生物制藥之胰島素課件

生物制藥

之

胰島素生物制藥

之

1主要內(nèi)容1、胰島素簡(jiǎn)介2、胰島素的功能作用3、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素4、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用主要內(nèi)容1、胰島素簡(jiǎn)介21.1、胰島素（insulin）定義：由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。1.1、胰島素（insulin）定義：由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性31.2、胰島素的發(fā)現(xiàn)1921年----從動(dòng)物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。

1926年----重結(jié)晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長(zhǎng)效動(dòng)物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長(zhǎng)效人胰島素類似物。

1.2、胰島素的發(fā)現(xiàn)1921年----從動(dòng)物胰腺中提取出胰島41.3、胰島素結(jié)構(gòu)組成胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。人胰島素A鏈有11種21個(gè)氨基酸，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共26種51個(gè)氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個(gè)二硫鍵1.3、胰島素結(jié)構(gòu)組成胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。5人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)豬胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)豬胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)61.4、胰島素的空間構(gòu)型胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）1.4、胰島素的空間構(gòu)型胰島素二聚體（dimer）胰72、胰島素的功能作用主要功能：2.1、調(diào)節(jié)糖代謝；2.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝；2.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝；2.4、其它功能2.5、體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素2、胰島素的功能作用主要功能：82.1、調(diào)節(jié)糖代謝

胰島素能促進(jìn)全身組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，并抑制糖原的分解和糖原異生，因此，胰島素有降低血糖的作用。2.1、調(diào)節(jié)糖代謝9胰島素降血糖是多方面作用的結(jié)果（1）促進(jìn)肌肉、脂肪組織等處的靶細(xì)胞細(xì)胞膜載體將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。（2）通過共價(jià)修飾增強(qiáng)磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP濃度，從而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。（3）通過激活丙酮酸脫氫酶磷酸酶而使丙酮酸脫氫酶激活，加速丙酮酸氧化為乙酰輔酶A，加快糖的有氧氧化。（4）通過抑制PEP羧激酶的合成以及減少糖異生的原料，抑制糖異生。（5）抑制脂肪組織內(nèi)的激素敏感性脂肪酶，減緩脂肪動(dòng)員，使組織利用葡萄糖增加。胰島素降血糖是多方面作用的結(jié)果（1）促進(jìn)肌肉、脂肪組織等處102.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝胰島素能促進(jìn)脂肪的合成與貯存，使血中游離脂肪酸減少，同時(shí)抑制脂肪的分解氧化。胰島素缺乏可造成脂肪代謝紊亂，脂肪貯存減少，分解加強(qiáng)，血脂升高，久之可引起動(dòng)脈硬化，進(jìn)而導(dǎo)致心腦血管的嚴(yán)重疾患；與此同時(shí)，由于脂肪分解加強(qiáng)，生成大量酮體，出現(xiàn)酮癥酸中毒。2.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝胰島素能促進(jìn)脂肪的合成與貯存，使血112.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝胰島素一方面促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氨基酸的攝取和蛋白質(zhì)的合成，一方面抑制蛋白質(zhì)的分解，因而有利于生長(zhǎng)。腺垂體生長(zhǎng)激素的促蛋白質(zhì)合成作用，必須有胰島素的存在才能表現(xiàn)出來。因此，對(duì)于生長(zhǎng)來說，胰島素也是不可缺少的激素之一。2.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝胰島素一方面促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氨基酸的122.4、其它功能胰島素可促進(jìn)鉀離子和鎂離子穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；可促進(jìn)脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。2.4、其它功能胰島素可促進(jìn)鉀離子和鎂離子穿過細(xì)胞膜進(jìn)132.5、體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素主要有胰升糖素、腎上腺素及去甲腎上腺素、腎上腺皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素等。它們都能使血糖升高。胰島素與胰高血糖素的拮抗作用2.5、體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素主要有胰升糖143、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素提取步驟：3.1、提取目的基因3.2、提取質(zhì)粒3.3、基因重組3.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌3.5、胰島素的產(chǎn)生3、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素提取步驟：153.1、提取目的基因既從人的DNA中提取胰島素基因,可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。1.鳥槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)附近基因進(jìn)行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，可用DNA分子雜交，即DNA探針。2.人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒有內(nèi)含子。3.從基因文庫中提?。阂簿褪鞘孪纫呀?jīng)提取完畢的拿來用。4.PCR擴(kuò)增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運(yùn)作。3.1、提取目的基因既從人的DNA中提取胰島素基因,163.2、提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。此質(zhì)粒將作為胰島素基因的載體。提取方法：

