溫自家抗體的血清學(xué)檢測課件

溫自家抗體的血清學(xué)檢測北京市紅十字血液中心范道旺溫自家抗體的血清學(xué)檢測北京市紅十字血液中心1溶血性貧血的分類自家免疫性溶血性貧血藥物誘導(dǎo)免疫性溶血性貧血同種免疫引起的免疫性溶血性貧血新生兒溶血溶血性輸血反應(yīng)溶血性貧血的分類自家免疫性溶血性貧血2自家免疫性溶血性貧血溶血類型：所占比例（%）溫自家溶血性貧血（WAIHA）48~70

冷凝集素病（CHD)16~32混合型（即溫型和冷型并發(fā)）7~8突發(fā)性冷型血紅蛋白尿癥（PCH)2，主要見于兒童DAT-陰性溶血性貧血12~18自家免疫性溶血性貧血溶血類型：3免疫性溶血性貧血血清學(xué)特征WAIHACHD混合AIHAPCH藥物誘導(dǎo)占有率48~70%16~32%7~8%2%，主要兒童12~18%DATIgG:單純C3IgG+C3單純C3IgG20~60%91~98%71~100%94~100%94%IgG+C3IgG+C324~63%6%C3:7~14%抗體類型主要IgGIgMIgG,IgMIgGIgG

放散液IgG無IgG無IgG特異性主要是Rh主要抗-I抗-P系統(tǒng)抗體免疫性溶血性貧血血清學(xué)特征WAI4不同AIHA患者DAT反應(yīng)特征

DATIgGC3血清特征

放散液特征WAIHA++57%有IgG自家抗體有IgG,與正常細(xì)胞反應(yīng)+00+CHD0+存在IgM自家抗體無反應(yīng)活性

不同AIHA患者DAT反應(yīng)特征5檢測溫自身抗體的目的用于確定：是否有溫自身抗體致敏在患者自身紅細(xì)胞上患者血清中是否存在溫自身抗體患者血清中是否同時存在同種抗體據(jù)報道：15~40%的有免疫史的WAIHA患者血清中伴隨有同種抗體。檢測溫自身抗體的目的用于確定：6溫自身抗體引發(fā)的血清學(xué)問題ABO定型Rh定型DAT試驗抗體篩查及抗體鑒定自身抗體的評價同種抗體的篩查和鑒定溫自身抗體引發(fā)的血清學(xué)問題ABO定型7自家凝集導(dǎo)致的ABO正反定型不相符

正定（抗體血清）反定（試劑紅細(xì)胞）

抗-A抗-B抗-D陰性對照A細(xì)胞B細(xì)胞w+w+3+w+4+4+對于極端的個例，包被了大量的IgG抗體紅細(xì)胞在定型血清中會發(fā)生自發(fā)的凝集，使用試劑的稀釋液作為陰性對照，可以發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)弱的自發(fā)凝集產(chǎn)生的陽性反應(yīng)，從而干擾定型。一般而言，由于溫自身抗體屬于不完全抗體，即使包被大量此抗體的紅細(xì)胞，正定型時與抗-A或抗-B混合后，也不會自發(fā)凝集。同樣，反定型時血清中的溫自身抗體和反定型紅細(xì)胞在室溫鹽水介質(zhì)也不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。自家凝集導(dǎo)致的ABO正反定型不相符正定（抗體血清）8WAIHA患者的Rh定型由于鹽水介質(zhì)抗-D試劑中添加了增強劑，因此，容易導(dǎo)致包被溫自身抗體的D（-）紅細(xì)胞自發(fā)凝集，產(chǎn)生假陽性，因此必須要用試劑廠商的試劑稀釋液做陰性對照。只有陰性對照為陰性時結(jié)果才可靠(在訂購試劑時要含有陰性對照）。紅細(xì)胞包被的IgG抗體不能通過洗滌而除去，因此，為了準(zhǔn)確定型，必須采用放散的方法來除去包被在紅細(xì)胞上的IgG抗體，得到DAT陰性的紅細(xì)胞來定型。WAIHA患者的Rh定型由于鹽水介質(zhì)抗-D試劑中添9DAT陰性紅細(xì)胞的制備甘氨酸-EDTA法二磷酸氯喹法DAT陰性紅細(xì)胞的制備甘氨酸-EDTA法10甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（1）試劑：10%Na2EDTA0.1M甘氨酸-HCl緩沖液（pH1.5):0.75g甘氨酸溶于100ml生理鹽水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH到1.51.0MTris-NaCl:12.1gtris和5.25gNaCl溶于100ml蒸餾水。甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（1）試劑：11甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（2）方法：待處理紅細(xì)胞鹽水洗滌6次酸化-甘氨酸-EDTA液：甘氨酸-HCl和EDTA按照20：5的體積比混合。在試管中將紅細(xì)胞和酸化-甘氨酸-EDTA液按照10：20體積比充分混合，室溫孵育2~3分鐘。向試管中添加1體積的Tris-NaCl,混勻后于900-1000g離心1分鐘，棄上清液，鹽水洗滌紅細(xì)胞4次。用抗-IgG檢測洗滌后的紅細(xì)胞，確認(rèn)DAT陰性，表明包被在紅細(xì)胞上的IgG抗體已經(jīng)去除。甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（2）方法：12氯喹放散法（1）試劑：二磷酸氯喹：20g二磷酸氯喹溶于100ml鹽水，用1NNaOH調(diào)節(jié)pH到5.1。DAT陽性的紅細(xì)胞（包被IgG）對照細(xì)胞（已知部分血型）抗-IgG血清氯喹放散法（1）試劑：13氯喹放散法（2）方法：0.2ml鹽水洗滌的壓積紅細(xì)胞和0.8ml氯喹液混合。室溫放置30分鐘。同時做對照。取出部分細(xì)胞，鹽水洗滌4次，進(jìn)行DAT試驗，如果DAT為陰性，則放散完成，將全部處理后的細(xì)胞洗滌備用。否則繼續(xù)處理30分鐘后檢測。氯喹放散法（2）方法：14WAIHA的DAT單純IgG抗體引起20~66%IgG+C324~63%單純C37~14%極少數(shù)：IgA或溫反應(yīng)性IgM抗體WAIHA的DAT單純IgG抗體引起15溫自身抗體DAT反應(yīng)結(jié)果多特異性AHG3+~4+抗-IgG3+~4+抗-C30~3+陰性對照0溫自身抗體DAT反應(yīng)結(jié)果多特異性AHG16溫自身抗體的篩選反應(yīng)格局鹽水立即離心37℃IAT

