流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件

流式細(xì)胞學(xué)在血液病中的臨床應(yīng)用（基礎(chǔ)篇）吳雨潔江蘇省人民醫(yī)院2014.10.29網(wǎng)絡(luò)課堂

流式細(xì)胞學(xué)在血液病中的臨床流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)集激光技術(shù)、流體力學(xué)技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技技術(shù)。快速、準(zhǔn)確、客觀，多參數(shù)，可同時(shí)對(duì)特定群體加以分選。研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。

是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)集激光技術(shù)、流體力學(xué)技術(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型微量殘留白血病細(xì)胞檢查陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)血小板功能及相關(guān)疾病HLA-B27流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用白血病和淋巴瘤的免疫分型流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用標(biāo)本來(lái)源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他血清或各類體液樣本。肝素抗凝的外周血和骨髓標(biāo)本，存放時(shí)限為48～72小時(shí)；EDTA抗凝標(biāo)本，存放時(shí)限只有12～24小時(shí)，因?yàn)樗杓?xì)胞在此條件下會(huì)裂解；標(biāo)本來(lái)源：直方圖散點(diǎn)圖二維等高圖密度圖常見(jiàn)的幾種流式細(xì)胞圖直方圖散點(diǎn)圖二維等高圖密度圖常見(jiàn)的幾種流式細(xì)胞圖設(shè)門(mén)淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門(mén)淋巴細(xì)胞亞群一：白血病免疫分型一：白血病免疫分型白血病診斷依賴于多種檢測(cè)方法樣本形態(tài)學(xué)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)/FISH分子生物學(xué)

基礎(chǔ)和金標(biāo)準(zhǔn)

必需

重要白血病診斷依賴于多種檢測(cè)方法樣本形態(tài)學(xué)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)/急性白血病免疫分型的價(jià)值區(qū)分淋系、髓系白血病區(qū)分淋系白血病中的T、B-ALL鑒定混合細(xì)胞性白血病的類型：

T-M、B-M、T-B、T-B-M治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)MRD，評(píng)價(jià)療效提示某些遺傳學(xué)異常：CD19+AML---t(8;21)；CD13+CD33+B-ALL---t(9;22)提示預(yù)后：CD56等陽(yáng)性的AML患者預(yù)后不良CD15陽(yáng)性的AML患者CR率高

急性白血病免疫分型的價(jià)值區(qū)分淋系、髓系白血病正常造血細(xì)胞各系列抗原表達(dá)的演進(jìn)不管是在胚胎期、老年期、還是化療以后，正常造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模式都不改變。正常造血細(xì)胞各系列抗原表達(dá)的演進(jìn)不管是在胚胎期白血病細(xì)胞表面抗原異常表達(dá)造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模型能夠用于鑒別惡性克隆!白血病克隆與正常細(xì)胞之間抗原表達(dá)不同---白血病相關(guān)的免疫表型（LAIP）白血病細(xì)胞表面抗原異常表達(dá)造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模型能正常造血細(xì)胞白血病細(xì)胞抗原表達(dá)遵循系列保守性出現(xiàn)抗原跨系表達(dá)髓系:CD33+,T系:CD7+髓系:CD33+CD7+抗原表達(dá)有一定的時(shí)序性出現(xiàn)抗原時(shí)序混亂表達(dá)原始細(xì)胞:CD34+CD15- 原始細(xì)胞:CD34+CD15+各階段細(xì)胞按一定的比例分布出現(xiàn)分化阻滯原幼細(xì)胞<5%原幼細(xì)胞>20%

抗原表達(dá)的缺失抗原強(qiáng)度的異常

正常造血細(xì)胞白需要掌握正常造血細(xì)胞的抗原表達(dá)規(guī)律不同系列的細(xì)胞表達(dá)的抗原？同一系列不同階段的細(xì)胞表達(dá)的抗原？每種抗原的表達(dá)強(qiáng)度？需要掌握正常造血細(xì)胞的抗原表達(dá)規(guī)律免疫分型常用的抗體干祖細(xì)胞

CD34、TDT、CD117、

CD38、HLA-DR、AMLCD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO懷疑M6加做CD71、GPA懷疑M7加做CD61、CD41、CD42B-ALLCD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79aT-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3NK細(xì)胞CD16、CD56、CD57漿細(xì)胞CD38、CD138、cκ、cλ、CD19、CD56免疫分型常用的抗體干祖細(xì)胞根據(jù)骨髓細(xì)胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門(mén)圈定各類細(xì)胞R1門(mén)為成熟淋巴細(xì)胞R2門(mén)為正常單核細(xì)胞位置R3門(mén)正常粒細(xì)胞位置R4門(mén)為幼稚淋巴細(xì)胞出現(xiàn)位置R5門(mén)為有核紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片位置R6門(mén)為幼稚髓細(xì)胞出現(xiàn)位置白血病細(xì)胞通常會(huì)在R4R6兩門(mén)位置處出現(xiàn)正常成人骨髓樣本----CD45設(shè)門(mén)根據(jù)骨髓細(xì)胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門(mén)圈定各類細(xì)胞正AML-M1AML-M1AML-M2AML-M2AML-M3AML-M3結(jié)論：ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)診斷M3。

