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文檔簡介
流式細胞學在血液病中的臨床應(yīng)用(基礎(chǔ)篇)吳雨潔江蘇省人民醫(yī)院2014.10.29網(wǎng)絡(luò)課堂
流式細胞學在血液病中的臨床流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)是一項集激光技術(shù)、流體力學技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技技術(shù)。快速、準確、客觀,多參數(shù),可同時對特定群體加以分選。研究對象為生物顆粒,如各種細胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征,并加以定量。
是當代最先進的細胞定量分析技術(shù)
流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)是一項集激光技術(shù)、流體力學技術(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型微量殘留白血病細胞檢查陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿多發(fā)性骨髓瘤干細胞計數(shù)腫瘤細胞的周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞和網(wǎng)織血小板計數(shù)免疫狀態(tài)監(jiān)測血小板功能及相關(guān)疾病HLA-B27流式細胞儀的臨床應(yīng)用白血病和淋巴瘤的免疫分型流式細胞儀的臨床應(yīng)用標本來源:外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細胞、脫落細胞及其他血清或各類體液樣本。肝素抗凝的外周血和骨髓標本,存放時限為48~72小時;EDTA抗凝標本,存放時限只有12~24小時,因為髓細胞在此條件下會裂解;標本來源:直方圖散點圖二維等高圖密度圖常見的幾種流式細胞圖直方圖散點圖二維等高圖密度圖常見的幾種流式細胞圖設(shè)門淋巴細胞亞群設(shè)門淋巴細胞亞群一:白血病免疫分型一:白血病免疫分型白血病診斷依賴于多種檢測方法樣本形態(tài)學流式細胞術(shù)細胞遺傳學/FISH分子生物學
基礎(chǔ)和金標準
必需
重要白血病診斷依賴于多種檢測方法樣本形態(tài)學流式細胞術(shù)細胞遺傳學/急性白血病免疫分型的價值區(qū)分淋系、髓系白血病區(qū)分淋系白血病中的T、B-ALL鑒定混合細胞性白血病的類型:
T-M、B-M、T-B、T-B-M治療過程中監(jiān)測MRD,評價療效提示某些遺傳學異常:CD19+AML---t(8;21);CD13+CD33+B-ALL---t(9;22)提示預(yù)后:CD56等陽性的AML患者預(yù)后不良CD15陽性的AML患者CR率高
急性白血病免疫分型的價值區(qū)分淋系、髓系白血病正常造血細胞各系列抗原表達的演進不管是在胚胎期、老年期、還是化療以后,正常造血細胞抗原組合的表達模式都不改變。正常造血細胞各系列抗原表達的演進不管是在胚胎期白血病細胞表面抗原異常表達造血細胞抗原組合的表達模型能夠用于鑒別惡性克隆!白血病克隆與正常細胞之間抗原表達不同---白血病相關(guān)的免疫表型(LAIP)白血病細胞表面抗原異常表達造血細胞抗原組合的表達模型能正常造血細胞白血病細胞抗原表達遵循系列保守性出現(xiàn)抗原跨系表達髓系:CD33+,T系:CD7+髓系:CD33+CD7+抗原表達有一定的時序性出現(xiàn)抗原時序混亂表達原始細胞:CD34+CD15- 原始細胞:CD34+CD15+各階段細胞按一定的比例分布出現(xiàn)分化阻滯原幼細胞<5%原幼細胞>20%
抗原表達的缺失抗原強度的異常
正常造血細胞白需要掌握正常造血細胞的抗原表達規(guī)律不同系列的細胞表達的抗原?同一系列不同階段的細胞表達的抗原?每種抗原的表達強度?需要掌握正常造血細胞的抗原表達規(guī)律免疫分型常用的抗體干祖細胞
CD34、TDT、CD117、
CD38、HLA-DR、AMLCD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO懷疑M6加做CD71、GPA懷疑M7加做CD61、CD41、CD42B-ALLCD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79aT-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3NK細胞CD16、CD56、CD57漿細胞CD38、CD138、cκ、cλ、CD19、CD56免疫分型常用的抗體干祖細胞根據(jù)骨髓細胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門圈定各類細胞R1門為成熟淋巴細胞R2門為正常單核細胞位置R3門正常粒細胞位置R4門為幼稚淋巴細胞出現(xiàn)位置R5門為有核紅細胞或細胞碎片位置R6門為幼稚髓細胞出現(xiàn)位置白血病細胞通常會在R4R6兩門位置處出現(xiàn)正常成人骨髓樣本----CD45設(shè)門根據(jù)骨髓細胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門圈定各類細胞正AML-M1AML-M1AML-M2AML-M2AML-M3AML-M3結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學和形態(tài)學診斷M3。
