腺相關(guān)病毒知識

第一節(jié)AAV病毒的生活周期腺病毒伴隨病毒（adeno-associatedvirus,是微小病毒科（Parvoviridae）族成員是一類微小、無被膜及具有二十面體結(jié)構(gòu)的病毒。病毒顆粒的直徑在20～26nm之間，含有大小在7~6kbDNAAAV病毒屬于依賴性病毒類pendovirus，最初是在純化的腺病毒液中發(fā)現(xiàn)的一種污染成分Atchinsonetal.1965,顧而得名。AAVAAV病毒，在培養(yǎng)的正常細(xì)胞中不發(fā)生產(chǎn)毒性感染，只有在有輔助病毒包括腺病毒或皰疹病毒共同感染時才發(fā)生產(chǎn)毒性感染（Hogganetal.1966;Bulleretal.1981。因此，AAVAAV而是在正常細(xì)胞中偏向于建立潛伏感染,僅在宿主細(xì)胞受到刺激時才被誘發(fā)進(jìn)行感染性增殖。AAV的生活周期有兩種不同的胞內(nèi)期。在無輔助病毒存在時，AAVAAVDNA病毒基因組整合到宿主的基因組中建立潛伏感染。AAV病毒偏向于整合到人基因組19q臂的特定位置etal.1990,1991,1992;Samulskietal.1993AAVAAV對細(xì)胞表型往往有微弱影響，并影響細(xì)胞對刺激的反應(yīng)能力Yalkinogluetal.1988;Yakobsonetal.1987,1989;Bantel-Schaaletal.1992,1991。AAV生活周期的另一種胞內(nèi)期是產(chǎn)毒性感染，往往在有輔助病毒（腺病毒或皰疹病毒）AAV感染之前、同時或之后進(jìn)行。腺病毒（Ad）和單純皰疹病毒（HSV）中與輔助功能有E1a,E1b,E2a,E4VARNA（Muzyczka1992DNAE2b基因產(chǎn)物（DNA聚合酶和末端酶。1型單純皰疹病毒（HSV-1）提供輔助功能的情形則有些不同,HSVICP0ICP4，HSVDNAHSV螺旋酶－引物酶復(fù)合物（UL5，UL8，UL52）DNAUL29的參與WeindlerFetal.199。這種在輔助功能方面的不同可能反映了腺病DNA合成機(jī)制的不同影響。AAV（1）AAV（2）通過潛伏感染,（3）只要宿主細(xì)胞正常，AAV如果細(xì)胞受到刺激，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變而表達(dá)應(yīng)激基因（5）導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)狀況也使AAV基因表達(dá)，從而使AAV（6）產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的正常宿主細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。用某些可損傷基因的因素如紫外線照射、AAVAAVAAV一種強(qiáng)烈偏向于潛伏的病毒。返回標(biāo)題第二節(jié)AAV病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能人2型腺病毒伴隨病毒4681個核苷酸的單鏈DNA，全部序列已測定。正鏈和負(fù)鏈AAAV病毒顆粒中?；蚪M的結(jié)構(gòu)如圖3-1所示?；蚪M的兩末端為145bp重復(fù)序列invertedterminalrepeat,ITR。ITRAAVORF編碼4RepORF編碼3種Cap蛋白。一．ITR的結(jié)構(gòu)和功能AAVITR的序列和結(jié)構(gòu)見圖3-2ITR長145bp125bpT形的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由兩個小回紋結(jié)構(gòu)palindrome（圖2B）組成，旁邊為一個較大的回紋結(jié)構(gòu)ITR的序列可有兩種構(gòu)型：flip（B回紋接近3’端）flop（C回紋接近3’端AAVflipflopAAVITR容易形成如圖2T型發(fā)夾結(jié)構(gòu)，還可能形成另外的構(gòu)型。ITR序列是AAV病毒的復(fù)制、整合、拯救和包裝所必需的順式作用元件。