結(jié)論：ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)診斷M3。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M4。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M4。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M5。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M5。結(jié)論：ANLL，建議結(jié)合形態(tài)學(xué)以確診M6。

結(jié)論：ANLL，建議結(jié)合形態(tài)學(xué)以確診M6。AML-M7AML-M7B-ALLB-ALLT-ALLT-ALLEGILScoringSystemForBAL(>2points)ScoreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/64EGILScoringSystemForBAL(>2RequirementsforassigningmorethanonelineagetoasingleblastpopulationMyeloidlineageMyeloperoxidase(flowcytometry,immunohistochemistryorcytochemistry)orMonocyticdifferentiation(atleast2ofthefollowing:NSE,CD11c,CD14,CD64,)TlineageCytoplasmicCD3(flowcytometrywithantibodiestoCD3epsilonchain;immunohistochemistryusingpolyclonalanti-CD3antibodyzetachain,whichisnotT-cellspecific)orSurfaceCD3(rareinmixedphenotypeacuteleukemia)BlineageStrongCD19withatleast1ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10orWeakCD19withatleast2ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10MPAL(mixedphenotypeacuteleukemia)

WHO2008RequirementsforassigningmorCD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineageALL)B-negative,CD64+CD14+/-CD33+(MonocyticLeukemia)TwoLeukemicPopulationsMonoblastsLymphoblasts結(jié)論：急性混合細(xì)胞白血病(AM-LL)CD19+CD22+B-negative,CD64+Two二.白血病微小殘留病灶

（MRD）目的：判斷預(yù)后，指導(dǎo)個(gè)體化分層治療，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)二.白血病微小殘留病灶

（MRD）目的：判斷預(yù)后，指導(dǎo)個(gè)B-ALL:多數(shù)表達(dá)CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,這些標(biāo)志的任意組合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等，也可加上某些異常標(biāo)志如CD13、CD33、CD15即可將ALL細(xì)胞與正常骨髓和外周血細(xì)胞分開(kāi)（60～80%）。T-ALL:TDT結(jié)合T細(xì)胞表面標(biāo)志如CD5或CD3，加上cCD3(90%).B-ALL:多數(shù)表達(dá)CD34、CD38dim、TDT、CD1AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合，表達(dá)TDT、CD13、CD33與散射光及抗原密度，可確定殘留的AML細(xì)胞（70～80%）AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合，表達(dá)TDLEUKEMIAATDIAGNOSISNORMALDAY290.039%LEUKEMIANORMALDAY290.039%2013.4.21,原始細(xì)胞占79.2%2013.5.18，MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD202013.4.21,原始細(xì)胞占79.2%2013.5.18，流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件三.成熟淋巴細(xì)胞增殖性疾病三.成熟淋巴細(xì)胞增殖性疾病慢性淋巴細(xì)胞白血病幼稚淋巴細(xì)胞白血病毛細(xì)胞白血病脾邊緣區(qū)淋巴瘤大顆粒淋巴細(xì)胞白血病皮膚T細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)白血病…………循環(huán)淋巴細(xì)胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細(xì)胞術(shù)的輔助診斷！慢性淋巴細(xì)胞白血病循環(huán)淋巴細(xì)胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細(xì)正常淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖性疾病(克隆擴(kuò)增)TBNKoror確定克隆來(lái)源！正常淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖性疾病(克隆擴(kuò)增)TBNKorB-LPD:B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達(dá)；

