實(shí)驗(yàn)三 SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量 2014.10.08課件

實(shí)驗(yàn)三SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS）測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

2014.10.08一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)步驟本節(jié)課的內(nèi)容一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。什么是電泳？

電泳（electrophoresis）是指帶電顆粒在電場(chǎng)中的泳動(dòng)。許多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都含有可電離基團(tuán)，在非等電點(diǎn)條件下帶有電荷，在電場(chǎng)力的作用下，它們向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用樣品中各種分子帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場(chǎng)中的遷移速度不同，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、純化和鑒定的一種綜合技術(shù)?？捎糜跇悠返闹苽?、純度鑒定、分子量測(cè)定等。電泳的基本知識(shí)和原理影響帶電粒子在電場(chǎng)中泳動(dòng)的因素1．生物大分子的性質(zhì)：待分離生物大分子所帶電荷的多少、分子大小和性質(zhì)都會(huì)對(duì)電泳產(chǎn)生明顯影響。2．緩沖液：緩沖液pH值直接影響生物大分子的解離程度和帶電性質(zhì).溶液pH值距離等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，生物大分子所帶凈電荷就越多，電泳時(shí)速度就越快。當(dāng)緩沖液pH大于等電點(diǎn)時(shí)，生物大分子帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)；當(dāng)緩沖液pH小于等電點(diǎn)時(shí)，生物大分子帶正電荷，電泳時(shí)向負(fù)極移動(dòng)。電泳的基本知識(shí)和原理3．電場(chǎng)強(qiáng)度：

電場(chǎng)強(qiáng)度指每單位介質(zhì)長(zhǎng)度的電位梯度（又稱電位差或電位降）。一般而言，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳速度越快。但隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大會(huì)引起通過(guò)介質(zhì)的電流強(qiáng)度增大，從而造成電泳過(guò)程產(chǎn)生的熱量增多，最終導(dǎo)致介質(zhì)溫度升高。降低電流強(qiáng)度，可以減少產(chǎn)熱，但會(huì)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，引起生物大分子擴(kuò)散增加，同樣影響分離效果。所以電泳實(shí)驗(yàn)中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)強(qiáng)度。電泳的基本知識(shí)和原理4．電滲：

液體在電場(chǎng)中對(duì)于固體支持介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。由于支持介質(zhì)表面存在一些帶電基團(tuán)，如濾紙表面含有羧基，瓊脂含有硫酸基等。這些基團(tuán)電離后使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子在電場(chǎng)作用下向電極方向移動(dòng)，形成介質(zhì)表面溶液的流動(dòng)。當(dāng)電滲方向與電泳方向相同時(shí)則加快電泳速度；當(dāng)電滲方向與電泳方向相反時(shí)，則降低電泳速度。電泳的基本知識(shí)和原理電泳技術(shù)的分類1.根據(jù)電泳中是否使用支持介質(zhì)分為自由電泳和區(qū)帶電泳：①自由電泳不使用支持介質(zhì)，電泳在溶液中進(jìn)行。②區(qū)帶電泳需使用支持介質(zhì)，根據(jù)支持介質(zhì)不同可分為醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和凝膠電泳等。根據(jù)支持介質(zhì)的裝置形式不同又可分為水平板式電泳、垂直板式電泳、垂直盤(pán)狀電泳、毛細(xì)管電脈等。2.根據(jù)電泳時(shí)電壓的高低分為高壓電泳和常壓電泳：①高壓電泳使用的電壓在500～1000V，這類電泳分離速度快，但熱效應(yīng)較大，必須具備冷卻裝置，主要適用于小分子化合物的快速分離。②常壓電泳使用的電壓在500V以下，電位梯度為2～10V/cm。這類電泳的分離速度較慢，但對(duì)電泳設(shè)備要求簡(jiǎn)單。電泳的基本知識(shí)和原理電泳示蹤劑電泳常用的示蹤劑有溴酚蘭和二甲苯青FF。示蹤劑一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以確保樣品均勻沉入加樣孔內(nèi)。電泳的基本知識(shí)和原理