二．Rep基因的結(jié)構(gòu)和功能Rep基因編碼至少4種非結(jié)構(gòu)蛋白：Rep78,Rep68,Rep52,Rep40p5啟動子起始的2mRNA翻Rep78Rep68p192mRNA翻譯成Rep52Rep4（圖3.Rep52Rep40蛋C末端的氨基酸序列分別與Rep78Rep68相同。Rep78Rep68AAV基因表達(dá)的正負(fù)調(diào)控有ITR中的特定序列(5’-GCTCGCTCGCTC-3’)AAV的3個啟動ITR自我折疊時可加強(qiáng)這種結(jié)合作用。Rep78/Rep68ATP酶和螺旋酶的功能。當(dāng)ITR結(jié)合時便成為在124位點(diǎn)核苷酸處特異切割的缺口酶,識別的位點(diǎn)是5’-T/TGGAAV生活周期的每一時期都是必需的。在非允許條件下（沒有輔助病毒和刺激因素RepRepAAV基因組以直接方式Rep蛋白的表達(dá)對位點(diǎn)特異性整合是必需的。相反，在允許條件下，Rep蛋白的表AAVAAVAAVDNA的復(fù)制都是必需的。Rep52Rep40DNADNA的累積中則是必需的。三．Cap基因的結(jié)構(gòu)和功能Cap基因編碼衣殼蛋白，其轉(zhuǎn)錄從p40啟動子開始，形成約2.6kb2.3kbmRNA,拼接后分別編碼三個結(jié)構(gòu)VP1、VP2VP3(圖2)，分子量分別為87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例為1:1:10VP1時，VP2VP3DNAVP1在病毒顆粒的穩(wěn)定性或感染性VP2VP3返回標(biāo)題第三節(jié)重組AAV的產(chǎn)生原理及常規(guī)制備、檢測方法在基因治療研究中，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和重組腺病毒在基因轉(zhuǎn)移載體中一直占主導(dǎo)地位。但近年來這一情況有所改變，用AAV作基因轉(zhuǎn)移載體已成為基因治療研究的熱點(diǎn)。這是由于AAV具有以下特點(diǎn)：AAV對人體致病;AAVAAV基因組的96%步保證了安全性；宿主范圍廣。不僅可轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，而且可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止期細(xì)胞；AAV可整合到人基因組19q臂的特定位置,利用這一特點(diǎn),AAV載體;的基因組僅4681個核苷酸,便于用常規(guī)的重組DNA技術(shù)進(jìn)行操作；物理性質(zhì)穩(wěn)定。在60C不能被滅活,能抗氯仿;可長期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。一．重組AAV的產(chǎn)生原理AAV載體均由2AAVITR整合的信號，這使rAAV的產(chǎn)生成為可能：外源基因表達(dá)盒可完全取代AAV和capAAVrAAV的產(chǎn)生需要4與：DNADNA145bpAAVITR序列，外源基因的表達(dá)單位（目的基因和多聚腺苷酸序列組成）ITR之間。AAV的復(fù)制蛋白(Rep)(Cap)。通常由攜帶它們相應(yīng)基因的質(zhì)粒（稱為包裝質(zhì)粒）反式提供。宿主細(xì)胞。多種細(xì)胞可用作產(chǎn)生重組AAV293HeLaKB3細(xì)胞用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的效率最高，因此最常用。輔助病毒。常用的輔助病毒為腺病毒，皰疹病毒則較少用到。腺病毒的輔助功能由E1aE1bE2aorf6VARNA基因提供；HSV-1UL5、UL8UL52UL29等基因提供。在輔助病毒存在的條件下，ReprAAV并加以復(fù)制，得到大量復(fù)制形式的rAAVDNArAAV毒顆粒。二．重組AAV的常規(guī)制備及純化方法rAAV載體的常規(guī)制備過程見圖3.3。