34章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件

一、填空題

1、嘧啶核苷酸從頭合成的第一個(gè)核苷酸是（），嘌呤核苷酸從頭合成的第一個(gè)核苷酸是（）。2、dTMP的直接前體是（）。3、人類對(duì)嘌呤代謝的終產(chǎn)物是（）4、嘧啶合成中氨甲酰磷酸的合成以（）作為氨的供體，尿素循環(huán)中氨甲酰磷酸由（）作為氨的供體。5、與嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的原子來(lái)源都有關(guān)的氨基酸是（）。6、治療痛風(fēng)可用（）來(lái)作為黃嘌呤氧化酶的自殺性底物。7、5-FU的抗癌作用機(jī)理是（）。一、填空題1二、選擇題1.下列哪種物質(zhì)不是嘌呤核苷酸從頭合成的直接原料？A.甘氨酸B.天冬氨酸C.苯丙氨酸D.CO2E.一碳單位2.在細(xì)胞中自UMP合成dTMP的有關(guān)反應(yīng)涉及A.四氫葉酸衍生物傳遞一碳單位B.四氫葉酸氧化成二氫葉酸C.中間產(chǎn)物為dUDPD.受5-氟尿嘧啶的抑制E.受6-巰基嘌呤的抑制3、嘌呤環(huán)1號(hào)N來(lái)源于（）A、Gln的酰胺NB、Gln的α-氨基NC、Asn的酰胺ND、Asp的α-氨基N4、鳥(niǎo)嘌呤是（）A、2-氧-4-氨基嘌呤B、2-氨基-4-氧嘌呤C、2-氨基-6-氧嘌呤D、2-氧-6-氨基嘌呤5、催化5’-磷酸核糖和ATP作用生成5’-PRPP的酶是（）A、核糖激酶B磷酸核糖激酶C三磷酸核苷酸激酶D磷酸核糖焦磷酸激酶二、選擇題26、下列哪種化合物對(duì)嘌呤核苷酸的生物合成不產(chǎn)生直接反饋抑制作用（）A、TMPB、IMPC、AMPD、GMP7、最直接聯(lián)系核苷酸代謝與糖代謝的物質(zhì)是（）A、葡萄糖B、6-磷酸葡萄糖C、1，6二磷酸葡萄糖D、5-磷酸核糖8、AMP分子中第六位碳原子上的氨基來(lái)源于（）A谷氨酰胺B谷氨酸C天冬氨酸D天冬酰胺9、催化dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP的酶是（）A核苷酸還原酶B胸甘酸合成酶C脫氧胸甘激酶D核苷酸激酶6、下列哪種化合物對(duì)嘌呤核苷酸的生物合成不產(chǎn)生直接反饋抑制作3三判斷題1、嘌呤核苷酸的從頭合成是先閉環(huán)，再形成N糖苷鍵。2、dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP的甲基供體是攜帶甲基的FH4。3、核苷酸的從頭合成和補(bǔ)救途徑都需要PRPP。4、氮雜絲氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與Gln相似，它干擾Gln在核苷酸合成中提供氨基作用。5、黃嘌呤氧化酶只能以黃嘌呤作為唯一底物。6、脫氧核苷酸是由核糖核苷三磷酸經(jīng)還原生成的。三判斷題4DNA的復(fù)制和修復(fù)DNA的復(fù)制和修復(fù)5

復(fù)制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過(guò)程。幾個(gè)基本概念：

逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過(guò)程。

翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的氨基酸順序的過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對(duì)原則合成RNA，即將DNA所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補(bǔ)的RNA的過(guò)程。復(fù)制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，在一6DNA是生物界遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物有機(jī)體的遺傳特征以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序——即遺傳信息。在細(xì)胞分裂前通過(guò)DNA的復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，在后代的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。DNA是生物界遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物有780年代以后在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳信息也可存在于RNA分子中，由RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA。遺傳信息的傳遞方向即生物界遺傳信息傳遞的中心法則。80年代以后在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳81964-1970發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)錄

1953年，Watson和Crick提出中心法則：遺傳信息的單向流動(dòng)。

中心法則：病毒（復(fù)制）復(fù)制轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)翻譯逆轉(zhuǎn)錄RNA的復(fù)制存在于RNA病毒DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，生物機(jī)體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，并通過(guò)DNA的復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA,然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。1964-1970發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)934章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件10DNA復(fù)制的可能方式的假設(shè)全保留與全新復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制DNA復(fù)制的可能方式的假設(shè)全保留與全新復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制11一、DNA的半保留復(fù)制2.半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù):1.定義：1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制。以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補(bǔ)方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來(lái)自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。第一節(jié)DNA的復(fù)制一、DNA的半保留復(fù)制2.半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù):1.定義：12DNA半保留復(fù)制圖示：DNA半保留復(fù)制圖示：13半保留復(fù)制的證明：