結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學和形態(tài)學診斷M3。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M4。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M4。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M5。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M5。結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合形態(tài)學以確診M6。
結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合形態(tài)學以確診M6。AML-M7AML-M7B-ALLB-ALLT-ALLT-ALLEGILScoringSystemForBAL(>2points)ScoreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/64EGILScoringSystemForBAL(>2RequirementsforassigningmorethanonelineagetoasingleblastpopulationMyeloidlineageMyeloperoxidase(flowcytometry,immunohistochemistryorcytochemistry)orMonocyticdifferentiation(atleast2ofthefollowing:NSE,CD11c,CD14,CD64,)TlineageCytoplasmicCD3(flowcytometrywithantibodiestoCD3epsilonchain;immunohistochemistryusingpolyclonalanti-CD3antibodyzetachain,whichisnotT-cellspecific)orSurfaceCD3(rareinmixedphenotypeacuteleukemia)BlineageStrongCD19withatleast1ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10orWeakCD19withatleast2ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10MPAL(mixedphenotypeacuteleukemia)
WHO2008RequirementsforassigningmorCD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineageALL)B-negative,CD64+CD14+/-CD33+(MonocyticLeukemia)TwoLeukemicPopulationsMonoblastsLymphoblasts結(jié)論:急性混合細胞白血病(AM-LL)CD19+CD22+B-negative,CD64+Two二.白血病微小殘留病灶
(MRD)目的:判斷預(yù)后,指導(dǎo)個體化分層治療,預(yù)測復(fù)發(fā)二.白血病微小殘留病灶
(MRD)目的:判斷預(yù)后,指導(dǎo)個B-ALL:多數(shù)表達CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,這些標志的任意組合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等,也可加上某些異常標志如CD13、CD33、CD15即可將ALL細胞與正常骨髓和外周血細胞分開(60~80%)。T-ALL:TDT結(jié)合T細胞表面標志如CD5或CD3,加上cCD3(90%).B-ALL:多數(shù)表達CD34、CD38dim、TDT、CD1AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合,表達TDT、CD13、CD33與散射光及抗原密度,可確定殘留的AML細胞(70~80%)AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合,表達TDLEUKEMIAATDIAGNOSISNORMALDAY290.039%LEUKEMIANORMALDAY290.039%2013.4.21,原始細胞占79.2%2013.5.18,MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD202013.4.21,原始細胞占79.2%2013.5.18,流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件三.成熟淋巴細胞增殖性疾病三.成熟淋巴細胞增殖性疾病慢性淋巴細胞白血病幼稚淋巴細胞白血病毛細胞白血病脾邊緣區(qū)淋巴瘤大顆粒淋巴細胞白血病皮膚T細胞淋巴瘤相關(guān)白血病…………循環(huán)淋巴細胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細胞術(shù)的輔助診斷!慢性淋巴細胞白血病循環(huán)淋巴細胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細正常淋巴細胞淋巴細胞增殖性疾病(克隆擴增)TBNKoror確定克隆來源!正常淋巴細胞淋巴細胞增殖性疾病(克隆擴增)TBNKorB-LPD:B淋巴細胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達;