T/NK-CLPD:由于缺乏單克隆的標(biāo)記物，通過(guò)FCM診斷成為難點(diǎn)。B-LPD:B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達(dá)；正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細(xì)胞正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細(xì)胞CD19+淋巴細(xì)胞增多的鑒別診斷DighieroG,HamblinTJ.Lancet,2008,371(March22),1017B-LPD(lymphoproliferativedisease)CD19+淋巴細(xì)胞增多的鑒別診斷DighieroG,Ha結(jié)論：CLL/SLL.結(jié)論：CLL/SLL.結(jié)論：慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病，建議進(jìn)一步FISH檢測(cè)t(11;14)以確診MCL.結(jié)論：慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病，建議進(jìn)一步FISH檢測(cè)t(1結(jié)論：免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學(xué)和臨床明確診斷。結(jié)論：免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學(xué)和臨床明確診斷。流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件1、前驅(qū)T淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤（T-ALL/T-LBL）2、母細(xì)胞性NK細(xì)胞淋巴瘤3、慢性前淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤（T-CLL/T-PLL）4、顆粒淋巴細(xì)胞白血病（T-LGL）5、侵襲性NK細(xì)胞白血病（ANKCL）6、成人T細(xì)胞淋巴瘤/白血病（ATCL/L）7、節(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）8、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤（ITCL）9、肝脾γδT細(xì)胞淋巴瘤10、皮下脂膜樣T細(xì)胞淋巴瘤11、菌樣霉菌病/賽塞里(Sezary)綜合征(MF/SS)12、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細(xì)胞,原發(fā)性皮膚型13、周?chē)鶷細(xì)胞淋巴瘤(PTL)14、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(AITCL)15、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細(xì)胞,原發(fā)性全身型WHO2008成熟T/NK細(xì)胞腫瘤淋巴增殖性疾病分類1、前驅(qū)T淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤（T-ALL/T-LBL）免疫表型特征免疫表型特征1.光散射信號(hào)的異常：FS

1.光散射信號(hào)的異常：FS2.抗原丟失75％成熟腫瘤T細(xì)胞會(huì)丟失正?？乖瑿D7是最易發(fā)生丟失的抗原CD2和CD5也是經(jīng)常發(fā)生丟失的抗原2.抗原丟失75％成熟腫瘤T細(xì)胞會(huì)丟失正?？乖?.抗原表達(dá)異常：如：伴CD10＋3.抗原表達(dá)異常：如：伴CD10＋4.抗原表達(dá)強(qiáng)度異常：

4.抗原表達(dá)強(qiáng)度異常：正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)CD4或CD8某一個(gè)群體的限制性表達(dá)模式：

CD4+,CD8-CD4-,CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-

多見(jiàn)5.細(xì)胞群體數(shù)量的異常增加以及抗原的限制性表達(dá)：正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1多見(jiàn)5.細(xì)胞群體數(shù)量流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL）通常CD4+orCD4+CD8+,PB:>55%幼淋細(xì)胞杭XX,女/60,結(jié)果：異常淋巴細(xì)胞占47.4%，表達(dá)CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例47.4%，表型符合T-PLL.常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL）血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤(AITCL):CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常見(jiàn)T-CLPD免疫表型血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤(AITCL):常見(jiàn)T-CLPD免疫表型患者，丁XX,男/59

淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細(xì)胞占78%,抗原表達(dá)異常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+),提示T-CLPD患者，丁XX,男/59淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細(xì)胞占78%外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）骨髓侵犯:CD4+,多數(shù)CD7-and/orCD5-常見(jiàn)T-CLPD免疫表型外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）骨髓侵犯:常見(jiàn)T-CLPD免疫表成人T細(xì)胞淋巴瘤（ATLL）:CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失部分伴有髓系抗原表達(dá)：CD13，CD33，CD15

外周血：多形核淋巴細(xì)胞確診：HTLV-1基因陽(yáng)性

常見(jiàn)T-CLPD免疫表型常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-LGLCD4+orCD8+，伴有NK抗原表達(dá)CD16+，CD57+，部分CD56+形態(tài)學(xué)：大顆粒淋巴細(xì)胞常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-LGL常見(jiàn)T-CLPD免疫表型TCRVβ限制性表達(dá)1.包含24種抗體，兩種熒光素，識(shí)別70％Vβ亞家族；2.在診斷和MRD監(jiān)測(cè)中的作用TCRVβ限制性表達(dá)流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBecauseTCRisapartofCD3complex,vbetaanalysiscannotbeusedforsurfaceCD3-negativeTcells.STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBe

部分病例運(yùn)用免疫標(biāo)記物難以將惡性成熟T淋巴細(xì)胞從正常T淋巴細(xì)胞中精確鑒別(反應(yīng)性或克隆性)。原因：1.腫瘤細(xì)胞被反應(yīng)性T細(xì)胞掩蓋

2.CD8+占優(yōu)勢(shì)群體還見(jiàn)于：V感染(AIDS,EBV)，BMT后

臨床特點(diǎn)對(duì)診斷更為重要！臨床特點(diǎn)對(duì)診斷更為重要！流式診斷NK細(xì)胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-沒(méi)有特征性抗體區(qū)分腫瘤和反應(yīng)性NK細(xì)胞：數(shù)量以及FSKIR：KIRs、CD94/NKG2；均一性表達(dá)KIR同種型

