蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

2.6.2肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?directional)肽鏈的一端有游離氨基，稱氨基末端（或N末端

N-terminal），另一端有游離羧基，稱羧基末端（或C末端C-terminal)；肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“—”表示肽鍵。如：H2N－絲氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸-COOH寫為：Ser-Leu-Phe（或S-L-F）前述五肽：絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸寫為：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu（或S-G-Y-A-L）H2N--COOH第一頁，共五十一頁。肽鍵縮合第二頁，共五十一頁。2.6.3所有肽鏈的共價(jià)主鏈結(jié)構(gòu)都是相同的肽鏈中的骨架結(jié)構(gòu)是由單位重復(fù)連接而成，稱共價(jià)主鏈（mainchainorbackbone)；HH―N―C―C―OR不同肽鏈的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的排列順序不同；相同的氨基酸組成可形成多種不同的多肽鏈第三頁，共五十一頁。問題1：每種肽鏈都有相同的分子骨架，試分析多肽分子骨架有哪些結(jié)構(gòu)特征？第四頁，共五十一頁。問題2：寫出這一肽鏈的結(jié)構(gòu)和名稱,這四種氨基酸還可以組成幾種寡肽？第五頁，共五十一頁。2.6.4肽鏈末端羧基、末端氨基及側(cè)鏈基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離，表現(xiàn)出重要的理化性質(zhì)在pH1～14范圍內(nèi)，主鏈上肽鍵氨基不發(fā)生解離，游離末端的-COOH和-NH2以及側(cè)鏈R上的基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離；各基團(tuán)解離程度及肽所帶的總電荷取決于所處溶液的pH值；對(duì)于指定的基團(tuán)，其pH＜pKa時(shí)，不發(fā)生酸式解離，pH＞pKa時(shí)，發(fā)生酸式解離，pH=pKa時(shí)，解離與不解離各占一半，由此可確定肽鏈所帶凈電荷.第六頁，共五十一頁。問題3：肽鏈中可解離基團(tuán)的（α-COOH，α-NH2及側(cè)鏈可解離基團(tuán)）pKa與游離氨基酸中對(duì)應(yīng)基團(tuán)的pKa值有何不同？為什么？問題4：叢肽鏈的組成與結(jié)構(gòu)分析多肽有哪些主要性質(zhì)？第七頁，共五十一頁。肽具有等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值可改變肽的帶電狀況，使肽不帶電荷而處于等電狀態(tài)時(shí)的pH值為肽的等電點(diǎn)肽等電點(diǎn)的差別可不同程度反映其氨基酸組成上的差異；反之亦然。等電狀態(tài)時(shí)，肽在電場(chǎng)中不向任何一方移動(dòng)不同大小的肽片斷可用雙向凝膠電泳進(jìn)行分離肽鏈中的解離基團(tuán)可被滴定，但肽的滴定曲線復(fù)雜短肽以離子晶體存在，具有較高的熔點(diǎn)肽鍵上的基團(tuán)具有相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)活性。第八頁，共五十一頁。2.6.5許多短肽具有重要的生物活性

——天然存在的活性肽作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素或神經(jīng)調(diào)節(jié)物；如LHRH-類10肽(蛙的一種神經(jīng)遞質(zhì))，促甲狀腺素釋放因子，腦啡肽，內(nèi)啡肽，強(qiáng)啡肽等作為抗體：短桿菌肽A，短桿菌肽S等；作為激素：胰島素、胰高血糖素、促腎上腺皮質(zhì)激素等；作為防御性毒物：劇毒的鵝膏蕈堿、蛇毒、蛛毒等第九頁，共五十一頁。體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽促甲狀腺素釋放激素TRF焦谷氨酸組氨酸脯氨酰胺第十頁，共五十一頁。谷胱甘肽（glutathione，GSH）谷氨酸半胱氨酸甘氨酸SHCOO-CH2CH2CCNH3HHOOCNHCHCH2CONHCH2OGSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+第十一頁，共五十一頁。L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，稱作：aspartame第十二頁，共五十一頁。2.7.1多肽與蛋白質(zhì)的概念不完全相同Thetermproteinbroadlydefinesmoleculescomposedofoneormorepolypeptidechains;Thetermpolypeptideisusedtodefinethechainexceedsseveraldozenaminoacidsinlength(lessthan50aminoacidresidues);Thetermspolypeptideandproteinareusedinterchangeablyindiscussingsinglepolypeptidechain.問題5：試簡述蛋白質(zhì)的重要生物學(xué)功能？2.7蛋白質(zhì)是由一條或幾條多肽鏈組成的具有特定空間結(jié)構(gòu)和功能的生物大分子第十三頁，共五十一頁。2.7.2根據(jù)蛋白質(zhì)的組成、或含多肽鏈數(shù)目或形狀可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行不同的分類單純蛋白質(zhì)(simpleprotein)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)+非蛋白質(zhì)(輔基)(prostheticgroup)(conjugatedprotein)輔基種類很廣，常見的有色素化合物、寡糖、脂類、磷酸、金屬離子甚至核酸根據(jù)組成不同蛋白質(zhì)可分為第十四頁，共五十一頁。根據(jù)蛋白質(zhì)形狀可分為球狀蛋白與纖維狀蛋白：纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)球狀蛋白質(zhì)(globularprotein)肌動(dòng)蛋白毛發(fā)中的角蛋白蠶絲絲心蛋白第十五頁，共五十一頁。根據(jù)含多肽鏈數(shù)目可分為單體蛋白和多體蛋白寡聚蛋白(oligomericprotein)

