實驗九植物單細(xì)胞分離技術(shù)理論

實驗九植物單細(xì)胞分離技術(shù)（理論）一、植物細(xì)胞培養(yǎng)概述指以單細(xì)胞（singlecell）或細(xì)胞團（cellaggregate為單位進(jìn)行的植物組織培養(yǎng)方式。1、技術(shù)特點：?操作簡單?試驗重復(fù)性好?單次實驗群體大2、培養(yǎng)的植物細(xì)胞的特點A、培養(yǎng)時生長速度慢B、宜徑為20~150um,比細(xì)菌大C、纖維素細(xì)胞壁非常脆弱D、生理與代謝活性低E、需求官養(yǎng)成分復(fù)雜F、不易于保存G、次生物質(zhì)的合成與積累和細(xì)胞分化過程有關(guān)3、細(xì)胞培養(yǎng)液的性質(zhì)?培養(yǎng)液具有一定的黏度?提供細(xì)胞生長發(fā)育所需的營養(yǎng)?黏度隨細(xì)胞濃度的增加而增大?需不停攪拌而進(jìn)行通氣二、植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（一）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點A、提供大量的均勻的植物細(xì)胞B、細(xì)胞增殖速度比愈傷組織快C、適宜大規(guī)模培養(yǎng)D、增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)E、避免有害物質(zhì)的過分積累F、保證氧的充分供給（二）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的建立與測定1、誘導(dǎo)建立誘導(dǎo)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法A、選擇一塊易破碎的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到適合的培養(yǎng)液中，經(jīng)1~2個周期振蕩培養(yǎng)，得到呈分散狀的細(xì)胞培養(yǎng)物。B、選擇有用的培養(yǎng)材料，進(jìn)行勻漿處理，過濾，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。C、選擇有用的材料多次轉(zhuǎn)移與液體振蕩培養(yǎng)，得到分散程度高的細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)的材料：愈傷組織的疏松程度、分散效果的好壞。2、生長與增殖擴增曲線：S形?延遲期、對數(shù)生長期、平臺期、衰減期懸浮培養(yǎng)細(xì)胞起始濃度：?一般在0.5x105~2.5X105個/ml?懸浮培養(yǎng)的單個細(xì)胞，3~5d可見分裂狀況3、懸浮培養(yǎng)物的保持A、培養(yǎng)瓶100ml或250ml的三角瓶作容器?裝20ml或50ml的培養(yǎng)液B、振蕩培養(yǎng)裝置?旋轉(zhuǎn)式搖床?轉(zhuǎn)速控制在120r/min以下?體積不宜過大，溫度可調(diào)C、繼代培養(yǎng)?定期繼代培養(yǎng)，最適周期為1~2周?繼代時間為1周的可用1:4的接種量?繼代時間為2周的可用1:10的接種量?移液管口徑可稍大，易吸取細(xì)胞?接種前后要用酒精燈灼燒瓶口?定期檢查是否有微生物污染4、生長測定?對任何一建立細(xì)胞系都應(yīng)進(jìn)行生長動態(tài)測定?不同培養(yǎng)基及不同條件，細(xì)胞的最大生長速率可由細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞干重或細(xì)胞蛋白的對數(shù)對培養(yǎng)時間作坐標(biāo)而測定?臨界起始濃度：低于此值，細(xì)胞無法生長，略高于此值，則延遲期伸長§常用的生長測定方法A、細(xì)胞計數(shù)血球計數(shù)板：計算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=5大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)X5X104x稀釋倍數(shù)B、細(xì)胞體積?一定量的細(xì)胞懸浮液放入15ml刻度的離心管中離心?以每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞體積的毫升數(shù)來表示細(xì)胞體積C、細(xì)胞的鮮重與干重?將一定量的細(xì)胞懸浮液加到預(yù)先稱重的尼龍布上，用水沖洗并抽濾，然后稱重?測干重時，將離心收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的定量濾紙上，然后80C烘箱內(nèi)10~12h,在干燥器中冷卻稱重?細(xì)胞鮮重與干重一般以每毫升懸浮培養(yǎng)物的重量表示（三）懸浮培養(yǎng)工藝1、成批培養(yǎng)把細(xì)胞接種到一個與外界隔絕的只允許氣體和揮發(fā)性的代謝物質(zhì)交換的、營養(yǎng)液體積保持不變的密閉系統(tǒng)中培養(yǎng)。特點a、培養(yǎng)系統(tǒng)密閉b、培養(yǎng)基體積固定c、培養(yǎng)數(shù)目、總重量、DNA含量變化，呈一個“S曲線d、使細(xì)胞保持對數(shù)生長e、細(xì)胞在培養(yǎng)液中分布均勻。2、連續(xù)培養(yǎng)用一定容積但非密閉的特別容器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的方法。特點a、使細(xì)胞保持在增殖最快的對數(shù)生長期b、具有穩(wěn)定的培養(yǎng)狀態(tài)c、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)3、分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)比較（四）懸浮植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器1、類型：機械攪拌式、氣動式、混合式A、機械攪拌式特點：?剪切力大，對細(xì)胞易傷害?消耗功率大?