核酸雜交技術-分子生物學課件

NucleicAcidHybridization

核酸雜交技術NucleicAcidHybridization

核酸雜1主要內容

核酸探針

核酸雜交概念及原理

核酸雜交的分類SouthernblotNorthernblotchipChIPonchip主要內容核酸探針核酸雜交概念及原理核酸雜交一、核酸分子雜交的概念及原理核酸雜交:兩個不同來源的、含有互補堿基序列的單股核酸分子，通過堿基配對形成一個新的、穩(wěn)定的雙股分子的過程。

一、核酸分子雜交的概念及原理核酸雜交:兩個不同來源的、含有互

核酸經加熱變性后，在低于變性溫度20℃-30℃時，反應系統(tǒng)中加入的核酸探針與待測核酸樣品中具有互補序列的單鏈DNA或RNA形成雙鏈結構，通過檢測標記信號即可檢測特定的核酸片段。核酸分子雜交技術原理核酸經加熱變性后，在低于變性溫度20℃-30℃時，反二、核酸探針

核酸探針（nucleicprobe）:帶有可檢測標記，能與特定序列的核酸片段互補配對形成雙鏈的一段核酸。

核酸探針的質量（標記效率和特異性）是核酸分子雜交成功的關鍵。二、核酸探針核酸探針（nucleicprobe）:帶1.核酸探針的分類根據(jù)標記物的性質分：

放射性標記:32P,35S,125I,3H。

非放射性標記：化學發(fā)光標記、酶標記、熒光標記等敏感度高，半衰期短（32P14.3天，35S87.1天，125I60天，3H的半衰期長達12.3年，但它所釋放β放射線能量太低，只能用于組織原位雜交），有輻射危害。1.核酸探針的分類根據(jù)標記物的性質分：放射性標記:32P根據(jù)探針中核酸的性質分：DNA(包括cDNA)探針RNA探針(包括cRNA)寡核苷酸探針肽核酸（peptidenucleicacid,PNA）探針根據(jù)探針中核酸的性質分：DNA(包括cDNA)探針(1)DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點：①這類探針多克隆在質粒載體中，易于擴增，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針較穩(wěn)定（相對RNA而言）。③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，能用于同位素和非同位素標記。(1)DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點：①這類探針多克隆(2)RNA探針：主要是細胞mRNA和病毒RNA探針。RNA探針和cRNA探針的特點：雜交反應效率高、易于降解、標記方法復雜。用途：用于檢測DNA和mRNA，以及研究基因表達中的轉錄。cRNA探針：以雙鏈DNA中與mRNA序列相同的一條鏈為模板轉錄得到的RNA鏈，其序列與mRNA互補，也稱為反義RNA。(2)RNA探針：主要是細胞mRNA和病毒RNA探針。RNA

采用化學合成的短鏈寡核苷酸探針,最常用的寡核苷酸探針有18-40個堿基。(3)寡核苷酸探針特點：①鏈短、序列復雜度低、分子量小，與等量靶位點完全雜交的時間短。②寡核苷酸探針可識別靶序列內1個堿基的變化。③一次可大量合成寡核苷酸探針，使得這種探針價格低廉。采用化學合成的短鏈寡核苷酸探針,最常用的寡核苷酸探針2.探針設計的條件①

被檢基因結構清楚；②

有明確的基因產物;

具備下列條件之一，就可以設計、制備特異性基因探針。2.探針設計的條件①被檢基因結構清楚；②有明確的3.核酸探針的常用標記方法

核酸探針的標記幾乎總是先將底物標記相應的信號，然后利用核酸合成的方法合成具有標記信號的核苷酸鏈。Pol.substrateprobe3.核酸探針的常用標記方法核酸探針的標記幾乎總是先

切口平移法（nicktranslation）PCR法DNA快速末端標記T4多核苷酸激酶標記DNA5’末端

隨機引物延伸放射性探針的標記切口平移法（nicktranslation）PCR法由DNaseⅠ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNaseⅠ：在雙鏈DNA上隨機打開若干個單鏈切口，產生3’-OH端大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’核酸外切酶活性(1)切口平移標記法（nicktranslation）由DNaseⅠ和大腸DNaseⅠ：在雙鏈大腸桿菌DNA聚合(隨機引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無5’→3’外切核酸酶活性（2）隨機引物法（randompriming）隨機引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46