流式診斷NK細(xì)胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）糖基化磷脂酰肌醇錨（GPI）連接的錨連蛋白缺乏補(bǔ)體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血為特征的獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病磷脂酰肌醇聚糖A(PIG－A)基因突變PIG－A基因突變對(duì)補(bǔ)體敏感性增高溶血錨連蛋白：補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59、CD16、CD24、CD14、Flaer等陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）糖基化磷脂酰肌醇錨（GPI樣本收集：優(yōu)先選擇外周血，不推薦骨髓抗凝劑:EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必須在48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)（粒細(xì)胞上的抗原表達(dá)和散射會(huì)隨著時(shí)間而改變）CCS指南推薦對(duì)>2種細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)

標(biāo)本類型

抗凝劑標(biāo)本儲(chǔ)存樣本收集：優(yōu)先選擇外周血，不推薦骨髓CCS指南推薦對(duì)>2種細(xì)常規(guī)檢測(cè)：敏感度1%，獲取5000個(gè)目的細(xì)胞高敏檢測(cè)：敏感度0.01%，獲取250，000個(gè)目的細(xì)胞中性粒細(xì)胞：必做紅細(xì)胞：中性粒細(xì)胞檢出PNH克隆時(shí)必做，或全部標(biāo)本都做，但單獨(dú)檢測(cè)不推薦單核細(xì)胞：可提供穩(wěn)定的結(jié)果淋巴細(xì)胞：不推薦細(xì)胞獲取目的細(xì)胞常規(guī)檢測(cè)：敏感度1%，獲取5000個(gè)目的細(xì)胞細(xì)胞獲取目的細(xì)胞抗體的選擇僅檢測(cè)CD55/CD59------不推薦敏感性：5-10%(Sutherlandandal,CytometryPartB72B:167-177)Flaer-----組成高特異性的PNHPanel

抗體的選擇僅檢測(cè)CD55/CD59------不推薦紅細(xì)胞分析：優(yōu)點(diǎn)：與WBC相比，RBC檢測(cè)能更好地鑒別II型細(xì)胞。缺點(diǎn)：輸血和溶血會(huì)造成PNH克隆大小檢測(cè)值偏低。

單檢測(cè)紅細(xì)胞不能充分評(píng)估PNHI型：正常紅細(xì)胞II型：CD59部分缺失的PNH克隆III型：CD59完全缺失的PNH克隆紅細(xì)胞分析：I型：正常紅細(xì)胞同個(gè)患者的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果粒細(xì)胞PNH克隆：54.5%紅細(xì)胞PNH克?。?.1%溶血/輸血對(duì)PNH克隆大小的影響同個(gè)患者的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果粒細(xì)胞PNH克隆：54.5紅細(xì)胞分析-----抗體選擇和分析CD59優(yōu)于CD55CD59在紅細(xì)胞上的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于CD55

結(jié)果分析：PNH細(xì)胞比較多時(shí)，適合使用直方圖異常細(xì)胞數(shù)少時(shí)，適合使用散點(diǎn)圖同一個(gè)患者，CD59能區(qū)分出II型和III型細(xì)胞，CD55則不能紅細(xì)胞PNH克隆很少時(shí)，適合散點(diǎn)圖分析紅細(xì)胞分析-----抗體選擇和分析CD59優(yōu)于CD55同一個(gè)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞都可以檢測(cè)。不適宜采用淋巴細(xì)胞白細(xì)胞分析-----

檢測(cè)PNH克隆最好的方法

中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞都可以檢測(cè)。白細(xì)胞分析-----

CD59—最早用于檢測(cè)粒系PNH克隆的標(biāo)記物FLAER-能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結(jié)合：當(dāng)前成為最佳標(biāo)記物CD14是表達(dá)在單核細(xì)胞上的GPI錨連蛋白，用于檢測(cè)單核細(xì)胞的PNH克隆。CD24是表達(dá)在粒細(xì)胞上的GPI錨連蛋白，用于檢測(cè)粒細(xì)胞的PNH克隆。白細(xì)胞分析-----

