細胞增殖檢測(08碩)課件

細胞增殖活性與凋亡的形態(tài)學檢測方法

細胞增殖細胞凋亡細胞增殖檢測

Methodsforstudyingcellproliferationandviabilityincellpopulations

（一）間期：分為三期、即DNA合成前期（G1）、DNA合成期（S）與DNA合成后期（G2）。（二）分裂期：細胞的有絲分裂（M）需經(jīng)前、中、后，末期，是一個連續(xù)變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。細胞增殖檢測方法

目前主要有兩種檢測細胞增殖能力的方法。直接方法:通過直接測定進行分裂的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。（DNAsynthesis）間接方法:細胞活力檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。（metabolicactivity）直接方法:胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法

Brdu檢測法間接方法：

MTT檢測法羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法間接方法在一些情況下，細胞活力的檢測相當于細胞增殖能力的測定。主要采用特殊的試劑MTT

MTT及其他四唑鹽來測定細胞的代謝活力，通過檢測細胞的氧化還原活性來檢測細胞增殖能力.

(三)MTT檢測法

MTT檢測法主要反映細胞的能量代謝，是檢測細胞增殖活力的一種簡便準確的方法。其原理是在活細胞生長和增殖過程中，線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲臜（Formazan），生成的甲臜量的多少與細胞的數(shù)量和細胞的活力成正比(四)羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團，使CFSE成為一種良好的細胞標記物。CFSE進入細胞后可以不可逆地與細胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。當細胞分裂時，CFSE標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。在一個增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進行分析。細胞凋亡檢測方法細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，它不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。

區(qū)別點細胞凋亡細胞壞死起因生理或病理性病理性變化或劇烈損傷范圍單個散在細胞大片組織或成群細胞細胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體破損染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀呈絮狀細胞器無明顯變化腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解細胞體積固縮變小腫脹變大凋亡小體有，被鄰近細胞或巨噬細胞吞噬無，細胞自溶，殘余碎片被巨噬細胞吞噬基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀隨機降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質(zhì)合成有無調(diào)節(jié)過程受基因調(diào)控被動進行炎癥反應(yīng)無，不釋放細胞內(nèi)容物有，釋放內(nèi)容物。

（一）細胞凋亡的形態(tài)學檢測1光學顯微鏡和倒置顯微鏡2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡3透射電子顯微鏡觀察4TUNEL法DNA片斷化檢測

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNAladder的形成。TUNEL法

細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3‘-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL（TdTmediateddUTPnickendlabeling））。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL是分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原