產物平均長度為400-600個核苷酸。

Klenow片段沒有5’→3’外切酶活性,反應穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。反應時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質粒DNA模板也可進行反應。產物平均長度為400-600個核苷酸。(3)末端標記法用途：

制備高比活性探針(1010cpm/μgDNA);DNA末端修飾---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

無dNTPdNTPT4DNA聚合酶5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為polI的兩倍

3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min(3)末端標記法用途：外切酶活性乙醇沉淀法凝膠過濾法（G-50Spincolumn）

探針純化乙醇沉淀法探針純化非放射性探針的標記生物素標記核酸酶標核酸半抗原標記核酸根據(jù)標記物的性質分：根據(jù)標記方法分：酶促反應標記法化學修飾標記法非放射性探針的標記生物素標記核酸酶標核酸半抗原標記核酸

以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相應脫氧核苷三磷酸，經DNA聚合酶作用摻入新合成的DNA?？梢圆捎们锌谄揭品ê碗S機引物延伸法進行。生物素標記——酶促法基本原理：以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUT

光敏生物素分子側鏈上連接的芳香基疊氮化合物具光敏感性，在一定波長的光照射下，光敏基團可活化為芳香基硝基苯，很易與腺嘌呤N7位氨基特異結合，形成生物素化的核酸探針。生物素標記——化學修飾法（光敏法）基本原理：光敏生物素分子側鏈上連接的芳香基疊氮化合物具酶標法

使用交聯(lián)劑戊二醛將辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）標記在DNA上，再通過酶促反應使其無色底物轉變成有顏色的產物酶標法使用交聯(lián)劑戊二醛將辣根過氧化物酶（H酶標法堿性磷酸酶(AP)：BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸鹽-4-甲基胺藍）NBT（四氮唑藍）酶標法堿性磷酸酶(AP)：BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸酶標法辣根過氧化物酶(HRP)：DAB（二氨基聯(lián)苯胺）→棕色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）→藍色酶標法辣根過氧化物酶(HRP)：

地高辛（Digoxigenin，DIG）即異羥基洋地黃毒甙，是一種類固醇半抗原，來源于植物（Digitalispurouren

和Digitalislanta）的花和葉中。DIG可以與dUTP反應形成DIG-dUTP，通過酶促法插入到合成的DNA探針中。通過酶標記的抗地高辛抗體來實施檢測。地高辛標記基本原理：地高辛（Digoxigenin，DIG）即異核酸雜交技術-分子生物學課件三、核酸分子雜交的類型

核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。

以上兩種類型根據(jù)具體的雜交方式，反應條件等又可以分成多種類型。三、核酸分子雜交的類型核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致

概念：參加反應的一條核酸鏈被預先固定在固相支持物上，另一條核酸鏈則游離在溶液中進行的雜交反應。

固相支持物：硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜、乳膠顆粒、磁珠、微孔板，芯片等1.固相雜交概念：參加反應的一條核酸鏈被預先固定在固相支持物上，另一條分類：①雜交后，游離片段容易經漂洗除去；菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

固相雜交的特點：②支持物上留下的雜交物容易檢測；③能防止靶DNA自我復性。因此，該法最為常用。分類：①雜交后，游離片段容易經漂洗除去；菌落原位雜交、斑點常用雜交方法介紹常用雜交方法介紹30基本原理：

是1975年由英國人Southern創(chuàng)建，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。

DNA標本用限制性內切酶消化后，經瓊脂糖凝膠電泳分離，然后將DNA從凝膠中轉印至濾膜上與探針雜交。通過檢測與探針互補DNA條帶來確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。（一）、Southern印跡（Southernblot

）

基本原理：（一）、Southern印跡（Southernb提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影預雜交提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜，tissueSDSProKPhenolCHCl3ETOHpptSpin1、

提取基因組DNA

SDS使組織蛋白與DNA分子分離蛋白酶K消化分解蛋白質酚、氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質，乙醇沉淀純化DNA

加入EDTA能抑制DNase的活性，RNase除去RNA，此法可獲得100~200kb的DNA片段。tissueSDSProKPhenolETOHppt1、2、限制性核酸內切酶切斷DNA基因組DNA很大，需要將其切割成片段后用于雜交分析。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子。有時可采用部分和充分消化相結合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活內切酶。樣品可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品。2、限制性核酸內切酶切斷DNA基因組DNA很大，需要將其切割3、瓊脂糖凝膠電泳和堿變性