檢測(cè)PNH克隆最好的方法

CD59—最早用于檢測(cè)粒系PNH克隆的標(biāo)記物白細(xì)胞分析---什么是FLAER?FLAER(FLuorescentAERolysin），熒光標(biāo)記的嗜水氣單胞菌溶素，它不是單克隆抗體，而是滅活的細(xì)菌蛋白質(zhì)，能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結(jié)合。FLAERCD24FLAERCD14什么是FLAER?FLAER(FLuorescentAICCSPNH指南:WBC檢測(cè)的組合Colors細(xì)胞類型1234563colorGFLAERCD24CD153colorMFLAERCD14CD334colorGFLAERCD24CD15CD454colorMFLAERCD14CD33CD454colorG+MFLAERCD24CD14CD335colorG/MFLAERCD24CD14CD15/CD33CD455colorG+MFLAERCD24CD14CD15CD336colorG+MFLAERCD24CD14CD15CD33CD45Guidelinesforthediagnosisandmonitoringofparoxysmalnocturnalhemoglobinuriaandrelateddisordersbyflowcytometry.BorowitzMJ,CraigFE,DiGiuseppeJA,IllingworthAJ,RosseW,SutherlandDR,WittwerCT,RichardsSJ.CytometryPartB2010ICCSPNH指南:WBC檢測(cè)的組合Colors細(xì)胞123粒細(xì)胞PNH克隆大小89.5%單核細(xì)胞PNH克隆大小87.2%1例患者的粒和單核細(xì)胞FLAER散點(diǎn)圖粒細(xì)胞PNH克隆大小89.5%五.多發(fā)性骨髓瘤

漿細(xì)胞為CD138+CD38+，通常使用CD138和／或CD38設(shè)門(mén)，另外，正常漿細(xì)胞的表面標(biāo)記為CD19+CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞通常為CD19-CD56+、cIg克隆性表達(dá)。五.多發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞為CD138+CD38+，通常使用1例多發(fā)性骨髓瘤免疫表型1例多發(fā)性骨髓瘤免疫表型1例PB采集物CD34計(jì)數(shù)（ISHAGE方案）6.造血干細(xì)胞CD34檢測(cè)---

血液病治療及移植國(guó)際聯(lián)合會(huì)(ISHAGE方案)1例PB采集物CD34計(jì)數(shù)（ISHAGE方案）6.造血干細(xì)胞1.流式在血液病的診斷及MRD監(jiān)測(cè)中具有高度敏感性和特異性;2.強(qiáng)調(diào)多個(gè)群體分析的重要性；3.流式應(yīng)以臨床為基礎(chǔ)，與病理、形態(tài)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等診斷技術(shù)相互補(bǔ)充，綜合分析?？偨Y(jié)與展望1.流式在血液病的診斷及MRD監(jiān)測(cè)中具有高度敏感性和特異性;謝謝！謝謝！流式細(xì)胞學(xué)在血液病中的臨床應(yīng)用（基礎(chǔ)篇）吳雨潔江蘇省人民醫(yī)院2014.10.29網(wǎng)絡(luò)課堂

流式細(xì)胞學(xué)在血液病中的臨床流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)集激光技術(shù)、流體力學(xué)技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技技術(shù)。快速、準(zhǔn)確、客觀，多參數(shù)，可同時(shí)對(duì)特定群體加以分選。研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。

是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)集激光技術(shù)、流體力學(xué)技術(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型微量殘留白血病細(xì)胞檢查陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)血小板功能及相關(guān)疾病HLA-B27流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用白血病和淋巴瘤的免疫分型流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用標(biāo)本來(lái)源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他血清或各類體液樣本。肝素抗凝的外周血和骨髓標(biāo)本，存放時(shí)限為48～72小時(shí)；EDTA抗凝標(biāo)本，存放時(shí)限只有12～24小時(shí)，因?yàn)樗杓?xì)胞在此條件下會(huì)裂解；標(biāo)本來(lái)源：直方圖散點(diǎn)圖二維等高圖密度圖常見(jiàn)的幾種流式細(xì)胞圖直方圖散點(diǎn)圖二維等高圖密度圖常見(jiàn)的幾種流式細(xì)胞圖設(shè)門(mén)淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門(mén)淋巴細(xì)胞亞群一：白血病免疫分型一：白血病免疫分型白血病診斷依賴于多種檢測(cè)方法樣本形態(tài)學(xué)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)/FISH分子生物學(xué)

基礎(chǔ)和金標(biāo)準(zhǔn)

必需

重要白血病診斷依賴于多種檢測(cè)方法樣本形態(tài)學(xué)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)/急性白血病免疫分型的價(jià)值區(qū)分淋系、髓系白血病區(qū)分淋系白血病中的T、B-ALL鑒定混合細(xì)胞性白血病的類型：

T-M、B-M、T-B、T-B-M治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)MRD，評(píng)價(jià)療效提示某些遺傳學(xué)異常：CD19+AML---t(8;21)；CD13+CD33+B-ALL---t(9;22)提示預(yù)后：CD56等陽(yáng)性的AML患者預(yù)后不良CD15陽(yáng)性的AML患者CR率高