I000～4+II000～4+溫自身抗體的篩選反應(yīng)格局鹽水立即離心17WAIHA的抗體篩查及抗體鑒定患者的病歷信息分析產(chǎn)生DAT陽性的原因只有自家抗體（無免疫史）自家抗體可能合并同種抗體（有免疫史）藥物抗體（治療用藥情況）WAIHA的抗體篩查及抗體鑒定患者的病歷信息18患者的病歷信息臨床診斷原發(fā)性：無任何關(guān)聯(lián)疾病的情形下發(fā)生繼發(fā)性：其他疾病相合并發(fā)生：如淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、其他自家免疫疾病、卵巢腫瘤以及其他慢性炎癥。治療所用藥物有好幾種藥物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生和WAIHA一樣的血清學(xué)反應(yīng)。如：甲基多巴和甲基芐肼。免疫史（輸血史、妊娠史）輸血史對于判定患者血清中的是否存在同種抗體非常重要。據(jù)報道，15~40%的有輸血史或妊娠史的WAIHA患者血清中除自身溫抗體外，還伴隨有同種抗體。患者的病歷信息臨床診斷19WAIHA的抗體篩選和鑒定無免疫史的WAIHA檢測：直接進(jìn)行抗體鑒定，檢測抗體特異性，如果有特異性，選擇無對應(yīng)抗原的血液可以輸用。有免疫史的WAIHA患者檢測：放散試驗吸收試驗：無近期（2~3月內(nèi)）輸血史患者：采用自身吸收近期有輸血史或嚴(yán)重貧血的患者：采用異體吸收抗體篩查及抗體鑒定藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的AIHA，采用放散試驗，檢測放散液WAIHA的抗體篩選和鑒定無免疫史的WAIHA檢測：直接20增強自身抗體強度的方法LISS微膠柱固相化技術(shù)PEG-IAT增強自身抗體強度的方法LISS21自身細(xì)胞放散試驗?zāi)康拇_定是否存在溫自身抗體確定DAT陽性的原因是否是同種抗體引起而不存在溫自身抗體。放散液和一些試劑紅細(xì)胞出現(xiàn)陰性反應(yīng)表明血清中存在特異性同種抗體。確定是否是藥物引起的免疫性溶血性貧血：放散液反應(yīng)陰性可能是藥物依賴性抗體導(dǎo)致的，由于放散液中缺乏藥物，所以產(chǎn)生陰性反應(yīng)。自身細(xì)胞放散試驗?zāi)康拇_定是否存在溫自身抗體22WAIHA樣本何時進(jìn)行放散評估第一個樣本首次放散的目的是來確認(rèn)溫自身抗體引起的WAIHA，從而排除藥物依賴性抗體的干擾。放散液必須和所有的試劑紅細(xì)胞產(chǎn)生典型的陽性反應(yīng)。每個樣本：不需要對WAIHA患者的每一份都進(jìn)行放散，因為血清學(xué)反應(yīng)格局不會因為同一患者不同樣本而輕易發(fā)生改變。簡單的血清學(xué)檢驗已經(jīng)表明是WAIHA，仍然需要進(jìn)行放散檢測：可以確定是否存在藥物依賴性抗體，如果藥物導(dǎo)致，則更換治療藥物。如果放散液中有同種抗體，則可能和抗體鑒定譜細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)。產(chǎn)生DAT/自身對照為陽性的原因不一定全部是患者的抗體引起的，如患者最近輸注了已經(jīng)包被抗體的供者紅細(xì)胞。WAIHA樣本何時進(jìn)行放散23溫自身抗體的特異性大多數(shù)是多特異性抗體，且和Rh系統(tǒng)抗原相關(guān)。用Rhnull或D--細(xì)胞來鑒定。類似特異性：如類似抗-c,抗-e特異性（指此抗體和具有該抗體對應(yīng)抗原的紅細(xì)胞反應(yīng)強度要明顯強于缺乏對應(yīng)抗原的紅細(xì)胞）具有單特異性：如抗-e、抗-c、抗-D、抗-E、抗-C的特異性抗體。其他系統(tǒng)：很少見，如Kidd、Kell、LW、Duffy、Ena等。一般不需要對自身溫抗體進(jìn)行抗體特異性鑒定。因為絕大多數(shù)自身抗體屬于Rh系統(tǒng)的抗體，且具有多特異性，只有少數(shù)具有單特異性。且溫自身抗體鑒定無助于疾病的診斷、治療以及輸血，因此不需要常規(guī)進(jìn)行。溫自身抗體的特異性大多數(shù)是多特異性抗體，且和R24