1.堿裂解法：在pH12.012.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快。2.煮沸法

：將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。3.小量一步提取法：由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機(jī)械力后細(xì)菌染色體DNA會(huì)被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機(jī)械力質(zhì)粒DNA會(huì)變性，機(jī)械力后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性要快于細(xì)菌染色體DNA。3.2、提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。此173.3、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開,再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”,形成一個(gè)能表達(dá)出胰島素的DNA質(zhì)粒。3.3、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性183.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì),如CaCl2,這使細(xì)胞會(huì)吸收外源基因.此時(shí)將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中,大腸桿菌便會(huì)將重組質(zhì)粒吸收.將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入受體細(xì)胞，此時(shí)的細(xì)胞處于感受態(tài)（理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)）。3.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+193.5、胰島素的產(chǎn)生在大腸桿菌內(nèi),質(zhì)粒通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后,便產(chǎn)生出胰島素蛋白質(zhì).通過大腸桿菌的大量繁衍,便可大量生產(chǎn)出胰島素!注意：大腸桿菌產(chǎn)出的是多肽鏈，因?yàn)樵松餂]有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，不能進(jìn)行多肽的折疊、修飾等，還需人為進(jìn)行菌體外加工。3.5、胰島素的產(chǎn)生在大腸桿菌內(nèi),質(zhì)粒通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后,20基本

流程圖質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切

提取質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切基本

流程圖質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)214、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1、固液分離技術(shù)4.2、菌體收集4.3、晶體收集4.4、前景展望4、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用224.1、新型固液分離技術(shù)又稱：中空纖維膜過濾技術(shù)近二十年來，中空纖維膜過濾技術(shù)在生物技術(shù)諸多應(yīng)用領(lǐng)域得到深入研究，其優(yōu)良的物理化學(xué)耐受性(Compatibility)、可放大性(Scalability)和工藝耐用性(Robustness)已得到國(guó)際生物制藥行業(yè)廣泛認(rèn)可，有利于提高工藝放大成功率，改進(jìn)生產(chǎn)效率，顯著降低生產(chǎn)成本。4.1、新型固液分離技術(shù)又稱：中空纖維膜過濾技術(shù)近23生物制藥之胰島素課件24應(yīng)用實(shí)例中空纖維膜過濾技術(shù)屬于現(xiàn)代生物分離技術(shù)，無篩網(wǎng)的管狀流道有效避免循環(huán)湍流，提供溫和剪切力的過濾方式，有利于保護(hù)蛋白活性和完整性；同時(shí)開放式的膜管結(jié)構(gòu)具有更高的容塵量，可以直接處理高固含量的復(fù)雜料液，常用于不同規(guī)模高密度發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離。如：高密度CHO細(xì)胞培養(yǎng)液澄清生產(chǎn)單克隆抗體；發(fā)酵液細(xì)胞或菌體收集；包涵體蛋白收集/洗滌；病毒類大分子溫和濃縮和洗濾等。應(yīng)用實(shí)例中空纖維膜過濾技術(shù)屬于現(xiàn)代生物分離技術(shù)，無篩254.2、菌體收集相比傳統(tǒng)離心操作，中空纖維膜過濾技術(shù)具有處理速度快、壽命長(zhǎng)、設(shè)備日常維護(hù)簡(jiǎn)單、可直接線性放大等特點(diǎn)，可以更好的滿足重組胰島素藥物生產(chǎn)過程中數(shù)十噸級(jí)規(guī)模發(fā)酵液菌體收集對(duì)生產(chǎn)工藝重復(fù)性、工藝可放大性和經(jīng)濟(jì)性的要求。對(duì)于固含量較高的粘稠料液，推薦選擇0.75mm(D柱)或1mm(E柱)纖維內(nèi)徑的濾膜。此工藝集成菌體收集和洗滌步驟，可以避免多次反復(fù)離心等繁冗操作，最終得到65%固含量(650g濕菌體/L)的菌體懸液，可直接用于接下來的細(xì)胞破碎步驟。目前，此工藝已經(jīng)成功線性放大到1000L以上的發(fā)酵規(guī)模。4.2、菌體收集相比傳統(tǒng)離心操作，中空纖維膜過濾技術(shù)具有處理26生物制藥之胰島素課件274.3、晶體收集傳統(tǒng)晶體收集方法是多步層析精細(xì)純化得到的胰島素在冷凍干燥之前，常采用多次結(jié)晶和洗滌工藝進(jìn)一步去除雜質(zhì)、提高產(chǎn)品純度。

