分子生物學(xué)常用技術(shù)

關(guān)于分子生物學(xué)常用技術(shù)第一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)DNA的物理圖譜DNA序列測定基因芯片第二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量

r:粒子半徑（分子量）η:介質(zhì)粘度

第三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日電泳的用途分離鑒定純度測定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

第四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點(diǎn)應(yīng)用范圍第五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（一）分離核酸原理

電荷效應(yīng)

分子篩效應(yīng)

分子構(gòu)象第六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日1.電荷效應(yīng)核酸是兩性電解質(zhì)

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3

,負(fù)電荷，正極第七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2.分子篩效應(yīng)小分子移動快，大分子移動慢第九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開環(huán)DNA

+-第十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（二）操作要點(diǎn)支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色

DNA片段的回收第十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日1.支持物第十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日商品化的瓊脂糖第十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日瓊脂糖種類普通低熔點(diǎn)高純高篩分熔點(diǎn)80~90℃<70℃80~90℃80~90℃機(jī)械強(qiáng)度中差高高分辨率中差中高第十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2.凝膠濃度的選擇第十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日凝膠的制備第十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日3.DNAmarker第十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日DNAmarker第二十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日DNA長度標(biāo)準(zhǔn)曲線第二十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日4.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)

pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0

第二十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日5.樣品制備上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍(lán)/二甲苯青

第二十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日點(diǎn)樣第二十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日6.電泳條件潛水電泳恒壓電泳

低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓電泳：>幾十V/cm溫度：15~25℃

第二十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日潛水電泳第二十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日7.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EB)

結(jié)構(gòu)及染色原理染色方法加入凝膠液中

電泳結(jié)束后染色第二十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日EB染色原理第二十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第二十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日紫外燈下顯色第三十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日8.DNA片段的回收低熔點(diǎn)瓊脂糖法

透析袋電洗脫法(>5kb)DEAE-纖維素膜法(0.5~5kb)第三十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（三）應(yīng)用范圍

DNA的分離、純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離、鑒定雜交分析

PCR產(chǎn)物的分離鑒定第三十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠電泳第三十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分離原理操作要點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用范圍第三十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（一）分離原理電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)第三十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)

交聯(lián)劑－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)

催化劑－過硫酸胺(AP)

加速劑－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)第三十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠第三十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（二）操作要點(diǎn)凝膠的分類凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測DNA片段的回收第三十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日1.凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA變性凝膠:ssDNA尿素甲酰胺SDS第三十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2.凝膠濃度的選擇第四十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第四十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日3.凝膠液的配制

試劑(ml)制備濃度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第四十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日PAGE裝置第四十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第四十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第四十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第四十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日電泳第四十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日4.凝膠中DNA的檢測溴乙錠染色法

銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

第四十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日5.DNA片段的回收壓碎浸泡法<1kb

純度高，回收率低第四十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（三）PAGE優(yōu)點(diǎn)機(jī)械強(qiáng)度好、化學(xué)穩(wěn)定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高

第五十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日（四）PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)的檢測和分析第五十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術(shù)第五十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日一、分子雜交的基本原理核酸的變性和復(fù)性第五十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日分子雜交DNA-DNA第五十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日DNA-RNA第五十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日雜交條件靶分子探針雜交袋雜交爐第五十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日雜交種類被檢核酸種類和方法原位雜交斑點(diǎn)雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應(yīng)介質(zhì)液相雜交固相雜交()第五十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日二、固相支持物固相支持物的特性結(jié)合能力強(qiáng)不影響雜交反應(yīng)結(jié)合牢固非特異性吸附少機(jī)械性能良好

第五十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日固相支持物的種類硝酸纖維素濾膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龍膜(nylonmembrane)第五十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日1.硝酸纖維素濾膜

特點(diǎn)吸附ssDNA和RNA

雜交信號本底低不足不適于重復(fù)雜交濾膜較脆不適于電轉(zhuǎn)移印跡法對DNA小片段(<200bp)結(jié)合能力弱第六十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2.尼龍膜特點(diǎn)結(jié)合能力強(qiáng)

可反復(fù)雜交

韌性強(qiáng)

適于電轉(zhuǎn)移印跡法對DNA小片段(10bp)結(jié)合能力強(qiáng)不足雜交信號本底較高

第六十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日分子生物學(xué)考試時間：2005.1.11(晚7:00-9:00)地點(diǎn)9教講演廳(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地點(diǎn)：逸夫樓3樓生化實(shí)驗(yàn)室第六十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、探針(probe)探針的概念探針的類型

標(biāo)記物的種類標(biāo)記方法第六十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日1.探針的概念特異結(jié)合和檢測靶分子的活性物質(zhì)抗原－抗體配體－受體同源DNA/RNA第六十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2.探針的類型基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針蛋白質(zhì)或多肽探針第六十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日3.標(biāo)記物的種類放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性標(biāo)記物生物素地高辛熒光素酶