溫自身抗體與不同Rh型反應(yīng)

紅細(xì)胞Rh血型正常血型部分缺失全部缺失

（cde/cde,等)（-D-/-D-等）（Rhnull)抗-nl+00抗-pdl++0

抗-dl+++溫自身抗體與不同Rh型反應(yīng)25避免溫自身抗體檢出的方法試管方法：LISS-IAT鹽水IAT避免溫自身抗體檢出的方法試管方法：26溫自身抗體的吸收去除自身吸收（近期未輸血）同種吸收：未知患者血型已知患者血型溫自身抗體的吸收去除自身吸收（近期未輸血）27自身吸收DAT陰性自身紅細(xì)胞的化學(xué)處理：ZZAP菠蘿酶或木瓜酶DTT或2-ME酶：菠蘿酶或木瓜酶自身吸收DAT陰性自身紅細(xì)胞28ZZAP處理紅細(xì)胞（1）試劑：1%酶：如無花果酶、菠蘿酶等pH分別為6.5和8.0的PBS0.2M的DTT:1gDTT溶于32.4ml的pH8.0的PBS待吸收血清/血漿2ml自身壓積紅細(xì)胞（DAT陰性）ZZAP試劑：1ml1%的無花果酶、2.5ml0.2MDTT、2mlpH6.5的PBS,混合。ZZAP處理紅細(xì)胞（1）試劑：29ZZAP處理紅細(xì)胞（2）方法：2ml壓積細(xì)胞分裝2管，1ml/管。將1ml壓積細(xì)胞和2mlZZAP試劑混合，37度孵育20~30分鐘，間歇搖勻。鹽水洗滌3次（900~1000g)，除盡末次洗滌上清液。加入待吸收血清，混勻后37度孵育20~45分鐘。離心，上清液轉(zhuǎn)移至另一支含處理后紅細(xì)胞的試管中吸收。用篩選紅細(xì)胞以及自身DAT陰性紅細(xì)胞檢測吸收后血清。ZZAP處理紅細(xì)胞（2）方法：30影響吸收的循環(huán)次數(shù)的因素與血清中抗體的反應(yīng)強度有關(guān)測定抗體的倍比稀釋度，以產(chǎn)生陽性的最后一管來可以用于確立稀釋的循環(huán)次數(shù)。如效價為16，需要準(zhǔn)備4管紅細(xì)胞，吸收4次。影響吸收的循環(huán)次數(shù)的因素與血清中抗體的反應(yīng)強度有關(guān)31確定吸收的循環(huán)次數(shù)（2）測定血清中抗體的反應(yīng)強度吸收循環(huán)次數(shù)為反應(yīng)強度再加1。如IAT反應(yīng)強度為3+，則吸收循環(huán)次數(shù)為4次。確定吸收的循環(huán)次數(shù)（2）測定血清中抗體的反應(yīng)強度32異體吸收