Meselson和Stahl將同位素15N標(biāo)記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌的DNA都帶上15N的標(biāo)記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的證明：Meselson和Stahl將同位素1415N-DNA的密度大于14N-DNA的密度15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度15DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質(zhì)，是處于不斷變異和發(fā)展之中

DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非16二、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性1）岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制①問(wèn)題的提出：已知DNA兩條鏈反向且都能作為模板；已知DNApol聚合方向5’→3’；岡崎等提出DNA的不連續(xù)復(fù)制模型，認(rèn)為：3’→5’走向的DNA是由許多5’→3’方向合成的DNA片段連接而成的。

岡崎片段：以5’→3’走向DNA為模板合成的小片段。約1000-2000bp。二、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性1）岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制17半不連續(xù)復(fù)制的發(fā)現(xiàn)

同位素實(shí)驗(yàn)，用含3H的dT標(biāo)記用T4噬菌體感染的大腸桿菌短時(shí)間內(nèi)分離的DNA均為DNA小片段一段時(shí)間后檢測(cè)到DNA大片段。當(dāng)用DNA連接酶的缺失的變異株時(shí)，檢測(cè)到大量DNA片段的積累。→證明DNA復(fù)制中有小片段合成。測(cè)定DNA小片段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于合成DNA的一半。似乎兩條鏈都是不連續(xù)合成的，后發(fā)現(xiàn)是由于U替代dT滲入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，DNA的U不再被切除，則檢測(cè)到一半3H標(biāo)記出現(xiàn)在小片段（岡崎片段）中。1968日本學(xué)者岡崎：半不連續(xù)復(fù)制的發(fā)現(xiàn)同位素實(shí)驗(yàn)，用含3H的dT標(biāo)記用T4噬18前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段前導(dǎo)鏈：以3’→5’方向的親代鏈為模板連續(xù)合成的子代鏈。滯后鏈：以5’→3’方向的親代鏈為模板的子代鏈先逆復(fù)制叉移動(dòng)方向合成岡崎片段，再連接成滯后鏈。其復(fù)制過(guò)程的復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式,故稱復(fù)制叉前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段前導(dǎo)鏈：以3’→5’方向的親代鏈為19三、與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)三、與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)20原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA為模板鏈，合成子代DNA，模板可以是雙鏈，也可以是單鏈DNA。合成產(chǎn)物與模板互補(bǔ)。需要引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物，引物含3’-OH.合成方向：53(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后發(fā)現(xiàn)該酶在許多生物中廣泛存在。該酶的催化性質(zhì)如下：原料：四種脫氧核苷三磷酸(一)DNA聚合酶：1956年Ko21（二）大腸桿菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（但持續(xù)合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（對(duì)雙鏈無(wú)作用，在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長(zhǎng)鏈，只作用于生長(zhǎng)中不配對(duì)的單鏈，校對(duì)功能。）；（3）還具有53’外切酶活性（雙鏈有效）；1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先從大腸桿菌中分離。該酶為單體酶,含一個(gè)鋅原子。為多功能酶，具有:該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有DNA合成酶活性，只是對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力下降，容易導(dǎo)致變異和死亡。推測(cè)該酶主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時(shí)RNA引物切除及其缺口的填補(bǔ)。（二）大腸桿菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（22a.聚合作用在引物的3‘-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個(gè)聚合上核苷酸。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3’-OH與5‘-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。a.聚合作用23DNA聚合酶催化的反應(yīng)：DNA聚合酶催化的反應(yīng)：24

b.3‘→5’外切酶活性（校對(duì)作用）3‘→5’外切酶活性是從3‘→5’方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。錯(cuò)誤核苷酸進(jìn)入polⅠ的結(jié)合位點(diǎn)不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3'→5'外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除。b.3‘→5’外切酶活性（校對(duì)作用）25c.5‘→3’外切酶活性（切除修復(fù)作用）5‘→3’外切酶活性是從5‘→3’方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈。它只作用具切口的雙螺旋DNA，并在切口以外的配對(duì)區(qū)切割。c.5‘→3’外切酶活性（切除修復(fù)作用265‘→3’外切酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段5‘-末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。5‘→3’外切酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能2734章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件28DNA聚合酶Ⅰ的功能DNA聚合酶Ⅰ的功能292、DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持續(xù)合成DNA的能力差。該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有DNA合成能力，推測(cè)該酶仍然不是真正的DNA聚合酶。該酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。2、DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA303、DNA聚合酶Ⅲ