易形成供氧不足?易產(chǎn)生死角解決途徑：?建立抗剪切力的細(xì)胞株系?改造反應(yīng)容器結(jié)構(gòu)B、氣動式攪拌反應(yīng)器類型：鼓泡式和氣升式特點：?剪切力小?傳質(zhì)效果好?運行成本和造價低?結(jié)構(gòu)簡單?易保持無菌三、固相化培養(yǎng)（一）固相化細(xì)胞把細(xì)胞固定在一種惰性基質(zhì)，如瓊脂、藻酸鹽、纖維膜等上面或里面，細(xì)胞不能運動，而營養(yǎng)液可在細(xì)胞間流動，供應(yīng)其營養(yǎng)。特點：A、可消除或極大減弱流質(zhì)引起的切變力B、細(xì)胞緩慢生長，次生代謝物占優(yōu)勢C、細(xì)胞之間緊密接觸，利于次生代謝D、便于操作E、便于次生代謝物的收集F、可連續(xù)地對細(xì)胞作各種化學(xué)處理G、可向反應(yīng)器中提供大量的、濃度極低的毒性代謝物，從培養(yǎng)基獲得代謝物（二）固相化方法A、褐藻酸和藻酸鹽褐藻酸：海草灰分離產(chǎn)物，多聚體藻酸鹽：葡糖醛酸和甘露糖醛酸組成的多糖，在Ca++存在下，形成鹽膠B、甲叉藻聚糖K+存在下，形成強力膠，需先加熱熔化常選用低熔點（5%濃度時，30~35C）C、瓊脂糖與瓊脂凝固劑、無毒、很好的固相化材料、現(xiàn)在常選用（三）固相化細(xì)胞活力檢測A、成活力染色熒光素二醋酸（FDA）、苯番紅染色觀察B、質(zhì)壁分離測定質(zhì)膜完整性；質(zhì)壁分離劑：甘油、山梨醇C、呼吸作用懸浮培養(yǎng)，測定培養(yǎng)時間與耗氧量關(guān)系D、細(xì)胞生長以相對干重表示E、32P核磁共振（四）固相化細(xì)胞生物反應(yīng)器1、特點：?消除或極大地減弱流質(zhì)引起的切變力?有利于次級代謝物的積累?有利于產(chǎn)物的合成與分泌?有利于連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化2、固相化方法：凝膠包埋、表面吸附、膜固定、網(wǎng)格固定等A、填充床反應(yīng)器B、流化床反應(yīng)器C、膜生物反應(yīng)器主要適應(yīng)于分泌產(chǎn)物到體外的細(xì)胞培養(yǎng)體系（五）影響因素1、遺傳特性2、環(huán)境條件：光、溫、pH、培養(yǎng)基成分等四、單細(xì)胞培養(yǎng)（一）單細(xì)胞分離方法1、機械法利用葉肉組織排列疏松、細(xì)胞間接觸較少的特點，將葉片輕輕研碎,經(jīng)過濾和離心，收集和凈化細(xì)胞。優(yōu)點a、細(xì)胞未受酶傷害b、有利于細(xì)胞的生理和生化研究c、無須質(zhì)壁分離2、酶法利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他外植體，使細(xì)胞分離優(yōu)點：是可以得到較多的游離細(xì)胞3、化學(xué)法利用一些化學(xué)藥劑游離細(xì)胞。如秋水仙堿等特點：分離細(xì)胞數(shù)量大、易引起細(xì)胞改變（二）單細(xì)胞培養(yǎng)植物單個細(xì)胞培養(yǎng)，最終目的是長成一株完整的植株。培養(yǎng)方法：平板培養(yǎng)、條件培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)1、平板培養(yǎng)按一定細(xì)胞密度制備好單細(xì)胞懸浮液，再將含0.6%瓊脂的培養(yǎng)基加熱熔化后冷卻至35C左右，尚未凝固時與細(xì)胞懸浮液混合迅速倒入培養(yǎng)皿中形成一平板進(jìn)行培養(yǎng)。特點：?單細(xì)胞在培養(yǎng)基分布均勻?便于定點觀察?篩選效率高、量大?操作簡便?通氣狀況不佳?排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收植板率計算公式：植板率高低隨細(xì)胞種類、接種密度及培養(yǎng)基成分不同而異細(xì)胞接種密度，一般不低于103~104個/L2、條件培養(yǎng)選用的培養(yǎng)基中，加入一定量已生長過組織或細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法。?起始細(xì)胞密度高時，成分可簡單些；相反，成分就復(fù)雜些。?高密度細(xì)胞群體，在分裂臨界度以上的細(xì)胞，能較快地分裂。3、看護(hù)培養(yǎng)是用一塊活躍生長的愈傷組織來促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的方法。特點是簡便易行，效果好，但顯微鏡下難以追蹤細(xì)胞分裂、生長過程。4、微室培養(yǎng)是在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團的方法。特點是能連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，但培養(yǎng)基量少，培養(yǎng)時間短。5、液體淺層培養(yǎng)先在培養(yǎng)皿中注入淺層液體培養(yǎng)基，再接種已分散的單細(xì)胞的培養(yǎng)方法。6、其他培養(yǎng)方式膜室培養(yǎng)、雙層濾紙培養(yǎng)（三）單細(xì)胞培養(yǎng)程序建立細(xì)胞株、高產(chǎn)細(xì)胞株的選擇、分化培養(yǎng)或擴大培養(yǎng)、鑒定和提取1、建立細(xì)胞株A、確定材料?選擇易于分散的花粉為材料?分散性好的愈傷組織材料?直接從葉肉、根尖、髓組織取材B、懸浮細(xì)胞液的制備?振蕩培養(yǎng)分散性好的材料，提取?用孔徑為200~300目的網(wǎng)過濾收集2、起始濃度控制?細(xì)胞密度?起始細(xì)胞密度：臨界密度3、高產(chǎn)細(xì)胞株的選擇?細(xì)胞株：在培養(yǎng)基上生長出的每個細(xì)胞團都來白一個細(xì)胞的分裂。?初步鑒定和測定?高抗、高品質(zhì)、高產(chǎn)4、分化培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)5、鑒定與提?。ㄋ模┯绊懸蛩?營養(yǎng)條件：要求更高?環(huán)境條件：要求更高?初始細(xì)胞密度?條件培養(yǎng)基?生長調(diào)節(jié)劑?pH值五、植物細(xì)胞