4.3、晶體收集傳統(tǒng)晶體收集方法是多步層析精細(xì)純化得28顯微鏡下的胰島素結(jié)晶體顯微鏡下的胰島素結(jié)晶體29采用中空纖維成功將重組胰島素晶體懸液進(jìn)行高速濃縮收集以顯著減小體積，封閉的系統(tǒng)有利于保護(hù)產(chǎn)品不受外源因子污染，中空纖維0.45μm微濾膜表現(xiàn)出眾。高透過通量使得相對(duì)較小的膜面積和切向流系統(tǒng)處理較大體積料液成為可能，較小的系統(tǒng)將系統(tǒng)死體積降到最低，有利于進(jìn)一步提高產(chǎn)品回收率。采用中空纖維成功將重組胰島素晶體懸液進(jìn)行高速濃縮收集以304.4、前景展望盡管我國(guó)已成功建立超過30噸發(fā)酵體積的大規(guī)模重組人胰島素藥物生產(chǎn)線，但由于重組胰島素生產(chǎn)技術(shù)路線復(fù)雜、工藝和質(zhì)量要求較高，國(guó)內(nèi)外主要市場(chǎng)目前仍為幾大跨國(guó)公司占據(jù)。為了增強(qiáng)國(guó)產(chǎn)自主胰島素藥物競(jìng)爭(zhēng)力，需要采用新型現(xiàn)代生物工藝加工技術(shù)和過程控制/分析工具，如高密度發(fā)酵和過程控制、新型膜過濾和工業(yè)層析技術(shù)、生物分子微量熱制劑技術(shù)等，以進(jìn)一步改進(jìn)生產(chǎn)效率和工藝控制水平、提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本，從而實(shí)現(xiàn)成功高效的工藝生產(chǎn)放大，加速重組人胰島素藥物的現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。4.4、前景展望盡管我國(guó)已成功建立超過30噸發(fā)酵31生物制藥之胰島素課件32生物制藥之胰島素課件33生物制藥

之

胰島素生物制藥

之

34主要內(nèi)容1、胰島素簡(jiǎn)介2、胰島素的功能作用3、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素4、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用主要內(nèi)容1、胰島素簡(jiǎn)介351.1、胰島素（insulin）定義：由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。1.1、胰島素（insulin）定義：由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性361.2、胰島素的發(fā)現(xiàn)1921年----從動(dòng)物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。

1926年----重結(jié)晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長(zhǎng)效動(dòng)物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長(zhǎng)效人胰島素類似物。

1.2、胰島素的發(fā)現(xiàn)1921年----從動(dòng)物胰腺中提取出胰島371.3、胰島素結(jié)構(gòu)組成胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。人胰島素A鏈有11種21個(gè)氨基酸，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共26種51個(gè)氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個(gè)二硫鍵1.3、胰島素結(jié)構(gòu)組成胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。38人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)豬胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)豬胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)391.4、胰島素的空間構(gòu)型胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）1.4、胰島素的空間構(gòu)型胰島素二聚體（dimer）胰402、胰島素的功能作用主要功能：2.1、調(diào)節(jié)糖代謝；2.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝；2.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝；2.4、其它功能2.5、體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素2、胰島素的功能作用主要功能：412.1、調(diào)節(jié)糖代謝