先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片斷長短進行分離，然后進行雜交。瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段。DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣。

DNA樣品在制備和電泳過程中始終保持雙鏈結構為了有效地實現(xiàn)DNA片段轉移，最好將DNA片段控制在2kb以下。若DNA片段大于15kb，將電泳凝膠浸泡在0.25M的HCl溶液約10分鐘作脫嘌呤處理，打斷DNA片段。將電泳凝膠移至堿性溶液中浸泡，使DNA變性，再用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液。3、瓊脂糖凝膠電泳和堿變性先將DNA樣品(含不同大小的DN4、將DNA轉移至尼龍膜將凝膠中單鏈DNA片段轉移到固相支持物上。注意保持各DNA片段的相對位置不變。用于轉膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍（Nylon）膜、PVDF膜、化學活化膜和濾紙等。a．處理膜時應戴手套并用平頭鑷子操作，膜切角。b．去離子水完全潤濕膜，浸入變性轉移液至少5分鐘。c.制作轉印“三明治”，用玻棒趕出其間滯留的氣泡。d.DNA轉移持續(xù)進行8-24小時。4、將DNA轉移至尼龍膜將凝膠中單鏈DNA片段轉移到固相支持重物玻璃板吸水紙濾紙NC濾膜凝膠濾紙支持物轉移緩沖液毛細管虹吸轉移法重物玻璃板吸水紙濾紙NC濾膜凝膠濾紙支持物轉移緩沖液毛細管虹尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉移法尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉移法真空轉移法真空轉移法5．膜的洗滌、固定1）膜置于0.5MTris·Cl（pH7.2）、1MNaCl中，室溫浸泡15分鐘，除去粘附的瓊脂糖。2）將膜平鋪于一張紙巾上，室溫干燥30分鐘以上。3）DNA固定：在真空烤箱或普通烘箱內于80℃烘烤0.5－2小時。5．膜的洗滌、固定1）膜置于0.5MTris·Cl（pH76.探針標記和預雜交

預雜交：將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉。預雜交液：含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動物的同源性極低，不會與DNA探針雜交）、牛血清等。

southern印跡雜交爐

用雜交袋封裝。每平方厘米NC膜需預雜交液0.2ml。鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性，保持單鏈。變性的鮭魚精DNA加至終濃度200μg/ml。42℃水浴中溫育4h。

6.探針標記和預雜交預雜交：將膜上所有能與DNA結合的位點7、雜交、洗膜加入標記的探針DNA（預先熱變性成為單鏈DNA分子）。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行，雜交過夜。然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強度越低，溫度越高。7、雜交、洗膜加入標記的探針DNA（預先熱變性成為單鏈DNA（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。

（二）在暗室內，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠帶固定，合上暗盒。

（三）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對X光底片曝光（根據(jù)信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天）。8、放射性自顯影檢測（四）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片。（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。

（二）在Southernblot是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳診斷、DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。

Southernblot的應用血跡中的DNADNA指紋分析Southernblot是研究DNA圖譜基本原理：將RNA標本經瓊脂糖凝膠電泳分離后轉印至硝酸纖維素膜上，烘干固定后于探針雜交。（二）、Northern印跡（northernblot）

注意：A甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性,不能用NaOH（會使RNA水解）。B樣品RNA變性后進行電泳分離。C轉印后，烘烤固定前不能用低鹽緩沖液洗

D膠中不能加EB（影響RNA與硝酸纖維素膜的結合）基本原理：將RNA標本經瓊脂糖凝膠電泳分離后轉印至硝酸纖維素RNA提取甲醛變性電泳

印跡轉移預雜交

雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或化學發(fā)光甲醛變性電泳：

RNA變性，消除RNA中的二級結構，保證RNA完全按照分子的大小分離。

DEPC水處理電泳槽，去除RNA酶。在通風櫥中加入甲醛，放置一段時間以減少甲醛蒸汽。

RNA提取甲醛變性電泳：四、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化探針的類型、標記方法和濃度雜交反應溫度雜交反應時間雜交促進劑四、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化探針的類型、標記方法和濃度雜交根據(jù)不同的雜交實驗要求，選擇不同的探針：1.