蛋白質(zhì)變性0.1-1%SDS0.1Mbeta-巰基乙醇蛋白質(zhì)變與SDS分子按比例結(jié)合1：1.4SDSSDS的性質(zhì)與作用SDS的結(jié)構(gòu)決定了它可破壞蛋白質(zhì)的疏水作用（該作用對(duì)維持蛋白三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)相當(dāng)重要），SDS：十二烷基磺酸鈉，十二烷基部分是疏水結(jié)構(gòu)，而磺酸鈉部分是親水或極性結(jié)構(gòu)。SDS的疏水結(jié)構(gòu)可插入蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部（通常水溶性的蛋白質(zhì)，其疏水氨基酸殘基埋藏在蛋白內(nèi)部，親水氨基酸殘基位于分子表面），這樣，SDS就破壞了蛋白的疏水作用，從而破壞蛋白的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，引起變性。beta-巰基乙醇SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同(雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒狀的復(fù)合物)，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDS中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系

SDS的性質(zhì)與作用丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無(wú)電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量?。?～100μg）、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可通過(guò)控制單體濃度或與交聯(lián)劑的比例聚合成不同大小孔徑的凝膠。可用于蛋白質(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析；還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：通常采用過(guò)硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在TEMED催化下，過(guò)硫酸銨可使丙烯酰胺單體的雙鍵打開(kāi)、活化形成自由基丙烯酰胺，從而引發(fā)聚合作用。（2）光聚合：通常采用核黃素作催化劑，核黃素在光照下光解成無(wú)色基，后者再被氧化成自由基而引發(fā)聚合作用。光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變小，不太穩(wěn)定?；瘜W(xué)聚合的凝膠孔徑較小，且各次制備的重復(fù)性好。故一般采用化學(xué)聚合。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)三、實(shí)驗(yàn)步驟一、安裝垂直板型電泳裝置二、凝膠的制備

分離膠的制備在一個(gè)干凈的小燒杯中，按所列的試劑用量配制。

SDS-不連續(xù)系統(tǒng)12％分離膠濃度，10ml體積配制量：1.30%凝膠貯液4.0ml2.分離膠緩沖液1.25ml3.10%SDS0.1ml4.ddH2O4.0ml5.10%過(guò)硫酸胺0.06ml6.2%TEMED0.6ml濃縮膠的制備在另一個(gè)干凈的小燒杯中。

4.5％分離膠濃度，5ml體積配制用量表：1.30%凝膠貯液0.75mL2.濃縮膠緩沖液0.83mL3.10%SDS

0.1ml4.ddH2O3.0mL10%過(guò)硫酸胺0.03mL2%TEMED

0.3mL分離膠pH8.8加入濃縮膠溶液pH6.8制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳牛血清白蛋白樣品2樣品1蛋白marker樣品1樣品2牛血清白蛋白兩塊膠一個(gè)電泳系統(tǒng)，兩組共用：第一組加樣第二組加樣第二塊膠加樣順序與第一塊膠相同三加樣

將pH8.3的電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒(méi)過(guò)短玻璃片。用微量注射器依次在各個(gè)樣品凹槽內(nèi)加樣，一般加樣體積為10～15μL。如樣品較稀，可加20～30μL。由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，故樣品溶液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表面形成樣品層。四電泳

將上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開(kāi)電源，開(kāi)始時(shí)將電流控制在15～20mA,待樣品進(jìn)入分離膠后，改為30～50mA。待藍(lán)色染料遷移至下端約1～1.5cm時(shí)，停止電泳，約需1～2小時(shí)。恒壓(60V90V)

五剝膠

取下凝膠模子，將凝膠片取出，滑入一白瓷盤(pán)或大培養(yǎng)皿內(nèi)。六染色和脫色

染色用一塊膠，另一塊膠用于轉(zhuǎn)膜。加入染色液，染色45分鐘。脫色

染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。20～30min換一次脫色液，2～3次后可初步觀察電泳條帶，然后脫色過(guò)夜，直至背景清晰。七、Mr的計(jì)算

