基因工程-第六章dna重組操作

第六章DNA重組的操作外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第一節(jié)DNA的體外重組第一節(jié)DNA的體外重組

一、黏性末端的連接二、平末端的連接三、PCR產(chǎn)物的連接第一節(jié)DNA的體外重組重組DNAbinantDNAisDNAfromtwodifferentsourcesthathasbeencombinedinvitro(outsidelivingorganisms).TherearethreemainreasonsforcreatingbinantDNA:(i)tocreateaproteinproduct(ii)tocreatemultiplecopiesofgenes；(iii)toinsertforeigngenesintootherorganismstogivethoseorganismsanewtrait一、重組DNA的概念和目的第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

1.粘性末端連接（由同一種酶或同尾酶產(chǎn)生物末端）第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

1.粘性末端連接（1）具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

使用堿性磷酸酶處理載體DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

1.粘性末端連接（2）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切HindIIIEcoRI對基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

2.平頭末端連接

（1）直接連接

5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。

T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

3’

第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

2.平頭末端連接

（2）人工加尾形成“粘性末端”

a）同聚加尾法

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸,利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶分別給載體和插入片段加上互補(bǔ)的核苷酸。

缺點(diǎn)：不能把插入片段再切下來。第一節(jié)DNA的體外重組非酶切位點(diǎn)二、外源基因與載體的連接

2.平頭末端連接

（2）人工加尾形成“粘性末端”

a）同聚加尾法

第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

2.平頭末端連接（2）人工加尾形成“粘性末端”

b）銜接物(linker)連接

Linker:用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。

linker的作用：用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：第一節(jié)DNA的體外重組銜接物(linker)連接第一節(jié)DNA的體外重組銜接物(linker)連接優(yōu)點(diǎn)：

1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。2）能給載體連接上Polylinker缺點(diǎn)：如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

2.平頭末端連接（2）人工加尾形成“粘性末端”

b)DNA接頭

(adapter)連接法

adapter:一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。

adapter的作用:用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter第一節(jié)DNA的體外重組缺點(diǎn)：接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。防止自我連接：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。b)DNA接頭(adapter)連接法第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

3.PCR產(chǎn)物的連接

（1）在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)GCAGAATTC

互補(bǔ)序列3’端15~20bp與模板互補(bǔ)；5’端6~10bp是某個內(nèi)切酶的識別序列（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）第一節(jié)DNA的體外重組引物1

GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5’--3’GCAGAATTC

互補(bǔ)序列5’--3’3’模板GCAGAATTC

互補(bǔ)序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’第一節(jié)DNA的體外重組GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列模板BamHI位點(diǎn)-5’3-’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互補(bǔ)序列3’-模板GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列引物23’3’第一節(jié)DNA的體外重組二、外源基因與載體的連接

3.PCR產(chǎn)物的連接

（2）與T載體直接連接

TaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）,因此PCR產(chǎn)物兩個3’端一般都有一個A

T載體的兩個3’端人為地各加一個T：利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！第一節(jié)DNA的體外重組AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA二、外源基因與載體的連接

3.PCR產(chǎn)物的連接

（2）與T載體直接連接第一節(jié)DNA的體外重組T載體圖二、外源基因與載體的連接

3.PCR產(chǎn)物的連接

（2）與T載體直接連接第一節(jié)DNA的體外重組三、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)

1.插入片段與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非粘性末端連接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。第一節(jié)DNA的體外重組三、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)

2.DNA插入的方向正確由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。用雙酶切EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第一節(jié)DNA的體外重組三、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)

3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確

（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第一節(jié)DNA的體外重組三、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)

4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片段的用量連接反應(yīng)體系中，插入片段比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片段以單鏈連接。載體插入片段5’

3’

第一節(jié)DNA的體外重組四、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個載體與幾個插入片段重組（能存活）5.幾個載體與一個插入片段重組（能存活）第一節(jié)DNA的體外重組第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的原理與技術(shù)

一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法三、轉(zhuǎn)化率及影響因素一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法相關(guān)概念

1.轉(zhuǎn)化(transformation)細(xì)菌獲得外源質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程。

2.轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。

3.轉(zhuǎn)染(transfection)

指感受態(tài)的受體細(xì)胞捕獲和表達(dá)以噬菌體為載體的重組DNA分子的過程。

轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染的區(qū)別轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法

1、化學(xué)轉(zhuǎn)化法感受態(tài)：細(xì)菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)(competence).

