重金屬Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性研究

重金屬Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性研究

張小琴覃仙鳳Summary

為研究重金屬Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性效應(yīng)，通過單一變量急性毒性試驗研究其在室內(nèi)條件（溫度16～20℃、濕度885%左右）對棘腹蛙蝌蚪的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：根據(jù)寇氏法原理，得到Cu2+對2月齡棘腹蛙蝌蚪在24、48、72、96h時的半致死濃度（LC50）分別為1.160、1.136、1.191和0.870mg/L。依據(jù)安全濃度計算公式，計算出安全濃度為0.087mg/L。根據(jù)毒性評價標(biāo)準(zhǔn)，比較了Cu2+對不同種類蝌蚪的毒性程度，發(fā)現(xiàn)棘腹蛙蝌蚪的耐受性較弱。該研究可為水環(huán)境監(jiān)測以及其他相關(guān)重金屬離子的毒性研究提供參考，為更好地保護棘腹蛙蝌蚪提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)材料。Key

Cu2+;棘腹蛙蝌蚪;急性毒性;毒性評價;半致死濃度（LC50）

S

917.4

A

0517-6611（2020）17-0115-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.029開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：StudyontheAcuteToxicityofCopperIonstoTadpolesofQuasipaaboulengeriZHANGXiao

qin，QINXian

feng（CollegeofResourcesandEnvironment，AbaTeachersUniversity，Wenchuan，Sichuan623002）Abstract

InordertostudytheacutetoxiceffectsofheavymetalCu2+onthetadpolesofQuasipaaboulengeri，asingle

variableacutetoxicitytestwasconductedtostudythetoxiceffectsofindoorconditions（temperature16-20℃，humidity88.5%）onthetadpoles.Theresultsshowedthatthesemi

lethalconcentration（LC50）ofheavymetalCu2+at24，48，72and96hwere1.160，1.136，1.191，0.870mg/L，respectively.Accordingtothesafeconcentrationcalculationformula，thesafeconcentrationwascalculatedtobe0.087mg/L.Accordingtothetoxicityevaluationcriteria，thetoxicitydegreeofCu2+todifferentspeciesoftadpoleswascompared，andthetadpolesofQ.boulengeriwereweaklytolerated.Thisstudycanprovidereferencesforwaterenvironmentmonitoringandotherrelatedheavymetaliontoxicitystudies，andprovidebasicdatamaterialsforbetterprotectionofQ.boulengeri.Keywords

Cu2+;TadpolesofQuasipaaboulengeri;Acutetoxicity;Toxicityevaluation;Semi

lethalconcentration（LC50）由于汶川地質(zhì)災(zāi)害及洪澇災(zāi)害引發(fā)化工原料泄露、環(huán)保設(shè)施破壞等環(huán)境問題，使得土壤水域中富含重金屬，如Cu2+、Hg2+、Ag+等[1]。當(dāng)水環(huán)境中的重金屬含量超過蝌蚪的耐受程度，會對生活在汶川的兩棲類動物特別是棘腹蛙蝌蚪有一定影響。棘腹蛙俗名石蛙、石雞、梆梆魚等，棘腹蛙在食用、藥用、科研、生態(tài)環(huán)境等方面的價值極高，但最近幾年人為因素及環(huán)境因素導(dǎo)致棘腹蛙個體數(shù)量大幅度減少，1920年確定棘腹蛙（Quasipaaboulengeri）亦稱棘胸蛙（Quasipaatibetanus），屬于同物異名。棘腹蛙已經(jīng)先后被列入《中國瀕危物種紅皮書》和《中國物種紅色名錄》。棘腹蛙蝌蚪皮膚滲透性強，對外界環(huán)境的毒性影響異常敏感，在這一階段試驗的最大致毒濃度與外界環(huán)境頗為相似。國內(nèi)外有關(guān)重金屬對棘腹蛙蝌蚪的毒理研究較少，國內(nèi)有學(xué)者研究了棘胸蛙在氨氮脅迫條件下毒理試驗[2]，也有學(xué)者研究了重金屬Cu2+脅迫對棘腹蛙存活、行為和體重增長的影響[3]，但缺少Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性研究。其中水環(huán)境中的Cu2+易致早期的棘腹蛙蝌蚪大量死亡，從而造成棘腹蛙個體的成活率大幅度降低。筆者探究了重金屬Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性影響，旨在為水環(huán)境檢測以及其他相關(guān)重金屬離子對棘腹蛙蝌蚪的毒性研究提供參考，以更好地保護棘腹蛙蝌蚪。1