或多體蛋白(multimericprotein)單體蛋白(monomericprotein)異型多體蛋白(heteromultimericprotein)同型多體蛋白(homomultimericprotein)寡聚蛋白中的每一個(gè)具三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱亞基(subunit)第十六頁，共五十一頁。應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去;2.8.1多數(shù)球狀蛋白質(zhì)溶于水形成膠體溶液蛋白質(zhì)溶膠性質(zhì)：a.質(zhì)點(diǎn)大小在膠體范圍：1～100nm

b.丁達(dá)爾效應(yīng)c.布朗運(yùn)動(dòng)d.不能透過半透膜2.8根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點(diǎn)可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定第十七頁，共五十一頁。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素，將促使蛋白質(zhì)沉淀析出第十八頁，共五十一頁。蛋白質(zhì)處于PI時(shí)，凈電荷為零。溶解度最低不同蛋白質(zhì)

↓等電點(diǎn)不同↓調(diào)節(jié)pH值將蛋白質(zhì)彼此分開等電點(diǎn)沉淀和pH控制:第十九頁，共五十一頁。隨著鹽濃度的升高，如飽和或半飽和時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，相互聚集而從水溶液中沉淀析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。解釋：大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來的溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。常用的中性鹽：（NH4)2SO4特點(diǎn)：保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象——蛋白質(zhì)分離、提純常用方法。2.8.3加入大量中性鹽可使蛋白質(zhì)沉淀析出低濃度時(shí)，中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶原因：蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，且與水分子相互作用加強(qiáng)；第二十頁，共五十一頁。2.8.4有機(jī)溶劑分級(jí)分離法：作用原理：

①有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個(gè)相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)的表面可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。②有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體形成并沉淀。第二十一頁，共五十一頁。2.8.5離子交換層析原理：樣品中各蛋白質(zhì)組分的凈電荷、分子大小不同，與固定相間的作用力不同而被分離洗脫方法：改變洗脫劑的鹽濃度、PH值依次洗脫結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來分離效果與溶液中的離子強(qiáng)度、pH有關(guān)常用固定相：離子化纖維素――羧甲基纖維素（CM），二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素

優(yōu)點(diǎn)：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，及較大的表面積，大分子可以自由通過

交換容量大,洗脫條件溫和,回收率高。離子化葡聚糖――交聯(lián)葡聚糖作基質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：交換容量比離子交換纖維素大3－4倍。第二十二頁，共五十一頁。Cation-exchangecolumnpH=5.0時(shí)，基質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白組分帶不同電荷逐漸提高洗脫液的pH值，各組分以此被洗脫下來問：洗脫順序？第二十三頁，共五十一頁。即分子排阻層析（也稱凝膠過濾層析，分子篩層析）2.8.6凝膠過濾：原理：凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外。隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。不同分子大小路徑不同洗脫：大分子--先洗脫出來小分子--后洗脫出來第二十四頁，共五十一頁。第二十五頁，共五十一頁。2.8.7親和層析基礎(chǔ)：基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合）蛋白質(zhì)樣品加入到連有配基的基質(zhì)中（固定相）↓目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合，吸附在瓊質(zhì)糖顆粒上