急性白血病免疫分型的價(jià)值區(qū)分淋系、髓系白血病正常造血細(xì)胞各系列抗原表達(dá)的演進(jìn)不管是在胚胎期、老年期、還是化療以后，正常造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模式都不改變。正常造血細(xì)胞各系列抗原表達(dá)的演進(jìn)不管是在胚胎期白血病細(xì)胞表面抗原異常表達(dá)造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模型能夠用于鑒別惡性克隆!白血病克隆與正常細(xì)胞之間抗原表達(dá)不同---白血病相關(guān)的免疫表型（LAIP）白血病細(xì)胞表面抗原異常表達(dá)造血細(xì)胞抗原組合的表達(dá)模型能正常造血細(xì)胞白血病細(xì)胞抗原表達(dá)遵循系列保守性出現(xiàn)抗原跨系表達(dá)髓系:CD33+,T系:CD7+髓系:CD33+CD7+抗原表達(dá)有一定的時(shí)序性出現(xiàn)抗原時(shí)序混亂表達(dá)原始細(xì)胞:CD34+CD15- 原始細(xì)胞:CD34+CD15+各階段細(xì)胞按一定的比例分布出現(xiàn)分化阻滯原幼細(xì)胞<5%原幼細(xì)胞>20%

抗原表達(dá)的缺失抗原強(qiáng)度的異常

正常造血細(xì)胞白需要掌握正常造血細(xì)胞的抗原表達(dá)規(guī)律不同系列的細(xì)胞表達(dá)的抗原？同一系列不同階段的細(xì)胞表達(dá)的抗原？每種抗原的表達(dá)強(qiáng)度？需要掌握正常造血細(xì)胞的抗原表達(dá)規(guī)律免疫分型常用的抗體干祖細(xì)胞

CD34、TDT、CD117、

CD38、HLA-DR、AMLCD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO懷疑M6加做CD71、GPA懷疑M7加做CD61、CD41、CD42B-ALLCD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79aT-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3NK細(xì)胞CD16、CD56、CD57漿細(xì)胞CD38、CD138、cκ、cλ、CD19、CD56免疫分型常用的抗體干祖細(xì)胞根據(jù)骨髓細(xì)胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門(mén)圈定各類細(xì)胞R1門(mén)為成熟淋巴細(xì)胞R2門(mén)為正常單核細(xì)胞位置R3門(mén)正常粒細(xì)胞位置R4門(mén)為幼稚淋巴細(xì)胞出現(xiàn)位置R5門(mén)為有核紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片位置R6門(mén)為幼稚髓細(xì)胞出現(xiàn)位置白血病細(xì)胞通常會(huì)在R4R6兩門(mén)位置處出現(xiàn)正常成人骨髓樣本----CD45設(shè)門(mén)根據(jù)骨髓細(xì)胞CD45/SSC圖中分布情況設(shè)門(mén)圈定各類細(xì)胞正AML-M1AML-M1AML-M2AML-M2AML-M3AML-M3結(jié)論：ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)診斷M3。

結(jié)論：ANLL,建議結(jié)合染色體和分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)診斷M3。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M4。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M4。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M5。結(jié)論：ANLL，伴單核細(xì)胞分化，免疫表型符合M5。結(jié)論：ANLL，建議結(jié)合形態(tài)學(xué)以確診M6。

結(jié)論：ANLL，建議結(jié)合形態(tài)學(xué)以確診M6。AML-M7AML-M7B-ALLB-ALLT-ALLT-ALLEGILScoringSystemForBAL(>2points)ScoreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/64EGILScoringSystemForBAL(>2RequirementsforassigningmorethanonelineagetoasingleblastpopulationMyeloidlineageMyeloperoxidase(flowcytometry,immunohistochemistryorcytochemistry)orMonocyticdifferentiation(atleast2ofthefollowing:NSE,CD11c,CD14,CD64,)TlineageCytoplasmicCD3(flowcytometrywithantibodiestoCD3epsilonchain;immunohistochemistryusingpolyclonalanti-CD3antibodyzetachain,whichisnotT-cellspecific)orSurfaceCD3(rareinmixedphenotypeacuteleukemia)BlineageStrongCD19withatleast1ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10orWeakCD19withatleast2ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10MPAL(mixedphenotypeacuteleukemia)

WHO2008RequirementsforassigningmorCD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineageALL)B-negative,CD64+CD14+/-CD33+(MonocyticLeukemia)TwoLeukemicPopulationsMonoblastsLymphoblasts結(jié)論：急性混合細(xì)胞白血病(AM-LL)CD19+CD22+B-negative,CD64+Two二.白血病微小殘留病灶

（MRD）目的：判斷預(yù)后，指導(dǎo)個(gè)體化分層治療，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)二.白血病微小殘留病灶