多亞基酶，含十種亞基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）稱為核心酶，β2稱為夾子，（γ2δδ’χΨ）組成γ復(fù)合物，其主要功能是幫助β亞基夾住DNA，故稱為夾子裝配器，該酶DNA合成的持續(xù)能力強(qiáng)，主要與該結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，該酶合成速度大，活性高，缺失時(shí)大腸桿菌因DNA復(fù)制抑制而致死。因此認(rèn)為該酶DNA的真正復(fù)制酶。3、DNA聚合酶Ⅲ多亞基酶，含十種亞基:（αβγθτ31DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ結(jié)構(gòu)基因＊不同種類的亞基數(shù)目相對(duì)分子質(zhì)量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持續(xù)合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修復(fù)PolB≥788,000＋－2,4001,500修復(fù)PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000復(fù)制大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ結(jié)構(gòu)基因＊Pol32(三）DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈切口作用特點(diǎn)：大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能連接雙鏈DNA上的粘性切口，而且能連接無(wú)粘性末端的平頭雙鏈DNA。DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用。(三）DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈切口作用特點(diǎn)：大3334章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件341、拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復(fù)和其它轉(zhuǎn)變方面起重要作用。除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體，引起拓?fù)洚悩?gòu)體反應(yīng)的酶稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶。(四)與DNA合成有關(guān)的其它蛋白因子(大腸桿菌中)1、拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變35兩類拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn):口兩類拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn):口3634章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件372、解螺旋酶（解鏈酶）

通過(guò)水解ATP將DNA兩條鏈打開(kāi)。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開(kāi)一對(duì)堿基需要水解2個(gè)ATP分子。穩(wěn)定DNA解開(kāi)的單鏈，防止復(fù)性和保護(hù)單鏈部分不被核酸酶水解。3、單鏈結(jié)合蛋白：2、解螺旋酶（解鏈酶）通過(guò)水解ATP將DNA兩條鏈打3834章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件39引發(fā)體可以沿模板鏈5’3’方向移動(dòng),具有識(shí)別合成起始位點(diǎn)的功能，移動(dòng)到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。移動(dòng)和引發(fā)均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引發(fā)體的移動(dòng)與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。4、引物合成酶與引發(fā)前體引物合成酶：催化引物RNA的生成

引發(fā)前體:它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。引發(fā)體可以沿模板鏈5’3’方向移動(dòng),具有識(shí)別合成起40蛋白質(zhì)功能相對(duì)分子量（×103）分子/細(xì)胞DNA旋轉(zhuǎn)酶（或拓?fù)洚悩?gòu)酶）DNA解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白引物合成酶引入或松開(kāi)超螺旋使雙鏈DNA解鏈穩(wěn)定單鏈區(qū)合成RNA引物40065746050300100蛋白質(zhì)功能相對(duì)分子量（×103）分子/細(xì)胞DNA旋轉(zhuǎn)酶（或拓41（五）、參與DNA復(fù)制的酶與蛋白因子總覽圖（五）、參與DNA復(fù)制的酶與蛋白因子總覽圖42四、DNA的復(fù)制過(guò)程1、復(fù)制的起點(diǎn)與方向（一）復(fù)制的起始四、DNA的復(fù)制過(guò)程1、復(fù)制的起點(diǎn)與方向（一）復(fù)制的起始43大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）3真核細(xì)胞線狀染色體DNA的復(fù)制方式（多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）344從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）。

DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。常用oriC(或o）表示。大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)oriC由245個(gè)bp構(gòu)成，關(guān)鍵序列含兩組保守的重復(fù)序列：三個(gè)13bp的序列（富含A、T的序列）和四個(gè)9bp的序列；許多生物的復(fù)制原點(diǎn)也都是富含A、T的區(qū)段。復(fù)制原點(diǎn)由DnaA蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開(kāi)成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈(DNA雙鏈的解開(kāi)還需DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Π、SSB),在原點(diǎn)處形成一個(gè)眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼。2、起點(diǎn)的識(shí)別和雙鏈的解開(kāi)從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨(dú)立進(jìn)45（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶解開(kāi)超螺旋。（2）DnaA蛋白識(shí)別并在ATP存在下結(jié)合于四個(gè)9bp的重復(fù)序列。（3）在類組蛋白（HU、ATP參與下,DanA蛋白變性13個(gè)bp的重復(fù)序列,形成開(kāi)鏈復(fù)合物。（4）DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’→3’方向移動(dòng)，解開(kāi)DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。（5）單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。（6）引物合成酶（DnaG蛋白）開(kāi)始合成RNA引物。3、RNA引物的合成（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶解開(kāi)超螺旋。3、RNA引物的合成46（二）鏈的延伸

1、岡崎片段的合成

真核生物的岡崎片段為：100-200bp原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp（二）鏈的延伸