吸收用細(xì)胞血型剩余抗體R1R1,(CCee)-c,-ER2R2,(ccEE)-e,-Crr(ccdee)-D,-C,-E

異體吸收吸收用細(xì)胞血型33異體吸收后檢測（吸收是否完全）吸收后血清檢測用紅細(xì)胞R1R1吸收R2R2吸收rr吸收R1R10R2R20rr0異體吸收后檢測（吸收是否完全）34異體吸收后血清檢測（特異性1）不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2和rr紅細(xì)胞，使用IAT方法檢測，結(jié)果均為陰性，表明：一、溫自家抗體已經(jīng)完全通過異體吸收去除。二、溶貧患者血清中不存在同種抗體。異體吸收后血清檢測（特異性1）不同Rh血型紅細(xì)胞異體35異體吸收后血清檢測（特異性2）不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2、rr紅細(xì)胞以及患者自身DAT陰性的紅細(xì)胞使用IAT方法檢測，結(jié)果出現(xiàn)陽性,表明異體吸收不夠充分，只是反應(yīng)強度減弱，需要繼續(xù)進(jìn)行吸收試驗。

異體吸收后血清檢測（特異性2）不同Rh血型紅細(xì)胞異體36異體吸收后血清檢測（特異性3）不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2和rr紅細(xì)胞，使用IAT方法檢測，結(jié)果出現(xiàn)陽性，而和自身DAT陰性細(xì)胞反應(yīng)為陰性，表明：

存在同種抗體1、用DAT陰性紅細(xì)胞檢測吸收后血清2、用吸收用的紅細(xì)胞檢測用其吸收后的對應(yīng)的血清3、鑒定存在的同種抗體。異體吸收后血清檢測（特異性3）不同Rh血型紅細(xì)胞異體37吸收后血清檢測（特異性4）當(dāng)吸收后血清的反應(yīng)強度沒有減弱，表明自身抗體的對應(yīng)抗原是可以被ZZAP試劑破壞，此時應(yīng)該：

1、用ZZAP或酶處理后的紅細(xì)胞檢測未作吸收的血清。2、用未處理的紅細(xì)胞進(jìn)行吸收。吸收后血清檢測（特異性4）當(dāng)吸收后血清的反應(yīng)強度沒有減38DAT陰性的WAIHA自身抗體屬于低親和力的IgG抗體紅細(xì)胞上結(jié)合的IgG數(shù)量太少，DAT檢測不出來陽性自身抗體屬于IgM性質(zhì)或IgA性質(zhì)DAT陰性的WAIHA自身抗體屬于低親和力的Ig39DAT陰性的WAIHA的檢測（1)

使用增強DAT檢測方法1、冷鹽水洗滌紅細(xì)胞2、冷LISS液洗滌紅細(xì)胞3、PEG-DAT試驗4、聚凝胺-DAT試驗5、ELAT6、流式細(xì)胞儀檢測

DAT陰性的WAIHA的檢測（1)使用增強DAT檢40DAT陰性的WAIHA的檢測(2)抗體檢測的增強方法1、酶方法2、PEG3、微膠柱4、聚凝胺DAT陰性的WAIHA的檢測(2)抗體檢測的增強方法41DAT陰性的WAIHA的檢測（3）放散液檢測：1、濃縮放散液（如1ml細(xì)胞加0.2ml鹽水放散）2、用增強技術(shù)方法檢測放散液PEG微膠柱DAT陰性的WAIHA的檢測（3）放散液檢測：42WAIHA患者的輸血（1）原則建議不要輸血，因為對于WAIHA患者：1、患者機體對于貧血已經(jīng)具有耐受性，除非病人的生命處在危險中，血色素明顯快速下降，已經(jīng)危及到患者生命安全，，否則不要輸血。2、很難找到完全相配合的血液：WAIHA患者輸血要比常規(guī)的輸血治療更加危險，由于很難找到和患者相配合的血液（即缺乏自身抗體相對應(yīng)抗原的血液）；因此輸入的血液和自身血液一樣都是不配合的，且輸入的紅細(xì)胞在體內(nèi)存活期短于自身細(xì)胞。WAIHA患者的輸血（1）原則建議不要輸血，因為對于WAIH43WAIHA患者的輸血（2）3、輸血會引起患者同種免疫，容易產(chǎn)生同種抗體，給以后輸血造成困難。4、輸血有可能導(dǎo)致溶血病情加重：（1）由于自身抗體的存在，很難排除是否存在同種抗體，輸血可能導(dǎo)致輸血反應(yīng)。（2）輸血會促進(jìn)自身抗體的生成，加快溶血速度，且輸入的紅細(xì)胞干擾血清學(xué)檢測。WAIHA患者的輸血（2）3、輸血會引起患者同種免疫，容易產(chǎn)44WAIHA患者的輸血（3）（3）、輸血會抑制患者自身的代償性造血機能，反而加重病情。（4）對于WAIHA患者，溶血也是線性的，即體內(nèi)紅細(xì)胞越多，溶血的就越多，因此輸血增加了患者的血容量，同時造成更多輸入的紅細(xì)胞溶血，產(chǎn)生的血紅蛋白造成患者臟器如腎臟負(fù)擔(dān)加重。WAIHA患者的輸血（3）（3）、輸血會抑制患者自身的45WAIHA患者的輸血（4）血色素超過8g/L的慢性WAIHA患者很少需要輸血，很多5g/L甚至更低的患者也不必輸血治療。當(dāng)患者必須輸血來挽救生命時，需要輸血治療，以提供足夠的攜氧能力，如：患者血色素快速下降，數(shù)值很低且血壓過低血色素快速下降引起的嚴(yán)重貧血患者嚴(yán)重貧血并伴發(fā)心肺疾病患者出現(xiàn)缺氧的癥狀輸注量：以維持足夠攜氧能力的最少量的紅細(xì)胞，且在輸注過程中密切觀察患者情況。WAIHA患者的輸血（4）血色素超過8g/L的慢性WAIHA46WAIHA患者的交叉配血未吸收的原血清,IAT交叉不配合。吸收后血清：配血相合配血不相合WAIHA患者的交叉配血未吸收的原血清,IAT交叉不47WAIHA的血清學(xué)檢測