T/NK-CLPD:由于缺乏單克隆的標記物,通過FCM診斷成為難點。B-LPD:B淋巴細胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達;正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細胞正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細胞CD19+淋巴細胞增多的鑒別診斷DighieroG,HamblinTJ.Lancet,2008,371(March22),1017B-LPD(lymphoproliferativedisease)CD19+淋巴細胞增多的鑒別診斷DighieroG,Ha結(jié)論:CLL/SLL.結(jié)論:CLL/SLL.結(jié)論:慢性B淋巴細胞增殖性疾病,建議進一步FISH檢測t(11;14)以確診MCL.結(jié)論:慢性B淋巴細胞增殖性疾病,建議進一步FISH檢測t(1結(jié)論:免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學和臨床明確診斷。結(jié)論:免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學和臨床明確診斷。流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件1、前驅(qū)T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤(T-ALL/T-LBL)2、母細胞性NK細胞淋巴瘤3、慢性前淋巴細胞白血病/淋巴瘤(T-CLL/T-PLL)4、顆粒淋巴細胞白血?。═-LGL)5、侵襲性NK細胞白血病(ANKCL)6、成人T細胞淋巴瘤/白血?。ˋTCL/L)7、節(jié)外NK/T細胞淋巴瘤,鼻型(NK/TCL)8、腸病型T細胞淋巴瘤(ITCL)9、肝脾γδT細胞淋巴瘤10、皮下脂膜樣T細胞淋巴瘤11、菌樣霉菌病/賽塞里(Sezary)綜合征(MF/SS)12、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細胞,原發(fā)性皮膚型13、周圍T細胞淋巴瘤(PTL)14、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤(AITCL)15、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細胞,原發(fā)性全身型WHO2008成熟T/NK細胞腫瘤淋巴增殖性疾病分類1、前驅(qū)T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤(T-ALL/T-LBL)免疫表型特征免疫表型特征1.光散射信號的異常:FS
1.光散射信號的異常:FS2.抗原丟失75%成熟腫瘤T細胞會丟失正常抗原CD7是最易發(fā)生丟失的抗原CD2和CD5也是經(jīng)常發(fā)生丟失的抗原2.抗原丟失75%成熟腫瘤T細胞會丟失正??乖?.抗原表達異常:如:伴CD10+3.抗原表達異常:如:伴CD10+4.抗原表達強度異常:
4.抗原表達強度異常:正常:CD4/CD8=1.5-2.5:1腫瘤細胞出現(xiàn)CD4或CD8某一個群體的限制性表達模式:
CD4+,CD8-CD4-,CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-
多見5.細胞群體數(shù)量的異常增加以及抗原的限制性表達:正常:CD4/CD8=1.5-2.5:1多見5.細胞群體數(shù)量流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件常見T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)通常CD4+orCD4+CD8+,PB:>55%幼淋細胞杭XX,女/60,結(jié)果:異常淋巴細胞占47.4%,表達CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例47.4%,表型符合T-PLL.常見T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)血管免疫母細胞淋巴瘤(AITCL):CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常見T-CLPD免疫表型血管免疫母細胞淋巴瘤(AITCL):常見T-CLPD免疫表型患者,丁XX,男/59
淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細胞占78%,抗原表達異常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+),提示T-CLPD患者,丁XX,男/59淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細胞占78%外周T細胞淋巴瘤(PTCL)骨髓侵犯:CD4+,多數(shù)CD7-and/orCD5-常見T-CLPD免疫表型外周T細胞淋巴瘤(PTCL)骨髓侵犯:常見T-CLPD免疫表成人T細胞淋巴瘤(ATLL):CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失部分伴有髓系抗原表達:CD13,CD33,CD15