通常采用磷酸鈣共轉(zhuǎn)染的方法，將載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染經(jīng)腺病毒HeLa或293細(xì)胞(HermonatandMuzyczka,1984;Samulskietal.,1987,1989)hrAAV存在于細(xì)胞內(nèi)，去掉上清沒有明顯損失。將細(xì)胞團(tuán)塊凍融3~455~60C加熱30~60min以滅活腺病毒。rAAVrAAV基因組與AAV1.41g/cm3,1.35g/cm3rAAV的粗提物即可；但如果用于動物實驗，則需進(jìn)行若干次氯化銫平衡梯度離心進(jìn)行純化，因為即使污染了很少量的腺病毒（無論滅活與否）都能造成病毒接種部位的局部炎癥反應(yīng)。在rAAV制備過程中，需注意以下問題：rAAV的基因組長度（ITR在內(nèi)）AAV基因組4681bp盒（包括啟動子、目的基因及多聚腺苷酸序列）不超過4.3kb。AAVITRrAAVITR的完整性是很重要的。由于ITRSmaI的酶切位點(diǎn)，因此用SmaI對載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，通過獲得的片段即可初步判斷ITR是否完整。通常制備的質(zhì)粒中，≤20%ITR,rAAV的制備中是可以接受的。293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可接近NA沉淀顆粒細(xì)小、均一，轉(zhuǎn)染液的pH穩(wěn)定。轉(zhuǎn)染效率可以通過轉(zhuǎn)染含報告基因半乳糖苷酶基因或綠色熒光蛋白基因）表達(dá)盒的質(zhì)粒來檢測。rAAV60h,rAAV這種情況下應(yīng)降低腺病毒的感染指數(shù)（multiplicityofinfection,MO。三．重組AAV的滴度測定方法rAAV的滴度測定可根據(jù)情況采用以下不同的方法進(jìn)行。測定外源基因表達(dá)rAAV滴度的最嚴(yán)格的方法。陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)信號表明rAAV外源基因得到了表達(dá)，而且表達(dá)水平足以用合適的方法檢測到。然而，由于在不同的外源基因表達(dá)的檢測上rAAV在產(chǎn)量上不便比較。復(fù)制中心檢測（replicationcenterassay,RCA）rAAVAAVAAVRepCaprAAV成功地感染了細(xì)胞、脫殼、并有能力復(fù)制。但該方法不能檢測出外源基因表達(dá)盒是否完整。Southern雜交DNA探針，與得到的rAAV基因組進(jìn)行雜交。陽性信號代表已制備出Southern雜交代替點(diǎn)雜交，rAAV制備過程中可能產(chǎn)生一些缺陷的干擾性基因組，這些缺陷的基因組可被包裝成病毒顆粒，返回標(biāo)題第四節(jié)重組AAV生產(chǎn)策略及純化方法的新進(jìn)展rAAVrAAV方法，并取得了明顯進(jìn)展。本節(jié)即對此進(jìn)行簡要介紹。一．rAAV生產(chǎn)策略的新進(jìn)展歸納起來，rAAV生產(chǎn)策略可分為兩大類，即需要轉(zhuǎn)染的制備方法和不需要轉(zhuǎn)染的制備方法。(一）需要轉(zhuǎn)染的制備方法目前多數(shù)實驗室仍采用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法(HermonatandMuzyczka.1984;Samulskietal.1987,1989)制備rAAV(見上一節(jié))。近年來，這種基于共轉(zhuǎn)染的制備方法已進(jìn)行了多項改進(jìn)，主要包括以下方面。轉(zhuǎn)染方式的改進(jìn)（Maxwelletal.DNA過多聚賴氨酸偶聯(lián),靠腺病毒受體的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞(Mamounasetal.1995)等。