（MRD）目的：判斷預(yù)后，指導(dǎo)個(gè)B-ALL:多數(shù)表達(dá)CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,這些標(biāo)志的任意組合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等，也可加上某些異常標(biāo)志如CD13、CD33、CD15即可將ALL細(xì)胞與正常骨髓和外周血細(xì)胞分開(kāi)（60～80%）。T-ALL:TDT結(jié)合T細(xì)胞表面標(biāo)志如CD5或CD3，加上cCD3(90%).B-ALL:多數(shù)表達(dá)CD34、CD38dim、TDT、CD1AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合，表達(dá)TDT、CD13、CD33與散射光及抗原密度，可確定殘留的AML細(xì)胞（70～80%）AML:CD34、CD56、CD15在內(nèi)的多種組合，表達(dá)TDLEUKEMIAATDIAGNOSISNORMALDAY290.039%LEUKEMIANORMALDAY290.039%2013.4.21,原始細(xì)胞占79.2%2013.5.18，MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD202013.4.21,原始細(xì)胞占79.2%2013.5.18，流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件三.成熟淋巴細(xì)胞增殖性疾病三.成熟淋巴細(xì)胞增殖性疾病慢性淋巴細(xì)胞白血病幼稚淋巴細(xì)胞白血病毛細(xì)胞白血病脾邊緣區(qū)淋巴瘤大顆粒淋巴細(xì)胞白血病皮膚T細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)白血病…………循環(huán)淋巴細(xì)胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細(xì)胞術(shù)的輔助診斷！慢性淋巴細(xì)胞白血病循環(huán)淋巴細(xì)胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細(xì)正常淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖性疾病(克隆擴(kuò)增)TBNKoror確定克隆來(lái)源！正常淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖性疾病(克隆擴(kuò)增)TBNKorB-LPD:B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達(dá)；

T/NK-CLPD:由于缺乏單克隆的標(biāo)記物，通過(guò)FCM診斷成為難點(diǎn)。B-LPD:B淋巴細(xì)胞出現(xiàn)輕鏈的單一抑制性表達(dá)；正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細(xì)胞正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細(xì)胞CD19+淋巴細(xì)胞增多的鑒別診斷DighieroG,HamblinTJ.Lancet,2008,371(March22),1017B-LPD(lymphoproliferativedisease)CD19+淋巴細(xì)胞增多的鑒別診斷DighieroG,Ha結(jié)論：CLL/SLL.結(jié)論：CLL/SLL.結(jié)論：慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病，建議進(jìn)一步FISH檢測(cè)t(11;14)以確診MCL.結(jié)論：慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病，建議進(jìn)一步FISH檢測(cè)t(1結(jié)論：免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學(xué)和臨床明確診斷。結(jié)論：免疫表型符合HCL,建議結(jié)合形態(tài)學(xué)和臨床明確診斷。流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件1、前驅(qū)T淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤（T-ALL/T-LBL）2、母細(xì)胞性NK細(xì)胞淋巴瘤3、慢性前淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤（T-CLL/T-PLL）4、顆粒淋巴細(xì)胞白血?。═-LGL）5、侵襲性NK細(xì)胞白血?。ˋNKCL）6、成人T細(xì)胞淋巴瘤/白血?。ˋTCL/L）7、節(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）8、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤（ITCL）9、肝脾γδT細(xì)胞淋巴瘤10、皮下脂膜樣T細(xì)胞淋巴瘤11、菌樣霉菌病/賽塞里(Sezary)綜合征(MF/SS)12、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細(xì)胞,原發(fā)性皮膚型13、周?chē)鶷細(xì)胞淋巴瘤(PTL)14、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(AITCL)15、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細(xì)胞,原發(fā)性全身型WHO2008成熟T/NK細(xì)胞腫瘤淋巴增殖性疾病分類1、前驅(qū)T淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤（T-ALL/T-LBL）免疫表型特征免疫表型特征1.光散射信號(hào)的異常：FS

1.光散射信號(hào)的異常：FS2.抗原丟失75％成熟腫瘤T細(xì)胞會(huì)丟失正?？乖瑿D7是最易發(fā)生丟失的抗原CD2和CD5也是經(jīng)常發(fā)生丟失的抗原2.抗原丟失75％成熟腫瘤T細(xì)胞會(huì)丟失正常抗原3.抗原表達(dá)異常：如：伴CD10＋3.抗原表達(dá)異常：如：伴CD10＋4.抗原表達(dá)強(qiáng)度異常：

4.抗原表達(dá)強(qiáng)度異常：正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)CD4或CD8某一個(gè)群體的限制性表達(dá)模式：