探針的選擇檢測單個堿基改變：首選用寡核苷酸探針；檢測單鏈靶序列：選用與其互補的DNA單鏈探針（M13噬菌體）或RNA探針，寡核苷酸探針也可；長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交根據(jù)不同的雜交實驗要求，選擇不同的探針：1.探針的選擇檢測

視個人的習慣和可利用條件而定，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。通常，放射性探針比非放射性探針靈敏度高；在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法；在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。2.探針的標記方法視個人的習慣和可利用條件而定，還應考慮實驗的要求，3.探針的濃度探針濃度增加，雜交率增加；在較窄的范圍內，探針濃度增加，敏感性增加。膜雜交中，放射性探針與非放射性探針的用量分別為5-10ng/ml和25-1000ng/ml；原位雜交中，用量均為0.5-5.0μg/ml。3.探針的濃度探針濃度增加，雜交率增加；在較窄的范圍內，探4.雜交溫度雜交最重要的因素之一是選擇恰當?shù)碾s交溫度。溫度：溫度：雜交特異性，雜交率雜交特異性雜交率，

如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。4.雜交溫度雜交最重要的因素之一是選擇恰當?shù)碾s交溫度。溫度最適復性溫度：Tor=Tm–25℃苛刻復性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻復性溫度：Tns=Tm–(30或35℃)

通常有三種溫度可供參考，即最適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。最適復性溫度：Tor=Tm–25℃通常5.雜交反應時間

在其他條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了會引起非特異結合增多。5.雜交反應時間在其他條件都得到滿足的情況下，雜交的常用促進劑：惰性多聚體可促進250nt以上的探針的雜交率。硫酸葡聚糖，平均MW為500000；聚乙二醇（PEG），

MW為6000-8000、粘度低、價廉，但它不能完全取代硫酸葡聚糖；聚丙烯酸，用其鈉鹽，MW約90000，濃度2-4%。價廉，粘度低。6.雜交促進劑常用促進劑：惰性多聚體可促進250nt以上的探針的雜交率。硫（三）、DNA芯片（DNAchip）1995年斯坦福大學SchenaM和BrownPO等發(fā)表第一篇基因表達陣列芯片，之后國內外興起了一股微點陣（microarrays）技術——DNA芯片的浪潮。DNA芯片是將各種“探針”固定在基質上，用于檢測受檢的各種標記樣品中與探針互補的核酸物質的變化。（三）、DNA芯片（DNAchip）1995年斯坦福大學S

基因芯片(Genechip)技術是指通過微陣列（Microarray）技術將高密度DNA片段通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的技術。1、概念基因芯片(Genechip)技術是指通過微陣列（Mi基因芯片工作流程基因芯片工作流程（chromatinimmunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）

特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，解交聯(lián)后對目的片段進行純化、擴增和熒光標記，再用于芯片分析；尋找特異性蛋白在基因組中的結合位點，獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。四、染色質免疫共沉淀-芯片（chromatinimmunoprecipitation基本原理甲醛處理使細胞內蛋白質和DNA交聯(lián)超聲波打碎特異性抗體免疫沉淀目的DNA片段純化、擴增熒光標記和芯片檢測芯片數(shù)據(jù)分析基本原理甲醛處理使細胞內蛋白質和DNA交聯(lián)超聲波打碎特異（3）研究范疇主要集中在兩個領域：第一，確定轉錄因子及其作用位點

能夠將直接與蛋白結合的基因作為靶點，數(shù)據(jù)可以直接用于生物信息學分析，更直接地識別轉錄因子結合元件。第二，確定基因表觀遺傳修飾，應用于表觀遺傳學研究。ChIP-on-chip技術可提供基因編碼區(qū)中組蛋白甲基化分布模式的信息：CpG島表達序列標簽芯片，可以顯示基因組內CpG甲基化和組蛋白修飾之間的聯(lián)系（3）研究范疇主要集中在兩個領域：NucleicAcidHybridization

核酸雜交技術NucleicAcidHybridization

核酸雜61主要內容

核酸探針

核酸雜交概念及原理

核酸雜交的分類SouthernblotNorthernblotchipChIPonchip主要內容核酸探針核酸雜交概念及原理核酸雜交一、核酸分子雜交的概念及原理核酸雜交:兩個不同來源的、含有互補堿基序列的單股核酸分子，通過堿基配對形成一個新的、穩(wěn)定的雙股分子的過程。