包裝質(zhì)粒的改進(jìn)AAV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時，repcap基因均達(dá)到很高的拷貝數(shù)106/細(xì)胞RepCaprAAVrepcap基因（Fanetal.1997）RepCapChiorini等（1995）將rep和capSV40擴(kuò)增子上，在大T抗原的作用下，repcap基因擴(kuò)增至高拷貝，可使rAAV的病毒顆粒數(shù)較對照組（不能擴(kuò)增的包裝質(zhì)粒提高60倍；Flotte等（1995)HIVLTRrepp5,Rep的表達(dá),并使rAAV的包裝效率增強(qiáng)了10倍。然而，Li等(1997)的研究卻發(fā)現(xiàn)，ReprAAVp5啟動子控repRep的起始密碼子ATGpACG2,這樣的改造Rep表達(dá)，卻使Cap的表達(dá)顯著提高，并因此提高了rAAV的產(chǎn)量。類似的研究也表明etal.Cap的表達(dá)，可以提高rAAVReprAAV的產(chǎn)量Xiaoetal(1998)在包裝質(zhì)粒pACG2的基礎(chǔ)上，在capp5啟動子，使的產(chǎn)量進(jìn)一步得到提高。輔助病毒的改進(jìn)AAVAAVrAAV中去除才能應(yīng)用于人體基因治療，否則，即使是滅活的輔助病毒，其變性的蛋白質(zhì)也會引起人體免疫反應(yīng)。因此，Xiao等（1998）將腺病毒上起輔助功能的基因全部rAAVrAAV生產(chǎn)系統(tǒng)就包括了33個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293rAAV1000個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（transducingunit,TU）。Grimmetal(1998)則將包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的功能合并到一個質(zhì)粒上，生產(chǎn)rAAV時僅需載體質(zhì)粒和包裝/輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。（二）不需轉(zhuǎn)染的制備方法rAAV進(jìn)行基因治療,對于治療1個患者需要的重組病毒顆粒數(shù)估計在1014左右。采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法制備rAAVrAAVrAAV生產(chǎn)細(xì)胞株做了大量工作。要建立理想的rAAVrepcaprAAVrAAV的4種成分簡化，在生產(chǎn)方式上用“感染”的方式代替“轉(zhuǎn)染”的方式。Vicent等(1990)首先建立了表達(dá)AAVITRAAVHeLa細(xì)胞，得到了幾株整合了低拷貝AAV基因組的細(xì)胞株。由于RepCap的表達(dá)不高，因此得到的細(xì)胞株產(chǎn)生rAAVRepCapAAVRepRep的細(xì)胞株（Holscheretal.1994;Yangetal.1994）,rAAV的產(chǎn)量。我們實驗室（Yanetal.1997）repcapEBA549RepCaprAAVClark等(1995)Tamayose等(1996)則采用了另外的策略。他們將載體DNAAAVrep和capHeLa細(xì)胞中，然后用腺病毒感染。采用這樣的策略，每個細(xì)胞最多可產(chǎn)生數(shù)十個感染單位（infectiousunit,IU）。Gao等(1998)Liu等(1999)HeLarepcapHeLarAAVE1E1aE1brAAVrAAV。Inoue和Russell(1998)發(fā)展了一種rAAV包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞整合了含SV40復(fù)制起點(diǎn)的載體成分和AAV基因組，SV40T抗原則處于四環(huán)素開關(guān)控制下。向培養(yǎng)液中加入四環(huán)素類似物強(qiáng)力霉素可誘導(dǎo)SV40T抗原合成，在SV40T抗原作用下，連接了SV40復(fù)制起點(diǎn)的載體成分和AAV基因組大量擴(kuò)增。用腺病毒感染后，rAAV的產(chǎn)量比質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法提高了10倍，每個細(xì)胞可產(chǎn)生104病毒顆粒。