外周血:多形核淋巴細胞確診:HTLV-1基因陽性
常見T-CLPD免疫表型常見T-CLPD免疫表型T-LGLCD4+orCD8+,伴有NK抗原表達CD16+,CD57+,部分CD56+形態(tài)學:大顆粒淋巴細胞常見T-CLPD免疫表型T-LGL常見T-CLPD免疫表型TCRVβ限制性表達1.包含24種抗體,兩種熒光素,識別70%Vβ亞家族;2.在診斷和MRD監(jiān)測中的作用TCRVβ限制性表達流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBecauseTCRisapartofCD3complex,vbetaanalysiscannotbeusedforsurfaceCD3-negativeTcells.STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBe
部分病例運用免疫標記物難以將惡性成熟T淋巴細胞從正常T淋巴細胞中精確鑒別(反應(yīng)性或克隆性)。原因:1.腫瘤細胞被反應(yīng)性T細胞掩蓋
2.CD8+占優(yōu)勢群體還見于:V感染(AIDS,EBV),BMT后
臨床特點對診斷更為重要!臨床特點對診斷更為重要!流式診斷NK細胞淋巴瘤典型:CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-沒有特征性抗體區(qū)分腫瘤和反應(yīng)性NK細胞:數(shù)量以及FSKIR:KIRs、CD94/NKG2;均一性表達KIR同種型
流式診斷NK細胞淋巴瘤典型:CD2+,CD16+,CD56+四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)糖基化磷脂酰肌醇錨(GPI)連接的錨連蛋白缺乏補體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血為特征的獲得性造血干細胞克隆性疾病磷脂酰肌醇聚糖A(PIG-A)基因突變PIG-A基因突變對補體敏感性增高溶血錨連蛋白:補體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59、CD16、CD24、CD14、Flaer等陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)糖基化磷脂酰肌醇錨(GPI樣本收集:優(yōu)先選擇外周血,不推薦骨髓抗凝劑:EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必須在48小時內(nèi)檢測(粒細胞上的抗原表達和散射會隨著時間而改變)CCS指南推薦對>2種細胞系進行檢測
標本類型
抗凝劑標本儲存樣本收集:優(yōu)先選擇外周血,不推薦骨髓CCS指南推薦對>2種細常規(guī)檢測:敏感度1%,獲取5000個目的細胞高敏檢測:敏感度0.01%,獲取250,000個目的細胞中性粒細胞:必做紅細胞:中性粒細胞檢出PNH克隆時必做,或全部標本都做,但單獨檢測不推薦單核細胞:可提供穩(wěn)定的結(jié)果淋巴細胞:不推薦細胞獲取目的細胞常規(guī)檢測:敏感度1%,獲取5000個目的細胞細胞獲取目的細胞抗體的選擇僅檢測CD55/CD59------不推薦敏感性:5-10%(Sutherlandandal,CytometryPartB72B:167-177)Flaer-----組成高特異性的PNHPanel
抗體的選擇僅檢測CD55/CD59------不推薦紅細胞分析:優(yōu)點:與WBC相比,RBC檢測能更好地鑒別II型細胞。缺點:輸血和溶血會造成PNH克隆大小檢測值偏低。
單檢測紅細胞不能充分評估PNHI型:正常紅細胞II型:CD59部分缺失的PNH克隆III型:CD59完全缺失的PNH克隆紅細胞分析:I型:正常紅細胞同個患者的紅細胞和粒細胞檢測結(jié)果粒細胞PNH克?。?4.5%紅細胞PNH克隆:6.1%溶血/輸血對PNH克隆大小的影響同個患者的紅細胞和粒細胞檢測結(jié)果粒細胞PNH克?。?4.5紅細胞分析-----抗體選擇和分析CD59優(yōu)于CD55CD59在紅細胞上的表達水平遠高于CD55
結(jié)果分析:PNH細胞比較多時,適合使用直方圖異常細胞數(shù)少時,適合使用散點圖同一個患者,CD59能區(qū)分出II型和III型細胞,CD55則不能紅細胞PNH克隆很少時,適合散點圖分析紅細胞分析-----抗體選擇和分析CD59優(yōu)于CD55同一個中性粒細胞和單核細胞都可以檢測。不適宜采用淋巴細胞白細胞分析-----
檢測PNH克隆最好的方法
中性粒細胞和單核細胞都可以檢測。白細胞分析-----
CD59—最早用于檢測粒系PNH克隆的標記物FLAER-能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結(jié)合:當前成為最佳標記物CD14是表達在單核細胞上的GPI錨連蛋白,用于檢測單核細胞的PNH克隆。CD24是表達在粒細胞上的GPI錨連蛋白,用于檢測粒細胞的PNH克隆。白細胞分析-----
檢測PNH克隆最好的方法