1、岡崎片段的合成真核生物的岡崎片段為472、DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型2、DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’48（三）DNA復(fù)制的終止DNA復(fù)制的終點(diǎn)在DNA上存在著復(fù)制終止位點(diǎn)，某些蛋白因子可識(shí)別終止位點(diǎn)的序列，使DNA復(fù)制在終止位點(diǎn)終止。E.coli的DNA復(fù)制終點(diǎn)序列：AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA大腸桿菌的兩個(gè)復(fù)制叉在相距終點(diǎn)100kb時(shí)，復(fù)制速度減慢，從而協(xié)調(diào)2個(gè)復(fù)制叉到達(dá)的時(shí)間。（三）DNA復(fù)制的終止49大腸桿菌的兩個(gè)復(fù)制叉在相距終點(diǎn)100kb時(shí)，復(fù)制速度減慢，從而協(xié)調(diào)2個(gè)復(fù)制叉到達(dá)的時(shí)間。大腸桿菌的兩個(gè)復(fù)制叉在相距終點(diǎn)100kb時(shí)，復(fù)制速度減慢，從50DNA復(fù)制時(shí)，當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充，最后由連接酶封口。形成兩條與親代鏈完全相同的兩條子代鏈。DNA復(fù)制時(shí)，當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA51（四）、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)4、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點(diǎn)不再重新開(kāi)始復(fù)制；而在快速生長(zhǎng)的原核生物染色體DNA復(fù)制中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。1、真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，稱為自主復(fù)制序列（ARS）或復(fù)制基因(replicator);多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。2、岡崎片段長(zhǎng)約200bp。3、真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢，速度為1000～3000bp/min(僅為原核生物的1/20～1/50）。（四）、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)4、真核生物染色體在全部復(fù)制527、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白。5、真核生物有多種DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的復(fù)制酶，在PCNA存在下有持續(xù)的合成能力。PCNA稱為增殖細(xì)胞核抗原，相當(dāng)于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夾子，RFC蛋白相當(dāng)于夾子裝配器。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，它是由許多成串的重復(fù)短序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接，并可補(bǔ)償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色體保持一定長(zhǎng)度。端粒酶是含一段RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶.7、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白。5、真核生物有多種DNA53逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）

1970年Temin等和Baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。

定義:以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過(guò)程稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行。用特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，而對(duì)一般RNA病毒的復(fù)制無(wú)影響。已知放線菌素D專門(mén)抑制以DNA為模板的反應(yīng)，可見(jiàn)致癌RNA病毒的復(fù)制過(guò)程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假說(shuō)。返回第二節(jié)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）54

以前病毒形式整合到宿主細(xì)胞DNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化單鏈病毒RNARNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿53’方向合成DNA，底物為四種dNTP,并要求短鏈RNA作引物。

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；

DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5’3’方向起核酸外切酶的作用；無(wú)校對(duì)功能，錯(cuò)誤率高，易產(chǎn)生變異。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+致癌RNA病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程以前病毒形式整合到宿主細(xì)胞DNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化單鏈病55cDNA：反義DNA幾乎所有真核生物mRNA分子的3’末端都有一段polyA,當(dāng)加入寡聚dT作為引物時(shí)，mRNA就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與該mRNA互補(bǔ)的DNA，稱為cDNA。不能把“中心法則”絕對(duì)化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。目前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學(xué)科的工具。

1983年,發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(humanimmunedeficiencevirus,HIV),感染T淋巴細(xì)胞后即殺死細(xì)胞,造成宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷,引起艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)，該病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論與實(shí)踐意義：cDNA：反義DNA幾乎所有真核生物mRNA分子的3’56第三節(jié)DNA損傷與修復(fù)DNA在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，都可能使DNA的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變。從而引起生物突變，甚至導(dǎo)致死亡。DNA的損傷第三節(jié)DNA損傷與修復(fù)DNA在復(fù)制時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)配，病毒基因57基因修復(fù)“工程隊(duì)”

錯(cuò)配修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)重組修復(fù)

SOS修復(fù)基因修復(fù)58錯(cuò)配修復(fù)

通過(guò)一個(gè)酶系統(tǒng)修復(fù)DNA錯(cuò)配的堿基根據(jù)復(fù)制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子代鏈上的錯(cuò)配堿基1、參與錯(cuò)配修復(fù)的酶與蛋白質(zhì)Dam甲基化酶;MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;DNA聚合酶Ⅲ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；DNA連接酶；SSB錯(cuò)配修復(fù)1、參與錯(cuò)配修復(fù)的酶與蛋白質(zhì)59甲基化指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)甲基化指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)60

甲基化指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)甲基化指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)61(二)堿基的切除修復(fù)（1）堿基切除修復(fù)(BaseExcisionRepairBER)DNA糖苷酶(glycosylase)識(shí)別損傷堿基并切開(kāi)糖苷鍵