抗體篩選試驗陽性陰性抗體鑒定同種抗體自身抗體，（同種抗體？）吸收試驗自身吸收異體吸收抗體篩查陽性陰性（無同種抗體）抗體鑒定WAIHA的血清學(xué)檢測48WAIHA的治療輸血治療激素治療（皮質(zhì)固醇類）：阻斷巨噬細(xì)胞清除IgG或C3包被的紅細(xì)胞。靜脈注射免疫球蛋白（IVIG)：通過結(jié)合巨噬細(xì)胞上Fc的受體，來延長包被IgG抗體紅細(xì)胞的壽命。由于競爭抑制機制，使得自身抗體水平下降。脾切除術(shù)免疫抑制劑治療單克隆抗體治療：抗-CD20,WAIHA患者的B淋巴細(xì)胞為CD20陽性。血漿置換：促紅細(xì)胞生成素WAIHA的治療輸血治療49謝謝！謝謝！50溫自家抗體的血清學(xué)檢測北京市紅十字血液中心范道旺溫自家抗體的血清學(xué)檢測北京市紅十字血液中心51溶血性貧血的分類自家免疫性溶血性貧血藥物誘導(dǎo)免疫性溶血性貧血同種免疫引起的免疫性溶血性貧血新生兒溶血溶血性輸血反應(yīng)溶血性貧血的分類自家免疫性溶血性貧血52自家免疫性溶血性貧血溶血類型：所占比例（%）溫自家溶血性貧血（WAIHA）48~70

冷凝集素病（CHD)16~32混合型（即溫型和冷型并發(fā)）7~8突發(fā)性冷型血紅蛋白尿癥（PCH)2，主要見于兒童DAT-陰性溶血性貧血12~18自家免疫性溶血性貧血溶血類型：53免疫性溶血性貧血血清學(xué)特征WAIHACHD混合AIHAPCH藥物誘導(dǎo)占有率48~70%16~32%7~8%2%，主要兒童12~18%DATIgG:單純C3IgG+C3單純C3IgG20~60%91~98%71~100%94~100%94%IgG+C3IgG+C324~63%6%C3:7~14%抗體類型主要IgGIgMIgG,IgMIgGIgG

放散液IgG無IgG無IgG特異性主要是Rh主要抗-I抗-P系統(tǒng)抗體免疫性溶血性貧血血清學(xué)特征WAI54不同AIHA患者DAT反應(yīng)特征

DATIgGC3血清特征

放散液特征WAIHA++57%有IgG自家抗體有IgG,與正常細(xì)胞反應(yīng)+00+CHD0+存在IgM自家抗體無反應(yīng)活性

不同AIHA患者DAT反應(yīng)特征55檢測溫自身抗體的目的用于確定：是否有溫自身抗體致敏在患者自身紅細(xì)胞上患者血清中是否存在溫自身抗體患者血清中是否同時存在同種抗體據(jù)報道：15~40%的有免疫史的WAIHA患者血清中伴隨有同種抗體。檢測溫自身抗體的目的用于確定：56溫自身抗體引發(fā)的血清學(xué)問題ABO定型Rh定型DAT試驗抗體篩查及抗體鑒定自身抗體的評價同種抗體的篩查和鑒定溫自身抗體引發(fā)的血清學(xué)問題ABO定型57自家凝集導(dǎo)致的ABO正反定型不相符