CD59—最早用于檢測粒系PNH克隆的標記物白細胞分析---什么是FLAER?FLAER(FLuorescentAERolysin),熒光標記的嗜水氣單胞菌溶素,它不是單克隆抗體,而是滅活的細菌蛋白質(zhì),能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結(jié)合。FLAERCD24FLAERCD14什么是FLAER?FLAER(FLuorescentAICCSPNH指南:WBC檢測的組合Colors細胞類型1234563colorGFLAERCD24CD153colorMFLAERCD14CD334colorGFLAERCD24CD15CD454colorMFLAERCD14CD33CD454colorG+MFLAERCD24CD14CD335colorG/MFLAERCD24CD14CD15/CD33CD455colorG+MFLAERCD24CD14CD15CD336colorG+MFLAERCD24CD14CD15CD33CD45Guidelinesforthediagnosisandmonitoringofparoxysmalnocturnalhemoglobinuriaandrelateddisordersbyflowcytometry.BorowitzMJ,CraigFE,DiGiuseppeJA,IllingworthAJ,RosseW,SutherlandDR,WittwerCT,RichardsSJ.CytometryPartB2010ICCSPNH指南:WBC檢測的組合Colors細胞123粒細胞PNH克隆大小89.5%單核細胞PNH克隆大小87.2%1例患者的粒和單核細胞FLAER散點圖粒細胞PNH克隆大小89.5%五.多發(fā)性骨髓瘤
漿細胞為CD138+CD38+,通常使用CD138和/或CD38設(shè)門,另外,正常漿細胞的表面標記為CD19+CD56-,而多發(fā)性骨髓瘤細胞通常為CD19-CD56+、cIg克隆性表達。五.多發(fā)性骨髓瘤漿細胞為CD138+CD38+,通常使用1例多發(fā)性骨髓瘤免疫表型1例多發(fā)性骨髓瘤免疫表型1例PB采集物CD34計數(shù)(ISHAGE方案)6.造血干細胞CD34檢測---
血液病治療及移植國際聯(lián)合會(ISHAGE方案)1例PB采集物CD34計數(shù)(ISHAGE方案)6.造血干細胞1.流式在血液病的診斷及MRD監(jiān)測中具有高度敏感性和特異性;2.強調(diào)多個群體分析的重要性;3.流式應(yīng)以臨床為基礎(chǔ),與病理、形態(tài)、遺傳學、分子生物學等診斷技術(shù)相互補充,綜合分析??偨Y(jié)與展望1.流式在血液病的診斷及MRD監(jiān)測中具有高度敏感性和特異性;謝謝!謝謝!流式細胞學在血液病中的臨床應(yīng)用(基礎(chǔ)篇)吳雨潔江蘇省人民醫(yī)院2014.10.29網(wǎng)絡(luò)課堂
流式細胞學在血液病中的臨床流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)是一項集激光技術(shù)、流體力學技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技技術(shù)??焖佟蚀_、客觀,多參數(shù),可同時對特定群體加以分選。研究對象為生物顆粒,如各種細胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征,并加以定量。
是當代最先進的細胞定量分析技術(shù)
流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)是一項集激光技術(shù)、流體力學技術(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型微量殘留白血病細胞檢查陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿多發(fā)性骨髓瘤干細胞計數(shù)腫瘤細胞的周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞和網(wǎng)織血小板計數(shù)免疫狀態(tài)監(jiān)測血小板功能及相關(guān)疾病HLA-B27流式細胞儀的臨床應(yīng)用白血病和淋巴瘤的免疫分型流式細胞儀的臨床應(yīng)用標本來源:外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細胞、脫落細胞及其他血清或各類體液樣本。肝素抗凝的外周血和骨髓標本,存放時限為48~72小時;EDTA抗凝標本,存放時限只有12~24小時,因為髓細胞在此條件下會裂解;標本來源:直方圖散點圖二維等高圖密度圖常見的幾種流式細胞圖直方圖散點圖二維等高圖密度圖常見的幾種流式細胞圖設(shè)門淋巴細胞亞群設(shè)門淋巴細胞亞群一:白血病免疫分型一:白血病免疫分型白血病診斷依賴于多種檢測方法樣本形態(tài)學流式細胞術(shù)細胞遺傳學/FISH分子生物學
基礎(chǔ)和金標準
必需
重要白血病診斷依賴于多種檢測方法樣本形態(tài)學流式細胞術(shù)細胞遺傳學/急性白血病免疫分型的價值區(qū)分淋系、髓系白血病區(qū)分淋系白血病中的T、B-ALL鑒定混合細胞性白血病的類型:
T-M、B-M、T-B、T-B-M治療過程中監(jiān)測MRD,評價療效提示某些遺傳學異常:CD19+AML---t(8;21);CD13+CD33+B-ALL---t(9;22)提示預(yù)后:CD56等陽性的AML患者預(yù)后不良CD15陽性的AML患者CR率高
急性白血病免疫分型的價值區(qū)分淋系、髓系白血病正常造血細胞各系列抗原表達的演進不管是在胚胎期、老年期、還是化療以后,正常造血細胞抗原組合的表達模式都不改變。正常造血細胞各系列抗原表達的演進不管是在胚胎期白血病細胞表面抗原異常表達造血細胞抗原組合的表達模型能夠用于鑒別惡性克隆!白血病克隆與正常細胞之間抗原表達不同---白血病相關(guān)的免疫表型(LAIP)白血病細胞表面抗原異常表達造血細胞抗原組合的表達模型能正常造血細胞白血病細胞抗原表達遵循系列保守性出現(xiàn)抗原跨系表達髓系:CD33+,T系:CD7+髓系:CD33+CD7+抗原表達有一定的時序性出現(xiàn)抗原時序混亂表達原始細胞:CD34+CD15- 原始細胞:CD34+CD15+各階段細胞按一定的比例分布出現(xiàn)分化阻滯原幼細胞<5%原幼細胞>20%