感受態(tài)的出現(xiàn)是由于細(xì)菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)只能與雙鏈DNA結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合。對于大腸桿菌細(xì)胞，一般采用CaCl2溶液來處理受體細(xì)胞，增加細(xì)胞膜的通透性，制備感受態(tài)細(xì)胞。一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置30分鐘37℃搖1小時10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA加入1mLLB培養(yǎng)基42oC1.5分鐘熱休克法簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法

2.電擊轉(zhuǎn)化法

將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大

原理:

用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或擊成小孔，使各種大分子(包括DNA)通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞.轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化法一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法

3.影響轉(zhuǎn)化率的因素（1）重組質(zhì)粒①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會被降解。一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法

3.影響轉(zhuǎn)化率的因素

（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。③CaCl2處理要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。二、外源目的基因?qū)胝婧思?xì)胞

1.借助于載體的基因轉(zhuǎn)移

動植病毒，農(nóng)桿菌質(zhì)粒等。

2.不需載體的基因轉(zhuǎn)移

磷酸鈣沉淀法脂質(zhì)體（lipofectin）載體法顯微注射法(microinjection)

DEAE葡萄糖傳染法基因槍法（genegun）電擊法（electroporation)植物細(xì)胞動物細(xì)胞二、外源目的基因?qū)胝婧思?xì)胞磷酸鈣沉淀法二、外源目的基因?qū)胝婧思?xì)胞脂質(zhì)體（lipofectin）載體法二、外源目的基因?qū)胝婧思?xì)胞顯微注射法(microinjection)二、外源目的基因?qū)胝婧思?xì)胞基因槍第三節(jié)重組子的篩選與鑒定

相關(guān)概念轉(zhuǎn)化子導(dǎo)入外源基因DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞；

重組子含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子；

篩選和選擇經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需的陽性重組子的過程；

篩選通過某種特定的方法，如核酸雜交及免疫測定等從受體細(xì)胞群體禍基因文庫中鑒定出陽性重組子的過程；

選擇通過某種外加因素的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆的方法第三節(jié)重組子的篩選與鑒定

一、遺傳學(xué)檢測法二、核酸分子雜交檢測法三、物理檢測法四、免疫化學(xué)檢測法五、核酸序列分析及其他方法一、遺傳學(xué)檢測法該方法要求克隆基因能夠表達(dá)，并利用相應(yīng)的基因突變型作為受體細(xì)胞，當(dāng)受體細(xì)胞由突變型變?yōu)橐吧蜁r或賦予受體細(xì)胞特定的表型時，我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因。

優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速，結(jié)果較可靠。

缺點(diǎn)：基因必須表達(dá)并具有合適的受體細(xì)胞。（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法

1.抗藥性記號插入失活選擇法

2.β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法（二）根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變體發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。一、遺傳學(xué)檢測法

(一)載體表型選擇法

1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法如：pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。

Tetr上有插入位點(diǎn)BamHI和SalI;

Ampr上有插入位點(diǎn)PstI。一、遺傳學(xué)檢測法(一)載體表型選擇法

1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法

pBR322抗菌素標(biāo)記選擇（1）四環(huán)素：抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。（2）氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。（3）環(huán)絲氨酸：殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。一、遺傳學(xué)檢測法(一)載體表型選擇法

1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法

pBR322選擇過程

（1）四環(huán)素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。

Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；

Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。

一、遺傳學(xué)檢測法無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基一、遺傳學(xué)檢測法(一)載體表型選擇法

1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法

pBR322選擇過程

（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。一、遺傳學(xué)檢測法(一)載體表型選擇法

2.

-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色+（1）原理載體上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。一、遺傳學(xué)檢測法(一)載體表型選擇法

2.

-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法（2）選擇過程假陽性：如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒有中止密碼；（不破壞肽）。一、遺傳學(xué)檢測法(一)載體表型選擇法

2.-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。一、遺傳學(xué)檢測法

(二)根據(jù)插入基因的遺傳性狀的選擇利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。

1.原理

（1）彌補(bǔ)缺陷轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長一、遺傳學(xué)檢測法

(二)根據(jù)插入基因的遺傳性狀的選擇

1.原理（2）增加新性狀使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。例：小鼠的二輕葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長二、核酸分子雜交檢測法

利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉(zhuǎn)化后生長的菌落復(fù)印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標(biāo)記，結(jié)合了放射性核酸探針的菌落集團(tuán)可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標(biāo)記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。