一、核酸分子雜交的概念及原理核酸雜交:兩個不同來源的、含有互

核酸經加熱變性后，在低于變性溫度20℃-30℃時，反應系統(tǒng)中加入的核酸探針與待測核酸樣品中具有互補序列的單鏈DNA或RNA形成雙鏈結構，通過檢測標記信號即可檢測特定的核酸片段。核酸分子雜交技術原理核酸經加熱變性后，在低于變性溫度20℃-30℃時，反二、核酸探針

核酸探針（nucleicprobe）:帶有可檢測標記，能與特定序列的核酸片段互補配對形成雙鏈的一段核酸。

核酸探針的質量（標記效率和特異性）是核酸分子雜交成功的關鍵。二、核酸探針核酸探針（nucleicprobe）:帶1.核酸探針的分類根據(jù)標記物的性質分：

放射性標記:32P,35S,125I,3H。

非放射性標記：化學發(fā)光標記、酶標記、熒光標記等敏感度高，半衰期短（32P14.3天，35S87.1天，125I60天，3H的半衰期長達12.3年，但它所釋放β放射線能量太低，只能用于組織原位雜交），有輻射危害。1.核酸探針的分類根據(jù)標記物的性質分：放射性標記:32P根據(jù)探針中核酸的性質分：DNA(包括cDNA)探針RNA探針(包括cRNA)寡核苷酸探針肽核酸（peptidenucleicacid,PNA）探針根據(jù)探針中核酸的性質分：DNA(包括cDNA)探針(1)DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點：①這類探針多克隆在質粒載體中，易于擴增，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針較穩(wěn)定（相對RNA而言）。③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，能用于同位素和非同位素標記。(1)DNA探針（包括cDNA探針）的優(yōu)點：①這類探針多克隆(2)RNA探針：主要是細胞mRNA和病毒RNA探針。RNA探針和cRNA探針的特點：雜交反應效率高、易于降解、標記方法復雜。用途：用于檢測DNA和mRNA，以及研究基因表達中的轉錄。cRNA探針：以雙鏈DNA中與mRNA序列相同的一條鏈為模板轉錄得到的RNA鏈，其序列與mRNA互補，也稱為反義RNA。(2)RNA探針：主要是細胞mRNA和病毒RNA探針。RNA

采用化學合成的短鏈寡核苷酸探針,最常用的寡核苷酸探針有18-40個堿基。(3)寡核苷酸探針特點：①鏈短、序列復雜度低、分子量小，與等量靶位點完全雜交的時間短。②寡核苷酸探針可識別靶序列內1個堿基的變化。③一次可大量合成寡核苷酸探針，使得這種探針價格低廉。采用化學合成的短鏈寡核苷酸探針,最常用的寡核苷酸探針2.探針設計的條件①

被檢基因結構清楚；②

有明確的基因產物;

具備下列條件之一，就可以設計、制備特異性基因探針。2.探針設計的條件①被檢基因結構清楚；②有明確的3.核酸探針的常用標記方法

核酸探針的標記幾乎總是先將底物標記相應的信號，然后利用核酸合成的方法合成具有標記信號的核苷酸鏈。Pol.substrateprobe3.核酸探針的常用標記方法核酸探針的標記幾乎總是先

切口平移法（nicktranslation）PCR法DNA快速末端標記T4多核苷酸激酶標記DNA5’末端

隨機引物延伸放射性探針的標記切口平移法（nicktranslation）PCR法由DNaseⅠ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNaseⅠ：在雙鏈DNA上隨機打開若干個單鏈切口，產生3’-OH端大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’核酸外切酶活性(1)切口平移標記法（nicktranslation）由DNaseⅠ和大腸DNaseⅠ：在雙鏈大腸桿菌DNA聚合(隨機引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無5’→3’外切核酸酶活性（2）隨機引物法（randompriming）隨機引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46

產物平均長度為400-600個核苷酸。

Klenow片段沒有5’→3’外切酶活性,反應穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。反應時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質粒DNA模板也可進行反應。產物平均長度為400-600個核苷酸。(3)末端標記法用途：

制備高比活性探針(1010cpm/μgDNA);DNA末端修飾---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

無dNTPdNTPT4DNA聚合酶5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為polI的兩倍

3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min(3)末端標記法用途：外切酶活性乙醇沉淀法凝膠過濾法（G-50Spincolumn）