正定（抗體血清）反定（試劑紅細(xì)胞）

抗-A抗-B抗-D陰性對照A細(xì)胞B細(xì)胞w+w+3+w+4+4+對于極端的個例，包被了大量的IgG抗體紅細(xì)胞在定型血清中會發(fā)生自發(fā)的凝集，使用試劑的稀釋液作為陰性對照，可以發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)弱的自發(fā)凝集產(chǎn)生的陽性反應(yīng)，從而干擾定型。一般而言，由于溫自身抗體屬于不完全抗體，即使包被大量此抗體的紅細(xì)胞，正定型時與抗-A或抗-B混合后，也不會自發(fā)凝集。同樣，反定型時血清中的溫自身抗體和反定型紅細(xì)胞在室溫鹽水介質(zhì)也不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。自家凝集導(dǎo)致的ABO正反定型不相符正定（抗體血清）58WAIHA患者的Rh定型由于鹽水介質(zhì)抗-D試劑中添加了增強劑，因此，容易導(dǎo)致包被溫自身抗體的D（-）紅細(xì)胞自發(fā)凝集，產(chǎn)生假陽性，因此必須要用試劑廠商的試劑稀釋液做陰性對照。只有陰性對照為陰性時結(jié)果才可靠(在訂購試劑時要含有陰性對照）。紅細(xì)胞包被的IgG抗體不能通過洗滌而除去，因此，為了準(zhǔn)確定型，必須采用放散的方法來除去包被在紅細(xì)胞上的IgG抗體，得到DAT陰性的紅細(xì)胞來定型。WAIHA患者的Rh定型由于鹽水介質(zhì)抗-D試劑中添59DAT陰性紅細(xì)胞的制備甘氨酸-EDTA法二磷酸氯喹法DAT陰性紅細(xì)胞的制備甘氨酸-EDTA法60甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（1）試劑：10%Na2EDTA0.1M甘氨酸-HCl緩沖液（pH1.5):0.75g甘氨酸溶于100ml生理鹽水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH到1.51.0MTris-NaCl:12.1gtris和5.25gNaCl溶于100ml蒸餾水。甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（1）試劑：61甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（2）方法：待處理紅細(xì)胞鹽水洗滌6次酸化-甘氨酸-EDTA液：甘氨酸-HCl和EDTA按照20：5的體積比混合。在試管中將紅細(xì)胞和酸化-甘氨酸-EDTA液按照10：20體積比充分混合，室溫孵育2~3分鐘。向試管中添加1體積的Tris-NaCl,混勻后于900-1000g離心1分鐘，棄上清液，鹽水洗滌紅細(xì)胞4次。用抗-IgG檢測洗滌后的紅細(xì)胞，確認(rèn)DAT陰性，表明包被在紅細(xì)胞上的IgG抗體已經(jīng)去除。甘氨酸-EDTA法去除IgG抗體（2）方法：62氯喹放散法（1）試劑：二磷酸氯喹：20g二磷酸氯喹溶于100ml鹽水，用1NNaOH調(diào)節(jié)pH到5.1。DAT陽性的紅細(xì)胞（包被IgG）對照細(xì)胞（已知部分血型）抗-IgG血清氯喹放散法（1）試劑：63氯喹放散法（2）方法：0.2ml鹽水洗滌的壓積紅細(xì)胞和0.8ml氯喹液混合。室溫放置30分鐘。同時做對照。取出部分細(xì)胞，鹽水洗滌4次，進(jìn)行DAT試驗，如果DAT為陰性，則放散完成，將全部處理后的細(xì)胞洗滌備用。否則繼續(xù)處理30分鐘后檢測。氯喹放散法（2）方法：64WAIHA的DAT單純IgG抗體引起20~66%IgG+C324~63%單純C37~14%極少數(shù)：IgA或溫反應(yīng)性IgM抗體WAIHA的DAT單純IgG抗體引起65溫自身抗體DAT反應(yīng)結(jié)果多特異性AHG3+~4+抗-IgG3+~4+抗-C30~3+陰性對照0溫自身抗體DAT反應(yīng)結(jié)果多特異性AHG66溫自身抗體的篩選反應(yīng)格局鹽水立即離心37℃IAT