Ap內(nèi)切酶切開(kāi)Ap位點(diǎn)附近的磷酸二酯鍵

DNAPolI除去DNA鏈的損傷部分(5’-3’外切)并合成連接酶封閉（2）核苷酸切除修復(fù)(NucleotideExcisionRepairNER)uvrABC核酸酶切下含有損傷部位的一段DNA片段(約12Nt)，DNAPolI填補(bǔ)缺口，連接酶封閉切口切除修復(fù)對(duì)多種DNA損傷包括堿基脫落形成的無(wú)堿基位點(diǎn)、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復(fù)作用。(二)堿基的切除修復(fù)（1）堿基切除修復(fù)(Base62DNA解螺旋酶DNA解螺旋酶63（三）直接修復(fù)（三）直接修復(fù)64（四）重組修復(fù)(recombinationalrepair)（四）重組修復(fù)(recombinationalrepair65重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)后合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞是帶有損傷DNA的。重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍66（六）SOS反應(yīng)和誘導(dǎo)修復(fù)（易錯(cuò)修復(fù)）SOS反應(yīng)：細(xì)胞DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷或DNA復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急狀態(tài)下，為求生存而出現(xiàn)的應(yīng)急反應(yīng)。SOS反應(yīng)包括:避免差錯(cuò)的修復(fù)能力增強(qiáng)誘導(dǎo)產(chǎn)生無(wú)校正功能的DNA聚合酶合成抑制細(xì)胞分裂SOS反應(yīng)是生物在不利環(huán)境中求得生存的一種基本功能。對(duì)原核生物它產(chǎn)生高變異，對(duì)高等動(dòng)物則是致癌的。（六）SOS反應(yīng)和誘導(dǎo)修復(fù)（易錯(cuò)修復(fù)）SOS反應(yīng)：細(xì)胞DN67第四節(jié)DNA復(fù)制的精確性（高保真復(fù)制）1、堿基的配對(duì)規(guī)律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對(duì)保證堿基配錯(cuò)幾率約為1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對(duì)功能，使堿基的錯(cuò)配幾率又降低100～1000倍。3、DNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)。DNA復(fù)制必須具有高度精確性，在大腸桿菌的細(xì)胞DNA復(fù)制中其錯(cuò)誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個(gè)核苷酸才出現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)誤，也就是大腸桿菌染色體DNA復(fù)制1000～10000次才出現(xiàn)一個(gè)核苷酸的錯(cuò)誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關(guān)：第四節(jié)DNA復(fù)制的精確性（高保真復(fù)制）1、堿基的配對(duì)規(guī)律：68（一）名詞解釋1.半保留復(fù)制；2.岡崎片段；(二)、單選題1．DNA復(fù)制時(shí)，下列哪一種酶是不需要的A．DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶B．DNA連接酶C．拓樸異構(gòu)酶D．解鏈酶E．限制性內(nèi)切酶2.DNA復(fù)制時(shí)，子鏈的合成是A.一條鏈5′→3′，另一條鏈3′→5′B．兩條鏈均為3′→5′C．兩條鏈均為5′→3′D．兩條鏈均為連續(xù)合成E．兩條鏈均為不連續(xù)合成3.在E.coli細(xì)胞中DNA聚合酶Ⅰ的作用主要是A.DNA復(fù)制B.E.coliDNA合成的起始C.切除RNA引物D.岡崎片段的連接（一）名詞解釋69一、填空題

1、嘧啶核苷酸從頭合成的第一個(gè)核苷酸是（），嘌呤核苷酸從頭合成的第一個(gè)核苷酸是（）。2、dTMP的直接前體是（）。3、人類對(duì)嘌呤代謝的終產(chǎn)物是（）4、嘧啶合成中氨甲酰磷酸的合成以（）作為氨的供體，尿素循環(huán)中氨甲酰磷酸由（）作為氨的供體。5、與嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的原子來(lái)源都有關(guān)的氨基酸是（）。6、治療痛風(fēng)可用（）來(lái)作為黃嘌呤氧化酶的自殺性底物。7、5-FU的抗癌作用機(jī)理是（）。一、填空題70二、選擇題1.下列哪種物質(zhì)不是嘌呤核苷酸從頭合成的直接原料？A.甘氨酸B.天冬氨酸C.苯丙氨酸D.CO2E.一碳單位2.在細(xì)胞中自UMP合成dTMP的有關(guān)反應(yīng)涉及A.四氫葉酸衍生物傳遞一碳單位B.四氫葉酸氧化成二氫葉酸C.中間產(chǎn)物為dUDPD.受5-氟尿嘧啶的抑制E.受6-巰基嘌呤的抑制3、嘌呤環(huán)1號(hào)N來(lái)源于（）A、Gln的酰胺NB、Gln的α-氨基NC、Asn的酰胺ND、Asp的α-氨基N4、鳥(niǎo)嘌呤是（）A、2-氧-4-氨基嘌呤B、2-氨基-4-氧嘌呤C、2-氨基-6-氧嘌呤D、2-氧-6-氨基嘌呤5、催化5’-磷酸核糖和ATP作用生成5’-PRPP的酶是（）A、核糖激酶B磷酸核糖激酶C三磷酸核苷酸激酶D磷酸核糖焦磷酸激酶二、選擇題716、下列哪種化合物對(duì)嘌呤核苷酸的生物合成不產(chǎn)生直接反饋抑制作用（）A、TMPB、IMPC、AMPD、GMP7、最直接聯(lián)系核苷酸代謝與糖代謝的物質(zhì)是（）A、葡萄糖B、6-磷酸葡萄糖C、1，6二磷酸葡萄糖D、5-磷酸核糖8、AMP分子中第六位碳原子上的氨基來(lái)源于（）A谷氨酰胺B谷氨酸C天冬氨酸D天冬酰胺9、催化dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP的酶是（）A核苷酸還原酶B胸甘酸合成酶C脫氧胸甘激酶D核苷酸激酶6、下列哪種化合物對(duì)嘌呤核苷酸的生物合成不產(chǎn)生直接反饋抑制作72三判斷題1、嘌呤核苷酸的從頭合成是先閉環(huán)，再形成N糖苷鍵。2、dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP的甲基供體是攜帶甲基的FH4。3、核苷酸的從頭合成和補(bǔ)救途徑都需要PRPP。4、氮雜絲氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與Gln相似，它干擾Gln在核苷酸合成中提供氨基作用。5、黃嘌呤氧化酶只能以黃嘌呤作為唯一底物。6、脫氧核苷酸是由核糖核苷三磷酸經(jīng)還原生成的。三判斷題73DNA的復(fù)制和修復(fù)DNA的復(fù)制和修復(fù)74