胰島素能促進(jìn)全身組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，并抑制糖原的分解和糖原異生，因此，胰島素有降低血糖的作用。2.1、調(diào)節(jié)糖代謝42胰島素降血糖是多方面作用的結(jié)果（1）促進(jìn)肌肉、脂肪組織等處的靶細(xì)胞細(xì)胞膜載體將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。（2）通過共價(jià)修飾增強(qiáng)磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP濃度，從而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。（3）通過激活丙酮酸脫氫酶磷酸酶而使丙酮酸脫氫酶激活，加速丙酮酸氧化為乙酰輔酶A，加快糖的有氧氧化。（4）通過抑制PEP羧激酶的合成以及減少糖異生的原料，抑制糖異生。（5）抑制脂肪組織內(nèi)的激素敏感性脂肪酶，減緩脂肪動(dòng)員，使組織利用葡萄糖增加。胰島素降血糖是多方面作用的結(jié)果（1）促進(jìn)肌肉、脂肪組織等處432.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝胰島素能促進(jìn)脂肪的合成與貯存，使血中游離脂肪酸減少，同時(shí)抑制脂肪的分解氧化。胰島素缺乏可造成脂肪代謝紊亂，脂肪貯存減少，分解加強(qiáng)，血脂升高，久之可引起動(dòng)脈硬化，進(jìn)而導(dǎo)致心腦血管的嚴(yán)重疾患；與此同時(shí)，由于脂肪分解加強(qiáng)，生成大量酮體，出現(xiàn)酮癥酸中毒。2.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝胰島素能促進(jìn)脂肪的合成與貯存，使血442.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝胰島素一方面促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氨基酸的攝取和蛋白質(zhì)的合成，一方面抑制蛋白質(zhì)的分解，因而有利于生長(zhǎng)。腺垂體生長(zhǎng)激素的促蛋白質(zhì)合成作用，必須有胰島素的存在才能表現(xiàn)出來。因此，對(duì)于生長(zhǎng)來說，胰島素也是不可缺少的激素之一。2.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝胰島素一方面促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氨基酸的452.4、其它功能胰島素可促進(jìn)鉀離子和鎂離子穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；可促進(jìn)脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。2.4、其它功能胰島素可促進(jìn)鉀離子和鎂離子穿過細(xì)胞膜進(jìn)462.5、體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素主要有胰升糖素、腎上腺素及去甲腎上腺素、腎上腺皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素等。它們都能使血糖升高。胰島素與胰高血糖素的拮抗作用2.5、體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素體內(nèi)對(duì)抗胰島素的激素主要有胰升糖473、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素提取步驟：3.1、提取目的基因3.2、提取質(zhì)粒3.3、基因重組3.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌3.5、胰島素的產(chǎn)生3、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素提取步驟：483.1、提取目的基因既從人的DNA中提取胰島素基因,可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。1.鳥槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)附近基因進(jìn)行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，可用DNA分子雜交，即DNA探針。2.人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒有內(nèi)含子。3.從基因文庫中提取：也就是事先已經(jīng)提取完畢的拿來用。4.PCR擴(kuò)增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運(yùn)作。3.1、提取目的基因既從人的DNA中提取胰島素基因,493.2、提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。此質(zhì)粒將作為胰島素基因的載體。提取方法：

1.堿裂解法：在pH12.012.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快。2.煮沸法

：將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。3.小量一步提取法：由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機(jī)械力后細(xì)菌染色體DNA會(huì)被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機(jī)械力質(zhì)粒DNA會(huì)變性，機(jī)械力后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性要快于細(xì)菌染色體DNA。3.2、提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。此503.3、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開,再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”,形成一個(gè)能表達(dá)出胰島素的DNA質(zhì)粒。3.3、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性513.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì),如CaCl2,這使細(xì)胞會(huì)吸收外源基因.此時(shí)將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中,大腸桿菌便會(huì)將重組質(zhì)粒吸收.將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入受體細(xì)胞，此時(shí)的細(xì)胞處于感受態(tài)（理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)）。3.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+523.5、胰島素的產(chǎn)生在大腸桿菌內(nèi),質(zhì)粒通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后,便產(chǎn)生出胰島素蛋白質(zhì).通過大腸桿菌的大量繁衍,便可大量生產(chǎn)出胰島素!注意：大腸桿菌產(chǎn)出的是多肽鏈，因?yàn)樵松餂]有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，不能進(jìn)行多肽的折疊、修飾等，還需人為進(jìn)行菌體外加工。3.5、胰島素的產(chǎn)生在大腸桿菌內(nèi),質(zhì)粒通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后,53基本

流程圖質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切

提取質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切基本

流程圖質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)544、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1、固液分離技術(shù)4.2、菌體收集4.3、晶體收集4.4、前景展望4、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用554.1、新型固液分離技術(shù)又稱：中空纖維膜過濾技術(shù)近二十年來，中空纖維膜過濾技術(shù)在生物技術(shù)諸多應(yīng)用領(lǐng)域得到深入研究，其優(yōu)良的物理化學(xué)耐受性(Compatibility)、可放大性(Scalability)和工藝耐用性(Robustness)已得到國(guó)際生物制藥行業(yè)廣泛認(rèn)可，有利于提高工藝放大成功率，改進(jìn)生產(chǎn)效率，顯著降低生產(chǎn)成本。4.1、新型固液分離技術(shù)又稱：中空纖維膜過濾技術(shù)近56生物制藥之胰島素課件57應(yīng)用實(shí)例中空纖維膜過濾技術(shù)屬于現(xiàn)代生物分離技術(shù)，無篩網(wǎng)的管狀流道有效避免循環(huán)湍流，提供溫和剪切力的過濾方式，有利于保護(hù)蛋白活性和完整性；同時(shí)開放式的膜管結(jié)構(gòu)具有更高的容塵量，可以直接處理高固含量的復(fù)雜料液，常用于不同規(guī)模高密度發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離。如：高密度CHO細(xì)胞培養(yǎng)液澄清生產(chǎn)單克隆抗體；發(fā)酵液細(xì)胞或菌體收集；包涵體蛋白收集/洗滌；病毒類大分子溫和濃縮和洗