抗原表達的缺失抗原強度的異常
正常造血細胞白需要掌握正常造血細胞的抗原表達規(guī)律不同系列的細胞表達的抗原?同一系列不同階段的細胞表達的抗原?每種抗原的表達強度?需要掌握正常造血細胞的抗原表達規(guī)律免疫分型常用的抗體干祖細胞
CD34、TDT、CD117、
CD38、HLA-DR、AMLCD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO懷疑M6加做CD71、GPA懷疑M7加做CD61、CD41、CD42B-ALLCD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79aT-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3NK細胞CD16、CD56、CD57漿細胞CD38、CD138、cκ、cλ、CD19、CD56免疫分型常用的抗體干祖細胞根據(jù)骨髓細胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門圈定各類細胞R1門為成熟淋巴細胞R2門為正常單核細胞位置R3門正常粒細胞位置R4門為幼稚淋巴細胞出現(xiàn)位置R5門為有核紅細胞或細胞碎片位置R6門為幼稚髓細胞出現(xiàn)位置白血病細胞通常會在R4R6兩門位置處出現(xiàn)正常成人骨髓樣本----CD45設(shè)門根據(jù)骨髓細胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門圈定各類細胞正AML-M1AML-M1AML-M2AML-M2AML-M3AML-M3結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學和形態(tài)學診斷M3。
結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學和形態(tài)學診斷M3。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M4。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M4。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M5。結(jié)論:ANLL,伴單核細胞分化,免疫表型符合M5。結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合形態(tài)學以確診M6。
結(jié)論:ANLL,建議結(jié)合形態(tài)學以確診M6。AML-M7AML-M7B-ALLB-ALLT-ALLT-ALLEGILScoringSystemForBAL(>2points)ScoreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/64EGILScoringSystemForBAL(>2RequirementsforassigningmorethanonelineagetoasingleblastpopulationMyeloidlineageMyeloperoxidase(flowcytometry,immunohistochemistryorcytochemistry)orMonocyticdifferentiation(atleast2ofthefollowing:NSE,CD11c,CD14,CD64,)TlineageCytoplasmicCD3(flowcytometrywithantibodiestoCD3epsilonchain;immunohistochemistryusingpolyclonalanti-CD3antibodyzetachain,whichisnotT-cellspecific)orSurfaceCD3(rareinmixedphenotypeacuteleukemia)BlineageStrongCD19withatleast1ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10orWeakCD19withatleast2ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10MPAL(mixedphenotypeacuteleukemia)
WHO2008RequirementsforassigningmorCD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineageALL)B-negative,CD64+CD14+/-CD33+(MonocyticLeukemia)TwoLeukemicPopulationsMonoblastsLymphoblasts結(jié)論:急性混合細胞白血病(AM-LL)CD19+CD22+B-negative,CD64+Two二.白血病微小殘留病灶
(MRD)目的:判斷預(yù)后,指導(dǎo)個體化分層治療,預(yù)測復(fù)發(fā)二.白血病微小殘留病灶