I000～4+II000～4+溫自身抗體的篩選反應(yīng)格局鹽水立即離心67WAIHA的抗體篩查及抗體鑒定患者的病歷信息分析產(chǎn)生DAT陽性的原因只有自家抗體（無免疫史）自家抗體可能合并同種抗體（有免疫史）藥物抗體（治療用藥情況）WAIHA的抗體篩查及抗體鑒定患者的病歷信息68患者的病歷信息臨床診斷原發(fā)性：無任何關(guān)聯(lián)疾病的情形下發(fā)生繼發(fā)性：其他疾病相合并發(fā)生：如淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、其他自家免疫疾病、卵巢腫瘤以及其他慢性炎癥。治療所用藥物有好幾種藥物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生和WAIHA一樣的血清學(xué)反應(yīng)。如：甲基多巴和甲基芐肼。免疫史（輸血史、妊娠史）輸血史對于判定患者血清中的是否存在同種抗體非常重要。據(jù)報道，15~40%的有輸血史或妊娠史的WAIHA患者血清中除自身溫抗體外，還伴隨有同種抗體。患者的病歷信息臨床診斷69WAIHA的抗體篩選和鑒定無免疫史的WAIHA檢測：直接進(jìn)行抗體鑒定，檢測抗體特異性，如果有特異性，選擇無對應(yīng)抗原的血液可以輸用。有免疫史的WAIHA患者檢測：放散試驗吸收試驗：無近期（2~3月內(nèi)）輸血史患者：采用自身吸收近期有輸血史或嚴(yán)重貧血的患者：采用異體吸收抗體篩查及抗體鑒定藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的AIHA，采用放散試驗，檢測放散液WAIHA的抗體篩選和鑒定無免疫史的WAIHA檢測：直接70增強自身抗體強度的方法LISS微膠柱固相化技術(shù)PEG-IAT增強自身抗體強度的方法LISS71自身細(xì)胞放散試驗?zāi)康拇_定是否存在溫自身抗體確定DAT陽性的原因是否是同種抗體引起而不存在溫自身抗體。放散液和一些試劑紅細(xì)胞出現(xiàn)陰性反應(yīng)表明血清中存在特異性同種抗體。確定是否是藥物引起的免疫性溶血性貧血：放散液反應(yīng)陰性可能是藥物依賴性抗體導(dǎo)致的，由于放散液中缺乏藥物，所以產(chǎn)生陰性反應(yīng)。自身細(xì)胞放散試驗?zāi)康拇_定是否存在溫自身抗體72WAIHA樣本何時進(jìn)行放散評估第一個樣本首次放散的目的是來確認(rèn)溫自身抗體引起的WAIHA，從而排除藥物依賴性抗體的干擾。放散液必須和所有的試劑紅細(xì)胞產(chǎn)生典型的陽性反應(yīng)。每個樣本：不需要對WAIHA患者的每一份都進(jìn)行放散，因為血清學(xué)反應(yīng)格局不會因為同一患者不同樣本而輕易發(fā)生改變。簡單的血清學(xué)檢驗已經(jīng)表明是WAIHA，仍然需要進(jìn)行放散檢測：可以確定是否存在藥物依賴性抗體，如果藥物導(dǎo)致，則更換治療藥物。如果放散液中有同種抗體，則可能和抗體鑒定譜細(xì)胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)。產(chǎn)生DAT/自身對照為陽性的原因不一定全部是患者的抗體引起的，如患者最近輸注了已經(jīng)包被抗體的供者紅細(xì)胞。WAIHA樣本何時進(jìn)行放散73溫自身抗體的特異性大多數(shù)是多特異性抗體，且和Rh系統(tǒng)抗原相關(guān)。用Rhnull或D--細(xì)胞來鑒定。類似特異性：如類似抗-c,抗-e特異性（指此抗體和具有該抗體對應(yīng)抗原的紅細(xì)胞反應(yīng)強度要明顯強于缺乏對應(yīng)抗原的紅細(xì)胞）具有單特異性：如抗-e、抗-c、抗-D、抗-E、抗-C的特異性抗體。其他系統(tǒng)：很少見，如Kidd、Kell、LW、Duffy、Ena等。一般不需要對自身溫抗體進(jìn)行抗體特異性鑒定。因為絕大多數(shù)自身抗體屬于Rh系統(tǒng)的抗體，且具有多特異性，只有少數(shù)具有單特異性。且溫自身抗體鑒定無助于疾病的診斷、治療以及輸血，因此不需要常規(guī)進(jìn)行。溫自身抗體的特異性大多數(shù)是多特異性抗體，且和R74

溫自身抗體與不同Rh型反應(yīng)