Conway等(1997)和我們小組（Shuetal.1999）repcap基因，而將載體成RepCapHSV-1擴(kuò)增子時，野生型的輔助病毒（HSV-1）和擴(kuò)增子假病毒在物理性質(zhì)上完全一致，不能分開，這一向被認(rèn)為是HSV-1擴(kuò)增子載體系統(tǒng)的最大缺陷。但在生產(chǎn)rAAVrAAV提供輔助功能。研究者們曾希望repcaprAAV只能達(dá)到與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)rep和cap該生產(chǎn)系統(tǒng)所含可變因素較多，難以優(yōu)化。最近，我們（Wuetal.1999）Conway等(1999)RepCapHSV-1,用它感染rAAV200~400TU的。這是迄今為止最為簡便、高效，最適合于大規(guī)模制備的rAAV生產(chǎn)系統(tǒng)。我們構(gòu)建的重組HSV-1在重ConwayHSV-1HSV-1全基因組的粘粒系統(tǒng)（Conninghametal,1993）HSV-1是可復(fù)制的，rep和capHSV-1的復(fù)制達(dá)到高拷貝，ConwayHSV-1是復(fù)制缺陷型的，需依賴互補(bǔ)細(xì)胞系進(jìn)行繁殖。rAAV所必需的4rAAVHSVAAVrepcaprep和cap基因可隨重組HSV-1,而表達(dá)ReprAAVAAVrAAV生產(chǎn)系統(tǒng)。rAAVAAV污染的情況，具有較高的安全性。已有兩個研究小組（DingandMunshi,997;ZhouandMuzyczka,1998）rAAV值得進(jìn)一步研究。二．rAAV純化方法的新進(jìn)展rAAV此外氯化銫對人體具有潛在毒性，因此目前已不提倡使用氯化銫的純化方法。Gimmetal(1998)AAV解液進(jìn)行一步純化，整個過程一天內(nèi)完成?？苫厥盏酱蠹s70%80%。AAV天然受體的類似物，另外兩個實驗室（Clarketal,1999;Zolotukhinetal,1999）分別發(fā)展了肝素親和層析的純化方法。采用這種純化方法的潛在問題是很多細(xì)胞蛋白質(zhì)也同肝素結(jié)合，因此需要解決如何去除雜蛋白的問題。Zolotukhin等采取的辦法是先用碘狄醇密度梯度離心，得到“半純化”再用肝素親和層析進(jìn)行純化。這種方法快速（一個工作日即可完成、簡便（層析柱已商品化，可以買到、重50-70%99%。Clark56C加熱45min理可能造成蛋白變性。離心去除沉淀，再進(jìn)行肝素親和層析。結(jié)果表明這種方法同樣快速（4小時內(nèi)即可完成、重復(fù)性好，回收率高于70%，純度可達(dá)99%。AAV能抵抗氯仿的特性，提出了一種“氯仿處理―PEG/NaCl沉淀―氯仿抽提”純化方法，收到了很好的效果，這在下一節(jié)將詳細(xì)介紹。返回標(biāo)題第五節(jié)重組AAV的大規(guī)模制備及純化AAV一．用“一種病毒感染一株細(xì)胞”rAAVrAAV的產(chǎn)生需要4種成分參與，即載體DNAAV的復(fù)制和包裝蛋白Rep和CaprAAV生產(chǎn)系統(tǒng)將這4RepCapAAVDNA與rAAV的載體細(xì)胞株。當(dāng)用這種新型輔助病毒感染載體細(xì)胞株時，repcap基因的拷貝數(shù)隨著輔助病毒的不斷復(fù)制而增加，同時表達(dá)出大量的RepCap蛋白；而Rep蛋白的表達(dá)又可以rAAVAAV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的。AAVHSVrAAV究者們(包括我們實驗室)AAVRepCapAAVAAVRep蛋白強(qiáng)烈地抑制腺病毒的復(fù)制。1型單純皰疹病毒(herpessimplexvirustype1,HSV-1)也可作為AAVpCapHSV-1載體值得一試。我們采取了圖3.4的重組策略，利用一套含有HSV-1系統(tǒng)（Conninghametal,1993）進(jìn)行重組。