(MRD)目的:判斷預(yù)后,指導(dǎo)個B-ALL:多數(shù)表達CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,這些標志的任意組合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等,也可加上某些異常標志如CD13、CD33、CD15即可將ALL細胞與正常骨髓和外周血細胞分開(60~80%)。T-ALL:TDT結(jié)合T細胞表面標志如CD5或CD3,加上cCD3(90%).B-ALL:多數(shù)表達CD34、CD38dim、TDT、CD1AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合,表達TDT、CD13、CD33與散射光及抗原密度,可確定殘留的AML細胞(70~80%)AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合,表達TDLEUKEMIAATDIAGNOSISNORMALDAY290.039%LEUKEMIANORMALDAY290.039%2013.4.21,原始細胞占79.2%2013.5.18,MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD202013.4.21,原始細胞占79.2%2013.5.18,流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件三.成熟淋巴細胞增殖性疾病三.成熟淋巴細胞增殖性疾病慢性淋巴細胞白血病幼稚淋巴細胞白血病毛細胞白血病脾邊緣區(qū)淋巴瘤大顆粒淋巴細胞白血病皮膚T細胞淋巴瘤相關(guān)白血病…………循環(huán)淋巴細胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細胞術(shù)的輔助診斷!慢性淋巴細胞白血病循環(huán)淋巴細胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細正常淋巴細胞淋巴細胞增殖性疾病(克隆擴增)TBNKoror確定克隆來源!正常淋巴細胞淋巴細胞增殖性疾病(克隆擴增)TBNKorB-LPD:B淋巴細胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達;
T/NK-CLPD:由于缺乏單克隆的標記物,通過FCM診斷成為難點。B-LPD:B淋巴細胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達;正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細胞正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細胞CD19+淋巴細胞增多的鑒別診斷DighieroG,HamblinTJ.Lancet,2008,371(March22),1017B-LPD(lymphoproliferativedisease)CD19+淋巴細胞增多的鑒別診斷DighieroG,Ha結(jié)論:CLL/SLL.結(jié)論:CLL/SLL.結(jié)論:慢性B淋巴細胞增殖性疾病,建議進一步FISH檢測t(11;14)以確診MCL.結(jié)論:慢性B淋巴細胞增殖性疾病,建議進一步FISH檢測t(1結(jié)論:免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學和臨床明確診斷。結(jié)論:免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學和臨床明確診斷。流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件1、前驅(qū)T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤(T-ALL/T-LBL)2、母細胞性NK細胞淋巴瘤3、慢性前淋巴細胞白血病/淋巴瘤(T-CLL/T-PLL)4、顆粒淋巴細胞白血病(T-LGL)5、侵襲性NK細胞白血?。ˋNKCL)6、成人T細胞淋巴瘤/白血?。ˋTCL/L)7、節(jié)外NK/T細胞淋巴瘤,鼻型(NK/TCL)8、腸病型T細胞淋巴瘤(ITCL)9、肝脾γδT細胞淋巴瘤10、皮下脂膜樣T細胞淋巴瘤11、菌樣霉菌病/賽塞里(Sezary)綜合征(MF/SS)12、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細胞,原發(fā)性皮膚型13、周圍T細胞淋巴瘤(PTL)14、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤(AITCL)15、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細胞,原發(fā)性全身型WHO2008成熟T/NK細胞腫瘤淋巴增殖性疾病分類1、前驅(qū)T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤(T-ALL/T-LBL)免疫表型特征免疫表型特征1.光散射信號的異常:FS
1.光散射信號的異常:FS2.抗原丟失75%成熟腫瘤T細胞會丟失正??乖瑿D7是最易發(fā)生丟失的抗原CD2和CD5也是經(jīng)常發(fā)生丟失的抗原2.抗原丟失75%成熟腫瘤T細胞會丟失正??乖?.抗原表達異常:如:伴CD10+3.抗原表達異常:如:伴CD10+4.抗原表達強度異常:
4.抗原表達強度異常:正常:CD4/CD8=1.5-2.5:1腫瘤細胞出現(xiàn)CD4或CD8某一個群體的限制性表達模式:
CD4+,CD8-CD4-,CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-