↙↘

其它蛋白質(zhì)先被洗脫下來結(jié)合在基質(zhì)上的蛋白可用由配體溶液洗脫第二十六頁，共五十一頁。Affinitychromatography第二十七頁，共五十一頁。對(duì)某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH時(shí)，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，這一pH稱蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷，電場(chǎng)中移向正極pH＜pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷，電場(chǎng)中移向負(fù)極pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)不帶靜電荷，電場(chǎng)中不移動(dòng)。2.8.8利用蛋白質(zhì)的帶電性可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)在(PAGE)介質(zhì)中電泳時(shí)，其遷移率第二十八頁，共五十一頁。聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量巰基乙醇SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：則電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量(q/r），而與電荷和分子形狀無關(guān)。第二十九頁，共五十一頁。①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時(shí)均以同樣的電荷/分子質(zhì)量比向正極移動(dòng)。②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長軸長度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。③可用來測(cè)量蛋白質(zhì)的分子量第三十頁，共五十一頁。區(qū)帶電泳：外加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH處，形成區(qū)帶。第三十一頁，共五十一頁。測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法：凱氏定氮法：紫外吸收法雙縮脲法：Folin-酚試劑法（Lowry法）：考馬斯亮藍(lán)法（現(xiàn)最常用的方法）：膠體金法：帶負(fù)電的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍(lán)色，靈敏度最高第三十二頁，共五十一頁。蛋白質(zhì)具有多個(gè)結(jié)構(gòu)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)——二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)

——生物功能蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序——也稱共價(jià)結(jié)構(gòu)。共價(jià)肽鍵是一級(jí)結(jié)構(gòu)的唯一連接方式多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)決定著蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能2.9蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定——即蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸序列的測(cè)定高級(jí)結(jié)構(gòu)第三十三頁，共五十一頁。測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈；測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成；分析多肽鏈的N末端和C末端（方法很多）斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵；多肽鏈斷裂成肽段；測(cè)定各個(gè)多肽段的氨基酸順序；確定肽段在多肽鏈中的次序；確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略第三十四頁，共五十一頁。測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量Mr

很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，如：滲透壓、擴(kuò)散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過濾、凝膠電泳等，測(cè)定末端氨基酸數(shù)xX÷(m/Mr)=n(蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目)（m為樣品質(zhì)量）變性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高濃度鹽溶液如有二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過氧乙酸處理凝膠過濾或電泳分離不同肽鏈蛋白質(zhì)中多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)中多肽鏈數(shù)目的確定第三十五頁，共五十一頁。多肽鏈的拆分第三十六頁，共五十一頁。氨基酸組成分析酸水解：堿水解：甲基磺酸水解：優(yōu)點(diǎn)：不破壞色氨酸，經(jīng)堿中和后可直接上機(jī)自動(dòng)分析缺點(diǎn)：不能有碳水化合物存在中和點(diǎn)不易掌握計(jì)算出各種氨基酸分子比多肽鏈分子量確定氨基酸組成第三十七頁，共五十一頁。末端氨基酸分析N末端氨基酸分析丹黃酰氯法(DNS)：優(yōu)點(diǎn)：可直接層析或電泳分離，熒光檢測(cè)定性定量；靈敏度高(較二硝基氟苯法高100倍)

二硝基氟苯(DNFBorFDNB)法氨肽酶法第三十八頁，共五十一頁。多肽—OC—CH—NH2+R+HCI弱堿性+DNS-氨基酸酸水解游離氨基酸有機(jī)溶劑萃取溶于水定量+定性確定N末端氨基酸確定肽鏈數(shù)目多肽—OC—CH—NH—RDNS-氨基酸第三十九頁，共五十一頁。將肽鏈裂解成小片斷要求：斷裂點(diǎn)較少，專一性較強(qiáng)、產(chǎn)率高酶裂解法：常用的酶：胰蛋白酶：僅斷裂Lys、Arg羧基形成的肽鍵（但）糜蛋白酶：位點(diǎn)：Tyr、Phe、Trp羧基肽鍵胃蛋白酶：位點(diǎn)：兩種疏水性氨基酸形成的肽鍵嗜熱菌蛋白酶：專一性較差金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：化學(xué)裂解法：溴化氰法：專一性斷裂蛋氨酸羧基形成的肽鍵第四十頁，共五十一頁?？傻玫胶线m大小的肽片斷第四十一頁，共五十一頁。Cyanogenbromide(溴化氰法）第四十二頁，共五十一頁。肽段氨基酸序列的測(cè)定Edman降解法：一次可連續(xù)測(cè)定60~70個(gè)氨基酸；程序復(fù)雜，工作量大；酶降解法：質(zhì)譜法：第四十三頁，共五十一頁。Edman降解法測(cè)定N-末端氨基酸EdmanreagentPTC-多肽少一個(gè)N-末端氨基酸的肽鏈層析色譜鑒定重復(fù)①②③與DNS法聯(lián)合①②③第四十四頁，共五十一頁。肽片斷在多肽鏈中排列次序的確定(見p179)第四十五頁，共五十一頁。多肽鏈中二硫鍵位置的確定第四十六頁，共五十一頁。多肽鏈氨基酸系列的直接測(cè)定：