該系統(tǒng)含有5HSV-1基因片段，cos6粘粒進(jìn)行操作，將AAVrep和cap基HSV-1UL-2基因的XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建成重組粘粒cos6-rc/ΔUL2。將cos6-rc/ΔUL2與其它4個粘粒混合，用PacI基因片段，然后共轉(zhuǎn)染BHK-21repcapHSV1-rc/ΔUL2。進(jìn)一步的實驗表明HSV1-rc/ΔUL2rAAVrAAV具有感染性Wuetal.1999。rAAV載體的構(gòu)建及rAAV載體細(xì)胞株的建立為了便于建立rAAV載體細(xì)胞株，我們構(gòu)建了一種通用型AAV載體質(zhì)粒pSNAV(伍志堅等，2000；圖3.5),該載體在結(jié)構(gòu)上具有以下特點(diǎn):ITR;ITR之間依次為巨細(xì)胞病毒（CMV）polyAKpnⅠ、EcoRⅠ、SalBglII；ITRSV40啟動子控制下的新霉素抗性基因表達(dá)盒。rAAVAAVG418AAV細(xì)胞株。我們將綠色熒光蛋白（GFP）pSNAV上，構(gòu)建成rAAVpSG1。將pSG1BHK-21G418rAAV-GFPCgfp。BHK-21細(xì)胞的倍增時間短，細(xì)胞易于培293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞。采用同樣的策略，我們目前已建立rAAVβ-半乳糖苷酶(lacZ)基因、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因、膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)生長因子生長因子受體（VEGFR）IX基因（與復(fù)旦大學(xué)遺傳所合作）等。HSV感染載體細(xì)胞株生產(chǎn)rAAVrAAVHSV1rc-/ΔUL2在生產(chǎn)中的用量，即感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection,MO。輔助病毒用量過高，HSV1rc-/UL2本身的復(fù)制及表達(dá)的基因產(chǎn)物可造成受感染的載體細(xì)胞株病變過快，影響rAAVCap的表達(dá)就低，同樣會影響rAAV產(chǎn)量。我們的實驗表明（吳小兵等，待發(fā)表資料HSV1rc-/UL2CgfpMOI為0.1時，感染后8h細(xì)胞恰好完全病變，得到的rAAV最高，平均每個細(xì)胞可產(chǎn)生大約250TU的rAAV。將細(xì)胞在110mm×285mm的轉(zhuǎn)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，鋪滿時一個轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞數(shù)量可達(dá)4×108，最終rAAV的產(chǎn)量可達(dá)1011TU。二．rAAV的純化rAAVrAAV用硫酸銨沉淀濃縮，再用若干輪氯化銫密度梯VrAAVAAV的空殼未能除去。AAV“氯仿處理―PEG/NaCl沉淀―氯仿抽提”3.6)。第一步氯仿處理可以達(dá)到3個目的：1.滅活輔助病毒，免去了熱滅活PEG/NaCl沉淀對上清中rAAV的回收率>99%，并可使rAAV濃縮超過100倍。第三步氯仿抽提可除PEG及不需要的蛋白質(zhì)，同時并不損失。采用這種方法濃縮和純化最終可使1013-1014rAAV病毒顆粒溶于1mL中，純度>90%，電鏡下(圖8)AAV空殼的比例很低（<1%）,病毒顆粒數(shù)/轉(zhuǎn)導(dǎo)單位<100。返回標(biāo)題第六節(jié)重組AAV對細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)rAAVrAAVrAAV150kD的受體,但進(jìn)一步的實驗并未鑒定出這種蛋白。最近的研究（Summerfordetal.1998;Summerfordetal.1999;Qingetal.1999）1型成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR1)Vβ5體，而FGFR1αVβ5整合素可能是輔助受體。