多見5.細胞群體數(shù)量的異常增加以及抗原的限制性表達:正常:CD4/CD8=1.5-2.5:1多見5.細胞群體數(shù)量流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件常見T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)通常CD4+orCD4+CD8+,PB:>55%幼淋細胞杭XX,女/60,結(jié)果:異常淋巴細胞占47.4%,表達CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例47.4%,表型符合T-PLL.常見T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL)血管免疫母細胞淋巴瘤(AITCL):CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常見T-CLPD免疫表型血管免疫母細胞淋巴瘤(AITCL):常見T-CLPD免疫表型患者,丁XX,男/59
淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細胞占78%,抗原表達異常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+),提示T-CLPD患者,丁XX,男/59淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細胞占78%外周T細胞淋巴瘤(PTCL)骨髓侵犯:CD4+,多數(shù)CD7-and/orCD5-常見T-CLPD免疫表型外周T細胞淋巴瘤(PTCL)骨髓侵犯:常見T-CLPD免疫表成人T細胞淋巴瘤(ATLL):CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失部分伴有髓系抗原表達:CD13,CD33,CD15
外周血:多形核淋巴細胞確診:HTLV-1基因陽性
常見T-CLPD免疫表型常見T-CLPD免疫表型T-LGLCD4+orCD8+,伴有NK抗原表達CD16+,CD57+,部分CD56+形態(tài)學:大顆粒淋巴細胞常見T-CLPD免疫表型T-LGL常見T-CLPD免疫表型TCRVβ限制性表達1.包含24種抗體,兩種熒光素,識別70%Vβ亞家族;2.在診斷和MRD監(jiān)測中的作用TCRVβ限制性表達流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件流式細胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBecauseTCRisapartofCD3complex,vbetaanalysiscannotbeusedforsurfaceCD3-negativeTcells.STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBe
部分病例運用免疫標記物難以將惡性成熟T淋巴細胞從正常T淋巴細胞中精確鑒別(反應(yīng)性或克隆性)。原因:1.腫瘤細胞被反應(yīng)性T細胞掩蓋
2.CD8+占優(yōu)勢群體還見于:V感染(AIDS,EBV),BMT后
臨床特點對診斷更為重要!臨床特點對診斷更為重要!流式診斷NK細胞淋巴瘤典型:CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-沒有特征性抗體區(qū)分腫瘤和反應(yīng)性NK細胞:數(shù)量以及FSKIR:KIRs、CD94/NKG2;均一性表達KIR同種型
流式診斷NK細胞淋巴瘤典型:CD2+,CD16+,CD56+四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)糖基化磷脂酰肌醇錨(GPI)連接的錨連蛋白缺乏補體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血為特征的獲得性造血干細胞克隆性疾病磷脂酰肌醇聚糖A(PIG-A)基因突變PIG-A基因突變對補體敏感性增高溶血錨連蛋白:補體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59、CD16、CD24、CD14、Flaer等陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)糖基化磷脂酰肌醇錨(GPI樣本收集:優(yōu)先選擇外周血,不推薦骨髓抗凝劑:EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必須在48小時內(nèi)檢測(粒細胞上的抗原表達和散射會隨著時間而改變)CCS指南推薦對>2種細胞系進行檢測
標本類型
抗凝劑標本儲存樣本收集:優(yōu)先選擇外周血,不推薦骨髓CCS指南推薦對>2種細常規(guī)檢測:敏感度1%,獲取5000個目的細胞高敏檢測:敏感度0.01%,獲取250,000個目的細胞中性粒細胞:必做紅細胞:中性粒細胞檢出PNH克隆時必做,或全部標本都做,但單獨檢測不推薦單核細胞:可提供穩(wěn)定的結(jié)果淋巴細胞:不推薦細胞獲取目的細胞常規(guī)檢測:敏感度1%,獲取5000個目的細胞細胞獲取目的細胞抗體的選擇僅檢測CD55/CD59------不推薦敏感性:5-10%(Sutherlandandal,CytometryPartB72B:167-177)Flaer-----組成高特異性的PNHPanel
抗體的選擇僅檢測CD55/CD59------不推薦紅細胞
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