復(fù)制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過(guò)程。幾個(gè)基本概念：

逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過(guò)程。

翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的氨基酸順序的過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對(duì)原則合成RNA，即將DNA所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補(bǔ)的RNA的過(guò)程。復(fù)制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，在一75DNA是生物界遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物有機(jī)體的遺傳特征以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序——即遺傳信息。在細(xì)胞分裂前通過(guò)DNA的復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，在后代的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。DNA是生物界遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。生物有7680年代以后在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳信息也可存在于RNA分子中，由RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA。遺傳信息的傳遞方向即生物界遺傳信息傳遞的中心法則。80年代以后在某些致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)遺傳771964-1970發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)錄

1953年，Watson和Crick提出中心法則：遺傳信息的單向流動(dòng)。

中心法則：病毒（復(fù)制）復(fù)制轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)翻譯逆轉(zhuǎn)錄RNA的復(fù)制存在于RNA病毒DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，生物機(jī)體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，并通過(guò)DNA的復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA,然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。1964-1970發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)7834章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件79DNA復(fù)制的可能方式的假設(shè)全保留與全新復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制DNA復(fù)制的可能方式的假設(shè)全保留與全新復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制80一、DNA的半保留復(fù)制2.半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù):1.定義：1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制。以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補(bǔ)方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來(lái)自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。第一節(jié)DNA的復(fù)制一、DNA的半保留復(fù)制2.半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù):1.定義：81DNA半保留復(fù)制圖示：DNA半保留復(fù)制圖示：82半保留復(fù)制的證明：

Meselson和Stahl將同位素15N標(biāo)記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌的DNA都帶上15N的標(biāo)記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的證明：Meselson和Stahl將同位素8315N-DNA的密度大于14N-DNA的密度15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度84DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質(zhì)，是處于不斷變異和發(fā)展之中

DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非85二、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性1）岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制①問(wèn)題的提出：已知DNA兩條鏈反向且都能作為模板；已知DNApol聚合方向5’→3’；岡崎等提出DNA的不連續(xù)復(fù)制模型，認(rèn)為：3’→5’走向的DNA是由許多5’→3’方向合成的DNA片段連接而成的。

岡崎片段：以5’→3’走向DNA為模板合成的小片段。約1000-2000bp。二、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性1）岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制86半不連續(xù)復(fù)制的發(fā)現(xiàn)

同位素實(shí)驗(yàn)，用含3H的dT標(biāo)記用T4噬菌體感染的大腸桿菌短時(shí)間內(nèi)分離的DNA均為DNA小片段一段時(shí)間后檢測(cè)到DNA大片段。當(dāng)用DNA連接酶的缺失的變異株時(shí)，檢測(cè)到大量DNA片段的積累?！C明DNA復(fù)制中有小片段合成。測(cè)定DNA小片段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于合成DNA的一半。似乎兩條鏈都是不連續(xù)合成的，后發(fā)現(xiàn)是由于U替代dT滲入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，DNA的U不再被切除，則檢測(cè)到一半3H標(biāo)記出現(xiàn)在小片段（岡崎片段）中。1968日本學(xué)者岡崎：半不連續(xù)復(fù)制的發(fā)現(xiàn)同位素實(shí)驗(yàn)，用含3H的dT標(biāo)記用T4噬87前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段前導(dǎo)鏈：以3’→5’方向的親代鏈為模板連續(xù)合成的子代鏈。滯后鏈：以5’→3’方向的親代鏈為模板的子代鏈先逆復(fù)制叉移動(dòng)方向合成岡崎片段，再連接成滯后鏈。其復(fù)制過(guò)程的復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式,故稱復(fù)制叉前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段前導(dǎo)鏈：以3’→5’方向的親代鏈為88三、與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)三、與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)89原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA為模板鏈，合成子代DNA，模板可以是雙鏈，也可以是單鏈DNA。合成產(chǎn)物與模板互補(bǔ)。需要引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物，引物含3’-OH.合成方向：53(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后發(fā)現(xiàn)該酶在許多生物中廣泛存在。該酶的催化性質(zhì)如下：原料：四種脫氧核苷三磷酸(一)DNA聚合酶：1956年Ko90（二）大腸桿菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（但持續(xù)合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（對(duì)雙鏈無(wú)作用，在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長(zhǎng)鏈，只作用于生長(zhǎng)中不配對(duì)的單鏈，校對(duì)功能。）；（3）還具有53’外切酶活性（雙鏈有效）；1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先從大腸桿菌中分離。該酶為單體酶,含一個(gè)鋅原子。為多功能酶，具有:該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有DNA合成酶活性，只是對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力下降，容易導(dǎo)致變異和死亡。推測(cè)該酶主要是對(duì)DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時(shí)RNA引物切除及其缺口的填補(bǔ)。（二）大腸桿菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（91a.聚合作用在引物的3‘-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個(gè)聚合上核苷酸。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3’-OH與5‘-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。a.聚合作用92DNA聚合酶催化的反應(yīng)：DNA聚合酶催化的反應(yīng)：93

