如果細胞貼壁不牢，可以適當延長固定時間（10

40、-30min）3、如果雙標，一抗一定選擇不同源性的，并且要相應的選擇好二抗。一般來說，FITC的二抗特異性好，背景低；羅丹明的二抗背景較高4、DAPI染色需要摸索，染得過亮或過弱都不好小管形成實驗1、4C過夜溶解基質膠（基質膠只有在4C的時候才是液態(tài)），培養(yǎng)基，槍頭盒，96孔板和滅菌EP管需提前放置冰箱預冷。2、實驗時取出預冷的槍頭以無血清的高糖DMEM培養(yǎng)液1:3（培養(yǎng)基：膠）稀釋基質膠，此步驟要迅速（混勻時千萬注意不要吹起氣泡）3、以150-200ul/cm2生長面積的比例（蓋住底面高出2-3mm即可，一般取100ul）加入稀釋好的基質膠至96孔板中（加膠時千萬不要吹起氣泡，氣泡是戳不掉的

41、，直接影響成膠）。將96孔板放置在培養(yǎng)箱中1h讓膠凝固。4、將細胞以專用培養(yǎng)基+10%專用血清的培養(yǎng)液稀釋以2*104/well/100ul的濃度加入96孔板（可根據實驗需要進行稀釋：1、可以先加浸提液50ul，再加入50ul細胞懸液，防止細胞被液體沖亂；2、也可直接先用浸提液和細胞懸液在ep管中混勻，再加入100ul于96孔板基質膠中），前后微微反動孔板使細胞均勻鋪展，注意避免液體傾出；5、將孔板放入37C培養(yǎng)箱中孵育4,8,10,12,16h后于顯微鏡下觀察成管現象，尋找環(huán)狀的細胞管。觀察：小管與小管之間的連接數小管的長度及小管的管徑大小注意：每個樣品做兩個孔即可。成環(huán)與細胞的密度有關，細

42、胞少則無法成環(huán)，細胞太多會大片生長，也無法成環(huán)，可以做個預實驗探索下細胞的密度。血管形成實驗需要高濃度的基質膠，基質膠濃度太低膠原蛋白等含量不夠很難成管。系時候成管所需時間較長。在顯微鏡下觀察，膠時三維的，所以細胞長在上面不可能完全聚焦清楚，拍照時應選較為清晰呈現小管的圖片即可。在拍照的時候最好找同一個視野進行拍照，最好為中部。因為邊緣效應，孔邊上的細胞更易成環(huán)。血液相容性一、溶血率實驗實驗目的：檢測含銅鈦合金對血液中紅細胞的破溶血作用實驗步驟：實驗材料：抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6A1-4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、陰性對照組（PBS）,陽性對照組（超純

43、水）取新鮮抗凝血8mL，加PBS10mL稀釋（4:5）抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6Al-4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金與適量無菌PBS混合，按照材料表面積與浸提液體積比為1.25cm2/10mL的標準，每組各3管（24孔板加厚：5.28cm2，24孔板：3.96cm2，小：2.20cm2，單位面積的液體體積相同即可）陰性對照組3管，每管加同批號PBS10mL。陽性對照組3管，每管超純水10mL全部試管浸入37C水浴槽中30min，每管加稀釋血0.2mL,輕輕混勻后置于37C水浴槽中繼續(xù)保溫60min取各試管內液體3000rpm離心5min，吸取上清150uL

44、放入96孔板,于分光光度計545nm波長處測定吸光度取3次實驗的平均值計算溶血率（Hemolysisrate，HR）:HR=（樣品吸光度-陰性對照吸光度）/（陽性對照吸光度-陰性對照吸光度）X100%按ISO規(guī)定溶血率三5%,則材料符合醫(yī)用植入材料的溶血實驗要求；溶血率5%,則表示實驗材料有溶血作用。Ilbk2Valuerofopiccaldensinaibdhaemclysispercwit-ngsfwdifkreniironbnwdfoamsOpliLalderiibityHacrn戶i譏足PtisdcKecorn曲葉甌1.00hvegjLivgcrflErcI汕島Fe0.0487土0.0

45、03673.467土ft.557Fe-CKTsO.U3413土D.JU3333-72XJ0310D.OWJ土0.DO2671.090=1=0.41(SinteredmetallicfoamsforbiodegradablebonereplacementMaterials,JPorousMater(2014)21:131-40;DOI10.1007/s10934-013-9757-4二、粘附在材料表面的紅細胞的SEM實驗實驗目的：檢測血液中紅細胞在不同合金表面的粘附狀態(tài)實驗步驟：1、實驗材料：抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6A1-4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、2

46、、取新鮮抗凝血8mL,加PBS10mL稀釋（4:5）3、抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6Al-4V合金、稀土含銅鈦合金,純鈦、純銅、鈦銅合金與適量稀釋血液混合后，37C培養(yǎng)箱中孵育30min。4、棄血液，PBS洗兩次，每個樣品加入800uL的2.5%的戊二醛進行固定（室溫60min）,然后用PBS緩沖液輕輕沖洗2遍，每次5min。5、使用30%，50%，60%,70%,90%,100%的酒精逐步脫水，每次5min6、HCP-2臨界點干燥儀干燥2小時7、樣品上銅臺，Pelco.Sc-7自動鍍金儀鍍金8、SEM鏡下觀察紅細胞形態(tài)。Asurface-erodingpoly(1,3-t