材料與方法1.1

材料1.1.1

試驗試劑。硫酸銅（CuSO4）、冰乙酸（CH3COOH）。1.1.2

試驗器材。透明方箱（28.0cm×19.5cm×16.5cm）、燒杯、電子天平、pH試紙、游標(biāo)卡尺、溫度計、小米米家智能攝像機等，均由阿壩師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院實驗室提供。1.1.3

試驗動物及分組。棘腹蛙蝌蚪購自雅安市林溪地棘胸蛙養(yǎng)殖專業(yè)合作社，隨機選擇大小均勻、食欲強、活動能力強的2月齡棘腹蛙蝌蚪500尾（平均體長3.97cm，平均體重0.41g），分為試驗組和對照組。1.1.4

水處理。飼養(yǎng)蝌蚪用水為阿壩師范學(xué)院后山小溪取得，將溪水通風(fēng)靜置2d后使用，以沉淀泥沙，避免對棘腹蛙蝌蚪的試驗結(jié)果造成影響。1.2

試驗方法1.2.1

試驗溶液的配制。準(zhǔn)確稱量CuSO40.1g，將其溶于100mL水中，再加入適量的冰乙酸，抑制Cu2+的水解，配制成質(zhì)量濃度為1.0mg/L的母液，備用。1.2.2

蝌蚪的飼養(yǎng)。投放熟飼料、熟白菜交替喂養(yǎng)，每隔24h換1次水以及喂食。1.2.3

預(yù)試驗。參考相關(guān)文獻[3]，在較大范圍內(nèi)對少量蝌蚪進行試驗。各試驗組試驗溶液濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0mg/L，同時設(shè)置空白對照組（試驗溶液濃度為0mg/L），每個濃度梯度下設(shè)置1個平行對照組。在每個容器中加入1L處理后的水，分別加入不同濃度梯度的硫酸銅溶液，每個容器中放入10尾蝌蚪。試驗溶液pH為7，水溫為17.3～20.5℃，室內(nèi)溫度為16～20℃，濕度為75.9%，每隔24h換試驗溶液1次，并喂食。試驗開始時安裝攝像機，觀察蝌蚪的中毒癥狀，并分別記錄4、12、24、48、72、96h時蝌蚪死亡數(shù)量。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，得出試驗的最小致死濃度和最大安全濃度，從而確定正式試驗的濃度范圍。1.2.4

正式試驗。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，按等差質(zhì)量濃度梯度設(shè)置各試驗組試驗溶液濃度分別為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2mg/L。每個濃度梯度均設(shè)置3個平行組，同時設(shè)置了3個空白對照組（試驗溶液濃度為0mg/L），貼好標(biāo)簽紙。在每個容器中加入1L水，用吸量管取適量的配制好的母液滴入對應(yīng)容器中。隨機選取蝌蚪10尾，放養(yǎng)于容器中。測量并記錄水溫、pH、室內(nèi)溫度和濕度等。采用靜止試驗法[4]，試驗開始后觀察蝌蚪的中毒情況，前4h進行連續(xù)觀察，并及時撈出死亡個體，以免污染水質(zhì)（死亡標(biāo)準(zhǔn)以用玻璃棒觸動蝌蚪時，其身體無反應(yīng)），隨后觀察并記錄12、24、48、72、96h時的死亡數(shù)量。試驗期間注重觀察蝌蚪的平衡、游動及體色狀態(tài)。1.2.5