標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。

以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量。

八轉(zhuǎn)膜膠放在3張緩沖液浸濕的濾紙上，蓋上經(jīng)甲醇激活（15-30sec）的PVDF膜（切多余的膜及紙，與凝膠一樣大小）排氣泡，蓋同樣3張緩沖液浸濕的濾紙，排氣泡。順序：負(fù)極－3層濾紙－凝膠－膜－3層濾紙－正極，如圖。用塑料夾夾緊，放入轉(zhuǎn)移電泳儀，電泳槽擱置冰上，恒壓１小時(shí)。麗春紅染色1分鐘檢測(cè)目標(biāo)蛋白。九封閉PVDF膜用TBST淋洗，放入封閉液中蛋白轉(zhuǎn)膜組裝順序（sandwich制作）組裝順序：轉(zhuǎn)膜夾黑色面（負(fù)極）－海綿墊－濾紙－膠－膜－濾紙－海綿墊－紅色面（正極）海綿Cathode_Anode+濾紙膜膠濾紙海綿

醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)【基本原理】本實(shí)驗(yàn)用醋酸纖維薄膜作電泳支持物分離血清蛋白質(zhì)。血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都小于7.5，在pH=8.6的巴比妥緩沖溶液中都帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng)。由于血清中各蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不一，所帶凈電荷有差異，所以它們的泳動(dòng)速率也不同。將微量血清點(diǎn)于薄膜上，通電電泳后，將薄膜置染色液中使蛋白質(zhì)固定并染色，可將血清蛋白質(zhì)分成5條區(qū)帶，從正極端起分別為白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。【操作步驟】一、準(zhǔn)備與點(diǎn)樣

1．將醋酸纖維薄膜切成2.5cm×8cm的小片。在薄膜無(wú)光澤面距一端1.5cm處用鉛筆輕輕劃一線，表示點(diǎn)樣位置。

2．將醋酸纖維薄膜無(wú)光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖溶液面上（緩沖溶液盛于培養(yǎng)皿中），使膜條自然下沉。

3．將充分浸透（指膜上沒(méi)有白色斑痕）的膜條取出，將薄膜無(wú)光澤面向上，平放在干凈濾紙上，用干凈濾紙吸去薄膜上多余的緩沖溶液。

4．將膜條（無(wú)光澤面向上）放于一干凈濾紙上，用寬1cm的有機(jī)玻片在盛有血清的小燒杯中蘸一下，使軟片下端粘上薄層血清，然后按在薄膜點(diǎn)樣線上，讓血清滲入膜內(nèi)，移開(kāi)軟片。二、電泳將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)無(wú)光澤面（即點(diǎn)樣面）向下，點(diǎn)樣端置于陰極（切勿弄錯(cuò)）。槽架上四層濾紙作橋墊，膜條與濾紙橋需貼緊并拉直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時(shí)安放多張薄膜，則薄膜之間應(yīng)相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，待平衡5分鐘后通電，電壓為10V/cm長(zhǎng)（指膜條與濾紙橋總長(zhǎng)度），電流為0.4～0.6mA/cm寬，電泳時(shí)間約1小時(shí)左右。三、染色通電完畢后用鑷子將薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分鐘取出，立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景漂凈為止。用濾紙吸干薄膜。1.低濃度的鹽溶液為什么會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)有溶解作用？2.課本上說(shuō)細(xì)胞破碎后蛋白質(zhì)溶解在抽提液中，需要將蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行濃縮，而最常用的濃縮方法是沉淀法，那么沉淀法具體是什么樣的原理和操作方式？3.Lowry法為什么加入新配置的堿性銅溶液之后，要強(qiáng)調(diào)立即搖勻？4.Lowry法?為什么加入Folin-酚試劑之后，要強(qiáng)調(diào)邊加入邊立即充分混合？5.Lowry法?為什么加入Folin-酚試劑之后，在室溫下放置的時(shí)間不能超過(guò)60min？6.Lowry法?課本上要求使用的波長(zhǎng)是550nm，而課件上是745-750nm，