47、rimethylenecarbonate)coatingforfullybiodegradablemagnesium-basedstentapplications:Towardbetterbiofunction,biodegradationandbiocompatibility,ActaBiomaterialia9(2013)8678-689說明：正常紅細胞為圓形面包圈形狀，當紅細胞形狀變成不規(guī)則時，說明材料對紅細胞有溶血作用，血液相容性不理想。血小板粘附實驗材料數量：每種材料2個樣品，1個時間點，每個時間點2個平行樣。PRP（富血小板血漿）waspreparedbycentrifugingw

48、holebloodfor10minat1000rpm.（血小板在上層清液）PRPwasdrippedontothesample（300uL/孔）platesandincubatedat37Cforlh。（材料先放入24孔板,PBSwasusedtoremovenon-adherentplatelets（2）每孔加入300uL的2.5%的戊二醛進行固定（室溫60min）,然后用PBS緩沖液輕輕沖洗2遍，每次5min。使用30%,50%,60%,70%,90%,100%的酒精逐步脫水，每次5minHCP-2臨界點干燥儀干燥2小時樣品上銅臺，Pelco.Sc-7自動鍍金儀鍍金SEM鏡下觀察細胞形態(tài)。

49、Asurface-erodingpoly（l,3-trimethylenecarbonate）coatingforfullybiodegradablemagnesium-basedstentapplications:Towardbetterbiofunction,biodegradationandbiocompatibility,ActaBiomaterialia9(2013)8678-689說明：血小板是由紅骨髓中巨核細胞破碎后形成的一種無色、體積小、形態(tài)不規(guī)則的小體，初生時體積較大，衰老時則較小，平均壽命為3-5天。血小板具有粘附于異物表面的功能，可發(fā)生粘附、變形、聚集、釋放等反應，相同實

50、驗條件下，若材料表面上的血小板粘附數量少，聚集少，變形少（血小板不長出多余偽足），則表面其血液相容性好。粘附在異物表面的血小板主要分為五類形狀：圓形，樹突狀，散布樹枝狀，鋪展和充分鋪展。蛋白粘附實驗目的：看材料蛋白粘附情況。實驗背景：細胞在生物材料表面的粘附是通過生物識別過程來實現的。當生物材料與血液、組織液以及含有血清的培養(yǎng)基接觸時，材料的表面會迅速地吸附一層蛋白質分子，然后才是細胞到達材料的表面，即細胞通過整合素與生物材料相黏附。材料表面性質通過影響粘連蛋白的黏附來影響細胞。實驗原理：BCA（Bicinchoninicacid）法是目前應用比較廣泛的蛋白質濃度測定方法?；陔p縮脲反應，即在

51、堿性環(huán)境下蛋白質將Cu2+還原成Cu+，產生一種紫藍色復合物，在562nm處有高的吸光值，該反應產物的量與蛋白質濃度成正比。材料數量：每種材料,1個時間點，每個時間點2個平行樣。實驗步驟：消毒材料分組：Ti，Ti-5Cu,TC4,TC4-5Cu,Cu,稀土鈦（6種材料，3個平行樣）。材料編號，將不同型號材料分別植入24孔板和48孔板，每孔加1000uL（24孔板）和600ul（48孔板）培養(yǎng)液（a-MEM）（無細胞），將各培養(yǎng)板置于37C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。4h后取出24孔板和48孔板，吸棄培養(yǎng)液，生理鹽水沖洗3遍,將材料轉移至新的24孔板和四十八孔板內（材料和板孔相差不大可不換新的

52、板），在新的培養(yǎng)板內每孔加入0.2%tritonx-100裂解液500ul（24孔板）和300ul（48孔板）過夜，4度。取裂解液25ul于96孔板,再加入200ul的BCA（A液:B液=50:1），37C孵育30min后，96孔板于酶標儀下檢測吸光值OD。（562nm）根據擬合好的標準曲線所得公式計算蛋白總量，式中X為OD值,Y為蛋白質濃度，單位為（ug/ml）。EZZ3JDBMIIHF-JDBMz.o-21.Q-D.5-1d1DdFig.3DegradaLJOiiraieotJUBMandHF-JDBMforIdacidJUdimmersiontestinDMEM+K)%FBSutider

53、cellcultureconditioncalculatedbymasslossmethod(*FHCI(pHB6)10%SOS忙咯過Kt醸錢TEMED1ft%GoifeOLSMTris-Md(pHB創(chuàng)10%SDS10%過BE酸黏TEMED1?%GelHsO30%Acrylamide1.SMTri-HCI蟲衛(wèi))10%SOS苗第過磕醸蛀TEMED15MiH?O30%crylandig1；MPisHCIeHfi.E)10%過it皤卷TEMED耳0(M.6M.3.0血.0121.1.o./段1$1.71.30.050.05也血1.61.10.0500503830611呂22.d.aC67511_M4,2.2Qo.c-4.03.32.60.1fl.1Cl.d043.34.0站0101(100496A-17.3