探針純化乙醇沉淀法探針純化非放射性探針的標記生物素標記核酸酶標核酸半抗原標記核酸根據(jù)標記物的性質分：根據(jù)標記方法分：酶促反應標記法化學修飾標記法非放射性探針的標記生物素標記核酸酶標核酸半抗原標記核酸

以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相應脫氧核苷三磷酸，經DNA聚合酶作用摻入新合成的DNA?？梢圆捎们锌谄揭品ê碗S機引物延伸法進行。生物素標記——酶促法基本原理：以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUT

光敏生物素分子側鏈上連接的芳香基疊氮化合物具光敏感性，在一定波長的光照射下，光敏基團可活化為芳香基硝基苯，很易與腺嘌呤N7位氨基特異結合，形成生物素化的核酸探針。生物素標記——化學修飾法（光敏法）基本原理：光敏生物素分子側鏈上連接的芳香基疊氮化合物具酶標法

使用交聯(lián)劑戊二醛將辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）標記在DNA上，再通過酶促反應使其無色底物轉變成有顏色的產物酶標法使用交聯(lián)劑戊二醛將辣根過氧化物酶（H酶標法堿性磷酸酶(AP)：BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸鹽-4-甲基胺藍）NBT（四氮唑藍）酶標法堿性磷酸酶(AP)：BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸酶標法辣根過氧化物酶(HRP)：DAB（二氨基聯(lián)苯胺）→棕色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）→藍色酶標法辣根過氧化物酶(HRP)：

地高辛（Digoxigenin，DIG）即異羥基洋地黃毒甙，是一種類固醇半抗原，來源于植物（Digitalispurouren

和Digitalislanta）的花和葉中。DIG可以與dUTP反應形成DIG-dUTP，通過酶促法插入到合成的DNA探針中。通過酶標記的抗地高辛抗體來實施檢測。地高辛標記基本原理：地高辛（Digoxigenin，DIG）即異核酸雜交技術-分子生物學課件三、核酸分子雜交的類型

核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。

以上兩種類型根據(jù)具體的雜交方式，反應條件等又可以分成多種類型。三、核酸分子雜交的類型核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致

概念：參加反應的一條核酸鏈被預先固定在固相支持物上，另一條核酸鏈則游離在溶液中進行的雜交反應。

固相支持物：硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜、乳膠顆粒、磁珠、微孔板，芯片等1.固相雜交概念：參加反應的一條核酸鏈被預先固定在固相支持物上，另一條分類：①雜交后，游離片段容易經漂洗除去；菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

固相雜交的特點：②支持物上留下的雜交物容易檢測；③能防止靶DNA自我復性。因此，該法最為常用。分類：①雜交后，游離片段容易經漂洗除去；菌落原位雜交、斑點常用雜交方法介紹常用雜交方法介紹90基本原理：

是1975年由英國人Southern創(chuàng)建，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。

DNA標本用限制性內切酶消化后，經瓊脂糖凝膠電泳分離，然后將DNA從凝膠中轉印至濾膜上與探針雜交。通過檢測與探針互補DNA條帶來確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。（一）、Southern印跡（Southernblot

）

基本原理：（一）、Southern印跡（Southernb提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影預雜交提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜，tissueSDSProKPhenolCHCl3ETOHpptSpin1、

提取基因組DNA

SDS使組織蛋白與DNA分子分離蛋白酶K消化分解蛋白質酚、氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質，乙醇沉淀純化DNA

加入EDTA能抑制DNase的活性，RNase除去RNA，此法可獲得100~200kb的DNA片段。tissueSDSProKPhenolETOHppt1、2、限制性核酸內切酶切斷DNA基因組DNA很大，需要將其切割成片段后用于雜交分析。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子。有時可采用部分和充分消化相結合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活內切酶。樣品可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品。2、限制性核酸內切酶切斷DNA基因組DNA很大，需要將其切割3、瓊脂糖凝膠電泳和堿變性

先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片斷長短進行分離，然后進行雜交。瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段。DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣。