Southern、Northern、斑點(diǎn)印跡雜交盒狹線印跡雜交、菌落原位雜交二、核酸分子雜交檢測法1.核酸雜交(一)原理重組克隆與探針雜交3.識別標(biāo)記32P（1）放射性同位素2.檢測用的探針與外源DNA插入片段互補(bǔ)的序列（2）非放射性標(biāo)記熒光素二、核酸分子雜交檢測法

(二)核酸雜交檢測方法

1.Southernblotting

用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片段的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。

只有帶有插入片段的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。二、核酸分子雜交檢測法Southernblot篩選結(jié)果(二)核酸雜交檢測方法

1.Southernblotting二、核酸分子雜交檢測法Southernblotting二、核酸分子雜交檢測法

(二)核酸雜交檢測方法

2.原位雜交特點(diǎn)：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。二、核酸分子雜交檢測法

(二)核酸雜交檢測方法

3.R-環(huán)檢測法鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源區(qū)域在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度的甲酰胺溶液中（70%），雙鏈的DNA-RNA分子比雙鏈的DNA-DNA分子更加穩(wěn)定。在這種條件下，RNA會同它的雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的RNA-DNA，而被取代的另一條DNA呈單鏈狀態(tài)。這種由雙鏈RNA-DNA和單鏈DNA形成的泡狀體稱R-環(huán)結(jié)構(gòu)。二、核酸分子雜交檢測法二、核酸雜交檢測方法

3.R-環(huán)檢測法缺點(diǎn)：需要電鏡！二、核酸分子雜交檢測法

(二)核酸雜交檢測方法

4.Northernblotting用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片段是否被轉(zhuǎn)錄。

從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。二、核酸分子雜交檢測法

(二)核酸雜交檢測方法

5.斑點(diǎn)雜交

與Southern雜交和原位雜交相似三、物理檢測法利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。

(一)凝膠電泳檢測法

從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。載體重組克隆分子量Marker三、物理檢測法

(二)酶切電泳篩選法

1.原理根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片段，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。三、物理檢測法A或B(二)酶切電泳篩選法三、物理檢測法(二)酶切電泳篩選法不同克隆的酶切結(jié)果三、物理檢測法四、免疫化學(xué)檢測法

利用免疫學(xué)的原理，檢測克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物。蛋白——蛋白“雜交”利用抗體作為“探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。

(一)放射性抗體檢測法

1.抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為以下幾種作用方式：

四、免疫化學(xué)檢測法待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗(一)放射性抗體檢測法

1.抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式四、免疫化學(xué)檢測法

(一)放射性抗體檢測法

2.放射性抗體檢測法過程四、免疫化學(xué)檢測法

(一)放射性抗體檢測法

3.Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測法檢測融合蛋白。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。質(zhì)粒基因A插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白四、免疫化學(xué)檢測法固相支持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光(一)放射性抗體檢測法

3.Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測法四、免疫化學(xué)檢測法

(二)免疫沉淀檢測法檢測分泌型產(chǎn)物。

1.原理：抗原——抗體凝集反應(yīng)。

2.方法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。四、免疫化學(xué)檢測法

(三)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

Enzyme-linkedimmunosorbantassay

1.原理：

一抗（primaryantibody）:與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。

二抗（secondaryantibody）：與一抗的特異性結(jié)合。

酶連（enzyme-linke）：

二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測目標(biāo)分子的含量。四、免疫化學(xué)檢測法待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

四、免疫化學(xué)檢測法

(三)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

2.ELISA檢測的一般步驟

（1）固定樣品將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎姿摹⒚庖呋瘜W(xué)檢測法

(三)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

2.ELISA檢測的一般步驟（2）一抗結(jié)合加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。一抗四、免疫化學(xué)檢測法

(三)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

2.ELISA檢測的一般步驟（3）二抗結(jié)合

加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。四、免疫化學(xué)檢測法

(三)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

2.ELISA檢測的一般步驟

（4）顯色反應(yīng)加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。四、免疫化學(xué)檢測法四、免疫化學(xué)檢測法

(三)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

2.ELISA檢測的一般步驟

（5）比色在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。四、免疫化學(xué)檢測法(三)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）3.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）四、免疫化學(xué)檢測法

(四)免疫印跡（westernblotting）法在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。

1.原理

（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳①SDS:是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。②聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大小（鏈的長短），從而把不同分子量的肽鏈分開。四、免疫化學(xué)檢測法電泳buffer電泳buffer(四)免疫印跡（westernblotting）法四、免疫化學(xué)檢測法

(四)免疫印跡（westernblotting）法

1.原理（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

③蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓四、免疫化學(xué)檢測法SDSPAGEDalt