b.3‘→5’外切酶活性（校對(duì)作用）3‘→5’外切酶活性是從3‘→5’方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。錯(cuò)誤核苷酸進(jìn)入polⅠ的結(jié)合位點(diǎn)不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3'→5'外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除。b.3‘→5’外切酶活性（校對(duì)作用）94c.5‘→3’外切酶活性（切除修復(fù)作用）5‘→3’外切酶活性是從5‘→3’方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈。它只作用具切口的雙螺旋DNA，并在切口以外的配對(duì)區(qū)切割。c.5‘→3’外切酶活性（切除修復(fù)作用955‘→3’外切酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段5‘-末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。5‘→3’外切酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能9634章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件97DNA聚合酶Ⅰ的功能DNA聚合酶Ⅰ的功能982、DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持續(xù)合成DNA的能力差。該酶缺失時(shí)大腸桿菌仍具有DNA合成能力，推測(cè)該酶仍然不是真正的DNA聚合酶。該酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。2、DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA993、DNA聚合酶Ⅲ

多亞基酶，含十種亞基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）稱為核心酶，β2稱為夾子，（γ2δδ’χΨ）組成γ復(fù)合物，其主要功能是幫助β亞基夾住DNA，故稱為夾子裝配器，該酶DNA合成的持續(xù)能力強(qiáng)，主要與該結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，該酶合成速度大，活性高，缺失時(shí)大腸桿菌因DNA復(fù)制抑制而致死。因此認(rèn)為該酶DNA的真正復(fù)制酶。3、DNA聚合酶Ⅲ多亞基酶，含十種亞基:（αβγθτ100DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ結(jié)構(gòu)基因＊不同種類的亞基數(shù)目相對(duì)分子質(zhì)量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持續(xù)合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修復(fù)PolB≥788,000＋－2,4001,500修復(fù)PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000復(fù)制大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ結(jié)構(gòu)基因＊Pol101(三）DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈切口作用特點(diǎn)：大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能連接雙鏈DNA上的粘性切口，而且能連接無(wú)粘性末端的平頭雙鏈DNA。DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用。(三）DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈切口作用特點(diǎn)：大10234章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件1031、拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復(fù)和其它轉(zhuǎn)變方面起重要作用。除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體，引起拓?fù)洚悩?gòu)體反應(yīng)的酶稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶。(四)與DNA合成有關(guān)的其它蛋白因子(大腸桿菌中)1、拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化DNA的拓?fù)溥B環(huán)數(shù)發(fā)生變104兩類拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn):口兩類拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn):口10534章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件1062、解螺旋酶（解鏈酶）

通過(guò)水解ATP將DNA兩條鏈打開(kāi)。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開(kāi)一對(duì)堿基需要水解2個(gè)ATP分子。穩(wěn)定DNA解開(kāi)的單鏈，防止復(fù)性和保護(hù)單鏈部分不被核酸酶水解。3、單鏈結(jié)合蛋白：2、解螺旋酶（解鏈酶）通過(guò)水解ATP將DNA兩條鏈打10734章DNA的復(fù)制和修復(fù)1課件108引發(fā)體可以沿模板鏈5’3’方向移動(dòng),具有識(shí)別合成起始位點(diǎn)的功能，移動(dòng)到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。移動(dòng)和引發(fā)均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引發(fā)體的移動(dòng)與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。4、引物合成酶與引發(fā)前體引物合成酶：催化引物RNA的生成

引發(fā)前體:它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。引發(fā)體可以沿模板鏈5’3’方向移動(dòng),具有識(shí)別合成起109蛋白質(zhì)功能相對(duì)分子量（×103）分子/細(xì)胞DNA旋轉(zhuǎn)酶（或拓?fù)洚悩?gòu)酶）DNA解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白引物合成酶引入或松開(kāi)超螺旋使雙鏈DNA解鏈穩(wěn)定單鏈區(qū)合成RNA引物40065746050300100蛋白質(zhì)功能相對(duì)分子量（×103）分子/細(xì)胞DNA旋轉(zhuǎn)酶（或拓110（五）、參與DNA復(fù)制的酶與蛋白因子總覽圖（五）、參與DNA復(fù)制的酶與蛋白因子總覽圖111四、DNA的復(fù)制過(guò)程1、復(fù)制的起點(diǎn)與方向（一）復(fù)制的起始四、DNA的復(fù)制過(guò)程1、復(fù)制的起點(diǎn)與方向（一）復(fù)制的起始112大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）3真核細(xì)胞線狀染色體DNA的復(fù)制方式（多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制）3113從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）。

DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，叫做復(fù)制原點(diǎn)。常用oriC(或o）表示。大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)oriC由245個(gè)bp構(gòu)成，關(guān)鍵序列含兩組保守的重復(fù)序列：三個(gè)13bp的序列（富含A、T的序列）和四個(gè)9bp的序列；許多生物的復(fù)制原點(diǎn)也都是富含A、T的區(qū)段。復(fù)制原點(diǎn)由DnaA蛋白識(shí)別，在原點(diǎn)由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開(kāi)成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈(DNA雙鏈的解開(kāi)還需DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Π、SSB),在原點(diǎn)處形成一個(gè)眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼。2、起點(diǎn)的識(shí)別和雙鏈的解開(kāi)從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨(dú)立進(jìn)114（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶解開(kāi)超螺旋。（2）DnaA蛋白識(shí)別并在ATP存在下結(jié)合于四個(gè)9bp的重復(fù)序列。（3）在類組蛋白（HU、ATP參與下,DanA蛋白變性13個(gè)bp的重復(fù)序列,形成開(kāi)鏈復(fù)合物。（4）DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’→3’方向移動(dòng)，解開(kāi)DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。（5）單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。（6）引物合成酶（DnaG蛋白）開(kāi)始合成RNA引物。3、RNA引物的合成（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶解開(kāi)超螺旋。3、RNA引物的合成115（二）鏈的延伸

1、岡崎片段的合成

真核生物的岡崎片段為：100-200bp原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp（二）鏈的延伸

1、岡崎片段的合成真核生物的岡崎片段為1162、DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型2、DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’117（三）DNA復(fù)制的終止DNA復(fù)制的終點(diǎn)在DNA上存在著復(fù)制終止位點(diǎn)，某些蛋白因子可識(shí)別終止位點(diǎn)的序列，使DNA復(fù)制在終止位點(diǎn)終止。E.coli的DNA復(fù)制終點(diǎn)序列：AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA大腸桿菌的兩個(gè)復(fù)制叉在相距終點(diǎn)100kb時(shí)，復(fù)制速度減慢，從而協(xié)調(diào)2個(gè)復(fù)制叉到達(dá)的時(shí)間。（三）DNA復(fù)制的終止118大腸桿菌的兩個(gè)復(fù)制叉在相距終點(diǎn)100kb時(shí)，復(fù)制速度減慢，從而協(xié)調(diào)2個(gè)復(fù)制叉到達(dá)的時(shí)間。大腸桿菌的兩個(gè)復(fù)制叉在相距終點(diǎn)100kb時(shí)，復(fù)制速度減慢，從119DNA復(fù)制時(shí)，當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充，最后由連接酶封口。形成兩條與親代鏈完全相同的兩條子代鏈。DNA復(fù)制時(shí)，當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA120（四）、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)4、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點(diǎn)不再重新開(kāi)始復(fù)制；而在快速生長(zhǎng)的原核生物染色體DNA復(fù)制中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)。1、真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，稱為自主復(fù)制序列（ARS）或復(fù)制基因(replicator);多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。2、岡崎片段長(zhǎng)約200bp。3、真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢，速度為1000～3000bp/min(僅為原核生物的1/20～1/50）。（四）、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)4、真核生物染色體在全部復(fù)制1217、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白。5、真核生物有多種DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的復(fù)制酶，在PCNA存在下有持續(xù)的合成能力。PCNA稱為增殖細(xì)胞核抗原，相當(dāng)于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夾子，RFC蛋白相當(dāng)于夾子裝配器。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，它是由許多成串的重復(fù)短序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接，并可補(bǔ)償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色體保持一定長(zhǎng)度。端粒酶是含一段RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶.7、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白。5、真核生物有多種DNA122逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）

1970年Temin等和Baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。

定義:以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過(guò)程稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行。用特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，而對(duì)一般RNA病毒的復(fù)制無(wú)影響。已知放線菌素D專門(mén)抑制以DNA為模板的反應(yīng)，可見(jiàn)致癌RNA病毒的復(fù)制過(guò)程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假說(shuō)。返回第二節(jié)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）123

以前病毒形式整合到宿主細(xì)胞DNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化單鏈病毒RNARNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿53’方向合成DNA，底物為四種dNTP,并要求短鏈RNA作引物。

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；

DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5’3’方向起核酸外切酶的作用；無(wú)校對(duì)功能，錯(cuò)誤率高，易產(chǎn)生變異。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+致癌RNA病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程以前病毒形式整合到宿主細(xì)胞DNA中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化單鏈病124cDNA：反義DNA幾乎所有真核生物mRNA分子的