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。半致死濃度（LC50）采用寇氏法原理來計算;安全濃度（SC）采用公式SC=96hLC50×0.1來計算;最后，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。2

結(jié)果與分析2.1

預(yù)試驗根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果得知，試驗溶液pH為7.0，水溫為17.3～20.5℃，室內(nèi)溫度為18～20℃，濕度為75.9%。在24h內(nèi)濃度分別為3和4mg/L的試驗組蝌蚪全部死亡，在96h內(nèi)濃度為2mg/L的蝌蚪全部死亡。根據(jù)以上結(jié)果，確定最小致死濃度為2mg/L，最大安全濃度為1mg/L。因此，確定正式試驗的濃度梯度為0.8～2.2mg/L。在前4h內(nèi)，濃度0.1～1.0mg/L的試驗組蝌蚪無明顯中毒癥狀，而濃度2～4mg/L試驗組蝌蚪表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀（明顯出現(xiàn)頭暈，身體擺動劇烈，不定向運動，在水中側(cè)翻后又恢復(fù)正常，懸浮在水中，連續(xù)以往動作，不久后身體失衡側(cè)翻或仰臥在水中）。2.2

正式試驗2.2.1

中毒癥狀。在試驗溶液pH7.0，水溫18.4～19.2℃，室內(nèi)溫度16～20℃，濕度88.5%的條件下，Cu2+對蝌蚪的中毒癥狀結(jié)果如圖1～3所示。使用攝像設(shè)施連續(xù)觀察蝌蚪的行為變化。從圖1～3可以看出，中毒前，蝌蚪的體色正常，活躍能力強;中毒后，蝌蚪運動強烈，尾末端擺動明顯，上下翻騰，體表有分泌物，體色變淡，試液混濁，不久后身體徹底失衡，仰臥于水中，死亡的蝌蚪體表變灰，尾鰭透明，皮膚出現(xiàn)潰爛。2.2.2

Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性影響。在96h內(nèi)不同質(zhì)量濃度的Cu2+處理后累計2月齡棘腹蛙蝌蚪死亡數(shù)及其急性試驗結(jié)果如表1、2所示。由表1可知，隨著Cu2+濃度的增加及時間的延長，棘腹蛙蝌蚪數(shù)量死亡數(shù)增多。由于蝌蚪的體表滲透能力強，Cu2+濃度越大，對蝌蚪的刺激性越強，毒性越強;較小的個體先死亡。大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用0.7mg/LCuSO4溶液（含Cu2+0.178mg/L）噴灑全池，為防治原生動物疾病以及藻類生長而危及多數(shù)兩棲動物的生長[4]。由于棘腹蛙的LC50低于0178mg/L，耐毒性極弱，對于棘腹蛙蝌蚪的傷害較大，表明此種噴灑方式對于2月齡棘腹蛙蝌蚪的疾病預(yù)防是不可行的。由表2可知，隨著Cu2+濃度的增加，在96h內(nèi)的累計2月齡棘腹蛙蝌蚪死亡數(shù)及死亡率逐漸增大，在2.0和2.2mg/L濃度條件下累計死亡數(shù)及死亡率均達到最大值，蝌蚪全部死亡。根據(jù)表1試驗結(jié)果，再通過回歸分析得出Cu2+對蝌蚪的急性毒性試驗結(jié)果（表3）。在24、48、72、96hCu2+的LC50分別為1.160、1.136、1.191和0.870mg/L。依據(jù)SC計算公式，計算出SC為0.087mg/L。根據(jù)《水生生物監(jiān)測手冊》中對魚類（蝌蚪）毒性評價標(biāo)準(zhǔn)及我國化學(xué)物質(zhì)毒性分級標(biāo)準(zhǔn)（96hLC5010000.0mg/L），判定2月齡棘腹蛙蝌蚪對Cu2+的毒性等級為劇毒。在整個試驗過程中，對照組中的蝌蚪正常游動，未出現(xiàn)任何中毒癥狀，無死亡個體;其他試驗組均出現(xiàn)不同程度的中毒狀況及死亡狀態(tài)。3