DNA樣品在制備和電泳過程中始終保持雙鏈結構為了有效地實現(xiàn)DNA片段轉移，最好將DNA片段控制在2kb以下。若DNA片段大于15kb，將電泳凝膠浸泡在0.25M的HCl溶液約10分鐘作脫嘌呤處理，打斷DNA片段。將電泳凝膠移至堿性溶液中浸泡，使DNA變性，再用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液。3、瓊脂糖凝膠電泳和堿變性先將DNA樣品(含不同大小的DN4、將DNA轉移至尼龍膜將凝膠中單鏈DNA片段轉移到固相支持物上。注意保持各DNA片段的相對位置不變。用于轉膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍（Nylon）膜、PVDF膜、化學活化膜和濾紙等。a．處理膜時應戴手套并用平頭鑷子操作，膜切角。b．去離子水完全潤濕膜，浸入變性轉移液至少5分鐘。c.制作轉印“三明治”，用玻棒趕出其間滯留的氣泡。d.DNA轉移持續(xù)進行8-24小時。4、將DNA轉移至尼龍膜將凝膠中單鏈DNA片段轉移到固相支持重物玻璃板吸水紙濾紙NC濾膜凝膠濾紙支持物轉移緩沖液毛細管虹吸轉移法重物玻璃板吸水紙濾紙NC濾膜凝膠濾紙支持物轉移緩沖液毛細管虹尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉移法尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉移法真空轉移法真空轉移法5．膜的洗滌、固定1）膜置于0.5MTris·Cl（pH7.2）、1MNaCl中，室溫浸泡15分鐘，除去粘附的瓊脂糖。2）將膜平鋪于一張紙巾上，室溫干燥30分鐘以上。3）DNA固定：在真空烤箱或普通烘箱內于80℃烘烤0.5－2小時。5．膜的洗滌、固定1）膜置于0.5MTris·Cl（pH76.探針標記和預雜交

預雜交：將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉。預雜交液：含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動物的同源性極低，不會與DNA探針雜交）、牛血清等。

southern印跡雜交爐

用雜交袋封裝。每平方厘米NC膜需預雜交液0.2ml。鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性，保持單鏈。變性的鮭魚精DNA加至終濃度200μg/ml。42℃水浴中溫育4h。

6.探針標記和預雜交預雜交：將膜上所有能與DNA結合的位點7、雜交、洗膜加入標記的探針DNA（預先熱變性成為單鏈DNA分子）。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行，雜交過夜。然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強度越低，溫度越高。7、雜交、洗膜加入標記的探針DNA（預先熱變性成為單鏈DNA（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。

（二）在暗室內，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠帶固定，合上暗盒。

（三）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對X光底片曝光（根據(jù)信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天）。8、放射性自顯影檢測（四）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片。（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。

（二）在Southernblot是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳診斷、DNA圖譜分析及PCR產物分析等方面有重要價值。

Southernblot的應用血跡中的DNADNA指紋分析Southernblot是研究DNA圖譜基本原理：將RNA標本經瓊脂糖凝膠電泳分離后轉印至硝酸纖維素膜上，烘干固定后于探針雜交。（二）、Northern印跡（northernblot）

注意：A甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性,不能用NaOH（會使RNA水解）。B樣品RNA變性后進行電泳分離。C轉印后，烘烤固定前不能用低鹽緩沖液洗

D膠中不能加EB（影響RNA與硝酸纖維素膜的結合）基本原理：將RNA標本經瓊脂糖凝膠電泳分離后轉印至硝酸纖維素RNA提取甲醛變性電泳

印跡轉移預雜交

雜交（變性探針）洗膜放射自顯影或化學發(fā)光甲醛變性電泳：

RNA變性，消除RNA中的二級結構，保證RNA完全按照分子的大小分離。

DEPC水處理電泳槽，去除RNA酶。在通風櫥中加入甲醛，放置一段時間以減少甲醛蒸汽。

RNA提取甲醛變性電泳：四、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化探針的類型、標記方法和濃度雜交反應溫度雜交反應時間雜交促進劑四、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化探針的類型、標記方法和濃度雜交根據(jù)不同的雜交實驗要求，選擇不同的探針：1.

探針的選擇檢測單個堿基改變：首選用寡核苷酸探針；檢測單鏈靶序列：選用與其互補的DNA單鏈探針（M13噬菌體）或RNA探針，寡核苷酸探針也可；長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交根據(jù)不同的雜交實驗要求，選擇不同的探針：1.探針的選擇檢測

視個人的習慣和可利用條件而定，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。通常，放射性探針比非放射性探針靈敏度高；在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探