第六十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日4.核酸探針的放射性標(biāo)記方法

DNA缺口平移標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法

DNA的5’末端標(biāo)記

第六十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日缺口翻譯特點(diǎn)均一標(biāo)記制備dsDNA探針第六十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日隨機(jī)引物標(biāo)記法(randompriming)

隨機(jī)引物6nt含有各種可能的排列順序特點(diǎn)放射比活性>缺口翻譯操作簡便DNA/cDNA探針第六十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第七十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日DNA的5’末端標(biāo)記(5’endlabeling)

堿性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶標(biāo)記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA/RNA探針

第七十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日DNA的5’末端標(biāo)記第七十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、Southern雜交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印跡(blotting):轉(zhuǎn)移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting

第七十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日1.印跡的方法

毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法

電轉(zhuǎn)移法

真空轉(zhuǎn)移法

第七十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法第七十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日電轉(zhuǎn)移法第七十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日真空轉(zhuǎn)移法第七十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第七十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2.Southern雜交的步驟第七十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日3.Southern雜交的應(yīng)用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP第八十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日五、Northern雜交

RNAblotting

步驟

總RNA/mRNA→變性電泳分離→轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影/化學(xué)顯色

應(yīng)用檢測組織/細(xì)胞中mRNA的大小、量比較不同組織/細(xì)胞中基因的表達(dá)情況

第八十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日Northern雜交第八十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日六、Western雜交免疫印跡(immunoblotting)

SDS→轉(zhuǎn)移→蛋白－第一抗體→標(biāo)記的第二抗體(探針)→檢測

應(yīng)用蛋白質(zhì)的定性定量分析第八十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第八十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日免疫印跡第八十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日

Southern,Northern&Western

待測物質(zhì)

支持物

探針

轉(zhuǎn)移方式Southern

DNANC單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Northern

RNANC/尼龍單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Western

蛋白質(zhì)NC/PVDF

抗體電轉(zhuǎn)移

第八十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日七、原位雜交

(insituhybridization)定義種類細(xì)胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交

基本程序細(xì)胞/組織固定預(yù)雜交雜交沖洗雜交信號檢測分析結(jié)果

第八十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日組織切片第八十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第八十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日八、斑點(diǎn)雜交

(dothybridization)

第九十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第三節(jié)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)PCR的發(fā)展簡史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應(yīng)用第九十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日一、PCR的發(fā)展簡史1971年,Korana提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想1985年,Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)1988年,PE-Cetus公司推出了第一臺PCR儀第九十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復(fù)制三個步驟變性(denaturation)

退火(annealing)

延伸(extension)

第九十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日PCR的原理第九十四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物cycle

12345n長片段

246810短片段

002822長＋短

21222324252n第九十五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4種dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U總體積：100ul第九十六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第九十七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日三、PCR的影響因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP

Mg2+循環(huán)條件

第九十八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日模板

DNARNAcDNA對模板的純度要求低第九十九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日引物長度：15～30nt

G+C含量：40~60%

堿基的隨機(jī)分布避免引物自身和引物之間的互補(bǔ)引物的3’端引物的5’端引物濃度：0.2~1umol/L

第一百頁，共一百三十頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul

－20℃保存最后加

第一百零一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日底物4種dNTP

的濃度相等終濃度：200umol/L

第一百零二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日Mg2+

濃度:1.5～2.0mmol/L

過高:非特異擴(kuò)增

過低:反應(yīng)產(chǎn)物減少第一百零三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日循環(huán)條件變性溫度和時間:90~96℃,30~60s退火溫度和時間:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸溫度和時間70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循環(huán)次數(shù):25～35

第一百零四頁，共一百三十頁，2022年，8月28日四、PCR的種類反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR(insituPCR)實(shí)時PCR(realtimePCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)第一百零五頁，共一百三十頁，2022年，8月28日原位PCR原位雜交＋PCR程序固定細(xì)胞/組織樣品→PCR前處理→PCR擴(kuò)增→原位雜交及檢測

第一百零六頁，共一百三十頁，2022年，8月28日實(shí)時PCR的原理第一百零七頁，共一百三十頁，2022年，8月28日五、PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)研究臨床醫(yī)學(xué)第一百零八頁，共一百三十頁，2022年，8月28日分子生物學(xué)研究基因克隆

DNA序列測定基因的體外定點(diǎn)突變

突變分析(PCR-SSCP)

基因定量

第一百零九頁，共一百三十頁，2022年，8月28日臨床醫(yī)學(xué)病原體診斷

遺傳病的基因診斷

腫瘤檢測

法醫(yī)學(xué)

第一百一十頁，共一百三十頁，2022年，8月28日第四節(jié)DNA序列測定

Sanger雙脫氧鏈終止法(1977)

Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法(1977)第一百一十一頁，共一百三十頁，2022年，8月28日Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復(fù)制

反應(yīng)條件模板引物

dNTP（其中一種帶放射性標(biāo)記）

ddNTP

DNA聚合酶第一百一十二頁，共一百三十頁，2022年，8月28日DNA的復(fù)制第一百一十三頁，共一百三十頁，2022年，8月28日2’,3’-雙脫氧核苷酸(ddN