CD4+,CD8-CD4-,CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-

多見(jiàn)5.細(xì)胞群體數(shù)量的異常增加以及抗原的限制性表達(dá)：正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1多見(jiàn)5.細(xì)胞群體數(shù)量流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL）通常CD4+orCD4+CD8+,PB:>55%幼淋細(xì)胞杭XX,女/60,結(jié)果：異常淋巴細(xì)胞占47.4%，表達(dá)CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例47.4%，表型符合T-PLL.常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL）血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤(AITCL):CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常見(jiàn)T-CLPD免疫表型血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤(AITCL):常見(jiàn)T-CLPD免疫表型患者，丁XX,男/59

淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細(xì)胞占78%,抗原表達(dá)異常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+),提示T-CLPD患者，丁XX,男/59淋巴結(jié)骨髓結(jié)論:異常T淋巴細(xì)胞占78%外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）骨髓侵犯:CD4+,多數(shù)CD7-and/orCD5-常見(jiàn)T-CLPD免疫表型外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）骨髓侵犯:常見(jiàn)T-CLPD免疫表成人T細(xì)胞淋巴瘤（ATLL）:CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失部分伴有髓系抗原表達(dá)：CD13，CD33，CD15

外周血：多形核淋巴細(xì)胞確診：HTLV-1基因陽(yáng)性

常見(jiàn)T-CLPD免疫表型常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-LGLCD4+orCD8+，伴有NK抗原表達(dá)CD16+，CD57+，部分CD56+形態(tài)學(xué)：大顆粒淋巴細(xì)胞常見(jiàn)T-CLPD免疫表型T-LGL常見(jiàn)T-CLPD免疫表型TCRVβ限制性表達(dá)1.包含24種抗體，兩種熒光素，識(shí)別70％Vβ亞家族；2.在診斷和MRD監(jiān)測(cè)中的作用TCRVβ限制性表達(dá)流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件流式細(xì)胞基本原理和在白血病中應(yīng)用課件STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBecauseTCRisapartofCD3complex,vbetaanalysiscannotbeusedforsurfaceCD3-negativeTcells.STRUCTUREOFTCELLRECEPTORBe

部分病例運(yùn)用免疫標(biāo)記物難以將惡性成熟T淋巴細(xì)胞從正常T淋巴細(xì)胞中精確鑒別(反應(yīng)性或克隆性)。原因：1.腫瘤細(xì)胞被反應(yīng)性T細(xì)胞掩蓋

2.CD8+占優(yōu)勢(shì)群體還見(jiàn)于：V感染(AIDS,EBV)，BMT后

臨床特點(diǎn)對(duì)診斷更為重要！臨床特點(diǎn)對(duì)診斷更為重要！流式診斷NK細(xì)胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-沒(méi)有特征性抗體區(qū)分腫瘤和反應(yīng)性NK細(xì)胞：數(shù)量以及FSKIR：KIRs、CD94/NKG2；均一性表達(dá)KIR同種型

流式診斷NK細(xì)胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿四.陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）糖基化磷脂酰肌醇錨（GPI）連接的錨連蛋白缺乏補(bǔ)體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血為特征的獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病磷脂酰肌醇聚糖A(PIG－A)基因突變PIG－A基因突變對(duì)補(bǔ)體敏感性增高溶血錨連蛋白：補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59、CD16、CD24、CD14、Flaer等陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）糖基化磷脂酰肌醇錨（GPI樣本收集：優(yōu)先選擇外周血，不推薦骨髓抗凝劑:EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必須在48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)（粒細(xì)胞上的抗原表達(dá)和散射會(huì)隨著時(shí)間而改變）CCS指南推薦對(duì)>2種細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)

標(biāo)本類型

抗凝劑標(biāo)本儲(chǔ)存樣本收集：優(yōu)先選擇外周血，不推薦骨髓CCS指南推薦對(duì)>2種細(xì)常規(guī)檢測(cè)：敏感度1%，獲取5000個(gè)目的細(xì)胞高敏檢測(cè)：敏感度0.01%，獲取250，000個(gè)目的細(xì)胞中性粒細(xì)胞：必做紅細(xì)胞：中性粒細(xì)胞檢出PNH克隆時(shí)必做，或全部標(biāo)本都做，但單獨(dú)檢測(cè)不推薦單核細(xì)胞：可提供穩(wěn)定的結(jié)果淋巴細(xì)胞：不推薦細(xì)胞獲取目的細(xì)胞常規(guī)檢測(cè)：敏感度1%，獲取5000個(gè)目的細(xì)胞細(xì)胞獲取目的細(xì)胞抗體的選擇僅檢測(cè)CD55/CD59------不推薦敏感性：5-10%(Sutherlandandal,CytometryPartB72B:167-177)Flaer-----組成高特異性的PNHPanel

抗體的選擇僅檢測(cè)CD55/CD59------不推薦紅細(xì)胞