結(jié)論與討論由Cu2+對2月齡棘腹蛙蝌蚪的毒性試驗結(jié)果可知，在同一質(zhì)量濃度下，隨著時間的延長，蝌蚪的死亡數(shù)增加，死亡率逐漸升高;在相同時間內(nèi)，Cu2+的質(zhì)量濃度越大，蝌蚪的死亡數(shù)越多，死亡率越大，并且當(dāng)質(zhì)量濃度達到一定濃度時，死亡速率極快;個體小的蝌蚪比個體大的蝌蚪先死亡。棘腹蛙蝌蚪對于Cu2+的耐受性極弱，2月齡棘腹蛙蝌蚪對Cu2+的毒性等級為劇毒。重金屬急性毒性試驗對蝌蚪的行為形態(tài)、生長發(fā)育、機體酶活性、組織器官、遺傳等方面均有極大影響，從而使蝌蚪中毒。其中對蝌蚪的行為形態(tài)的影響最為明顯，主要表現(xiàn)在以下方面：游動能力遲緩，游動方向不確定;側(cè)翻或仰臥在水中，體色泛白，體呈僵直在水中;游動能力遲緩;游動方向不定向;皮膚潰爛，試驗溶液混濁。Cu2+對蝌蚪的毒害主要通過破壞鰓結(jié)構(gòu)來影響其呼吸方式，從而使其功能紊亂，中毒死亡;還因蝌蚪皮膚的滲透性強，溶液中的Cu2+易滲進皮膚，破壞內(nèi)臟器官功能，導(dǎo)致其中毒。經(jīng)以上分析可知，蝌蚪對外界環(huán)境敏感，故蝌蚪可作為環(huán)境監(jiān)測的重要指示動物。因此，該試驗不僅可為水環(huán)境監(jiān)測及棘腹蛙蝌蚪的相關(guān)研究提供參考，也可為保護棘腹蛙蝌蚪提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)材料。國內(nèi)關(guān)于Cu2+對兩棲動物的急性毒性研究較少，這里列出國內(nèi)已有的Cu2+對不同兩棲類蝌蚪的LC50（表4），LC50越大，毒性越小，蝌蚪耐受性更強。不同種類的蝌蚪體長及質(zhì)量與LC50并未呈現(xiàn)出線性關(guān)系。對于同一種蝌蚪，隨著時間的延長，LC50變小。這可能是隨著時間的延長，體內(nèi)毒性增強，耐受性減弱。Reference[1]馮光興.汶川震區(qū)清平鎮(zhèn)生態(tài)環(huán)境特征及對策[J].山西建筑，2019，45（18）：153-155.[2]鄭曉靜.棘胸蛙（Ranaspinosa）蝌蚪對氨氮的耐受與響應(yīng)特征[D].舟山：浙江海洋學(xué)院，2015.[3]鄭燕倩，雷瑾，劉子明，等.重金屬對石蛙蝌蚪存活、行為和體重增長的影響[J].麗水學(xué)院學(xué)報，2015，37（5）：21-25.[4]楊再福，陳立僑，陳華友.重金屬銅、鎘對蝌蚪毒性的研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，11（1）：102-103.[5]石戈，王健鑫，武佳，等.Cu2+和Cr6+對中國林蛙蝌蚪的急性毒性[J].東北師大學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，39（2）：116-121.[6]金鑫，周丹，于東.Cu2+對東北林蛙的急性毒性[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2014，30（3）：129-132.[7]賈秀英，董