紅細(xì)胞Rh血型正常血型部分缺失全部缺失

（cde/cde,等)（-D-/-D-等）（Rhnull)抗-nl+00抗-pdl++0

抗-dl+++溫自身抗體與不同Rh型反應(yīng)75避免溫自身抗體檢出的方法試管方法：LISS-IAT鹽水IAT避免溫自身抗體檢出的方法試管方法：76溫自身抗體的吸收去除自身吸收（近期未輸血）同種吸收：未知患者血型已知患者血型溫自身抗體的吸收去除自身吸收（近期未輸血）77自身吸收DAT陰性自身紅細(xì)胞的化學(xué)處理：ZZAP菠蘿酶或木瓜酶DTT或2-ME酶：菠蘿酶或木瓜酶自身吸收DAT陰性自身紅細(xì)胞78ZZAP處理紅細(xì)胞（1）試劑：1%酶：如無花果酶、菠蘿酶等pH分別為6.5和8.0的PBS0.2M的DTT:1gDTT溶于32.4ml的pH8.0的PBS待吸收血清/血漿2ml自身壓積紅細(xì)胞（DAT陰性）ZZAP試劑：1ml1%的無花果酶、2.5ml0.2MDTT、2mlpH6.5的PBS,混合。ZZAP處理紅細(xì)胞（1）試劑：79ZZAP處理紅細(xì)胞（2）方法：2ml壓積細(xì)胞分裝2管，1ml/管。將1ml壓積細(xì)胞和2mlZZAP試劑混合，37度孵育20~30分鐘，間歇搖勻。鹽水洗滌3次（900~1000g)，除盡末次洗滌上清液。加入待吸收血清，混勻后37度孵育20~45分鐘。離心，上清液轉(zhuǎn)移至另一支含處理后紅細(xì)胞的試管中吸收。用篩選紅細(xì)胞以及自身DAT陰性紅細(xì)胞檢測吸收后血清。ZZAP處理紅細(xì)胞（2）方法：80影響吸收的循環(huán)次數(shù)的因素與血清中抗體的反應(yīng)強度有關(guān)測定抗體的倍比稀釋度，以產(chǎn)生陽性的最后一管來可以用于確立稀釋的循環(huán)次數(shù)。如效價為16，需要準(zhǔn)備4管紅細(xì)胞，吸收4次。影響吸收的循環(huán)次數(shù)的因素與血清中抗體的反應(yīng)強度有關(guān)81確定吸收的循環(huán)次數(shù)（2）測定血清中抗體的反應(yīng)強度吸收循環(huán)次數(shù)為反應(yīng)強度再加1。如IAT反應(yīng)強度為3+，則吸收循環(huán)次數(shù)為4次。確定吸收的循環(huán)次數(shù)（2）測定血清中抗體的反應(yīng)強度82異體吸收

吸收用細(xì)胞血型剩余抗體R1R1,(CCee)-c,-ER2R2,(ccEE)-e,-Crr(ccdee)-D,-C,-E

異體吸收吸收用細(xì)胞血型83異體吸收后檢測（吸收是否完全）吸收后血清檢測用紅細(xì)胞R1R1吸收R2R2吸收rr吸收R1R10R2R20rr0異體吸收后檢測（吸收是否完全）84異體吸收后血清檢測（特異性1）不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2和rr紅細(xì)胞，使用IAT方法檢測，結(jié)果均為陰性，表明：一、溫自家抗體已經(jīng)完全通過異體吸收去除。二、溶貧患者血清中不存在同種抗體。異體吸收后血清檢測（特異性1）不同Rh血型紅細(xì)胞異體85異體吸收后血清檢測（特異性2）不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2、rr紅細(xì)胞以及患者自身DAT陰性的紅細(xì)胞使用IAT方法檢測，結(jié)果出現(xiàn)陽性,表明異體吸收不夠充分，只是反應(yīng)強度減弱，需要繼續(xù)進(jìn)行吸收試驗。

異體吸收后血清檢測（特異性2）不同Rh血型紅細(xì)胞異體86異體吸收后血清檢測（特異性3）不同Rh血型紅細(xì)胞異體吸收后的每一份血清分別用R1R1、R2R2和rr紅細(xì)胞，使用IAT方法檢測，結(jié)果出現(xiàn)陽性，而和自身DAT陰性細(xì)胞反應(yīng)為陰性，表明：

存在同種抗體1、用DAT陰性紅細(xì)胞檢測吸收后血清2、用吸收用的紅細(xì)胞檢測用其吸收后的對應(yīng)的血清3、鑒定存在的同種抗體。異體吸收后血清檢測（特異性3）不同Rh血型紅細(xì)胞異體87吸收后血清檢測（特異性4）當(dāng)吸收后血清的反應(yīng)強度沒有減弱，表明自身抗體的對應(yīng)抗原是可以被ZZAP試劑破壞，此時應(yīng)該：

1、用ZZAP或酶處理后的紅細(xì)胞檢測未作吸收的血清。2、用未處理的紅細(xì)胞進(jìn)行吸收。吸收后血清檢測（特異性4）當(dāng)吸收后血清的反應(yīng)強度沒有減88DAT陰性的WAIHA自身抗體屬于低親和力的IgG抗體紅細(xì)胞上結(jié)合的IgG數(shù)量太少，DAT檢測不出來陽性自身抗體屬于IgM性質(zhì)或IgA性質(zhì)DAT陰性的WAIHA自身抗體屬于低親和力的Ig89DAT陰性的WAIHA的檢測（1)

使用增強DAT檢測方法1、冷鹽水洗滌紅細(xì)胞