它們（也可能還有其它分子）在用尚未完全闡明。rAAVSouthernPCR和熒光原位雜交（FISH）均顯示載體可整合至細(xì)胞基因組的任意位置，而不是象野生型那樣特異性整合至19號染色體。用攜帶neorAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，將染色體與載體的連接處克隆、測序，結(jié)果表明大多數(shù)載體的整AAV的情況是類似的。需要指出的是，這些實驗是用處于壓力選擇培養(yǎng)條件下的細(xì)胞進(jìn)行的，因此得出的結(jié)論可能并不適于所有細(xì)胞類型，例如體內(nèi)研究就發(fā)現(xiàn)載體基因組可以以串聯(lián)體形式存在（見下文。rAAV攜帶的外源基因除了以整合的形式長期表達(dá)以外，還可以染色體外附加體的形式短暫表達(dá)。附加體的rAAVSDNA修復(fù)功能的藥物，類型、細(xì)胞的代謝和增殖狀態(tài)以及所用的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件。rAAVrAAV介導(dǎo)的外rAAV逐漸由單鏈的載體基因組轉(zhuǎn)變成高分子量的雙鏈串聯(lián)體，伴隨著外源基因的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在數(shù)周內(nèi)表達(dá)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。外源基因的長期表達(dá)可以來自整合于染色體的串聯(lián)體，也可以來自附加體形式的串聯(lián)體，這兩的單鏈基因組在5周內(nèi)逐漸消失，代之以雙鏈、高分子量串聯(lián)體的逐漸增加。這種串聯(lián)體在約5%的細(xì)胞中是整合形式的，其余則是以附加體形式存在的（Miaoetal.1998。在肌肉中,Duan等(1998)觀察到單體形式的附加體在80AAVITR近年來，rAAV已有效轉(zhuǎn)導(dǎo)了肝臟、肺臟、腦、肌肉、視網(wǎng)膜、血管內(nèi)皮等多種組織器官，所用的動物模型包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、豬、恒河猴、非洲綠猴及狒狒等，表明了這種載體在宿主范圍上的廣泛性。這對于rAAV用于人體基因治療無疑具有積極的意義。返回標(biāo)題第七節(jié)重組AAV在基因治療中的應(yīng)用截止到1999年8NIH6rAAVB1項。我們認(rèn)為造成rAAV未能更多地進(jìn)入臨床試驗的原rAAV大規(guī)模制備和純化方法尚未完全成熟，另一個原因是目前通過的臨床方案中治rAAVrAAV體內(nèi)實驗。一．遺傳性疾病BBAAV載體進(jìn)行基因治療的疾病之一。目前，rAAVIX因子基因已在小鼠或狗的血BIXrAAV量是肝臟所需要的數(shù)十倍,rAAV來自不同的實驗室、攜帶的表達(dá)盒也不同，因此這一結(jié)論,CMV啟動子控制下時，在肝臟中就檢測不到表達(dá)（Syderetal.1997;Nakaietal.1998。囊性纖維化（cysticfibrosis,CF）囊性纖維化的發(fā)生是由于囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（CFTR）基因的突變造成的，因此，用野生型CFTR基因作為治療基因有可能治愈該病。動物實驗表明，攜帶野生型CFTRrAAV已有效轉(zhuǎn)導(dǎo)了呼吸道DNAIrAAV對患者是安全的，CFTR基因可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞，CFTRcDNA可持續(xù)存在70天以上。然而，CFTR的表達(dá)一直不高，在一定程度上影響了療效。CFTRcDNA長4.6kb,rAAVAAVITRZhang等(1998)CFTRAAVp5rAAV達(dá)到了CFTR的有效表達(dá)。肌營養(yǎng)不良肢帶肌營養(yǎng)不良由4種肌聚糖的基因Li等(1999)以大鼠為模型，將攜帶δ-肌聚糖rAAV上。這為采用體內(nèi)直接注射的方式進(jìn)行肌營養(yǎng)不