中藥復(fù)方現(xiàn)代化藥理研究方法進(jìn)展課件

中藥復(fù)方現(xiàn)代化

藥理研究方法進(jìn)展

王樹榮山東中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室1中藥復(fù)方現(xiàn)代化

藥理研究方法進(jìn)展王樹榮1*

中藥復(fù)方是指在中醫(yī)辨證審因決定治法以后，選擇合適的藥物酌定藥物用量，按照組方原則妥善配伍而成的一組藥物。其所含化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用具有多靶位、多層次的特點(diǎn)，而且干擾因素眾多；因此復(fù)方中藥藥理研究的難度頗大。近年來，中藥復(fù)方藥理研究尤其在方法學(xué)研究方面取得了一定的進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)許多行之有效的而且比較成熟的中藥復(fù)方藥理研究方法。

2*中藥復(fù)方是指在中醫(yī)辨證審因決定治法以后，選擇合*在藥效學(xué)研究方面主要可以分為全方研究和拆方研究?jī)纱箢?，其中拆方研究又分為?jiǎn)單拆方法、撤藥拆方分析法及正交設(shè)計(jì)法。在藥動(dòng)學(xué)研究方面主要有體內(nèi)藥物濃度法及生物效應(yīng)法兩大類研究方法，生物效應(yīng)法又包括藥物累積法、藥理效應(yīng)法和微生物指標(biāo)法。本文僅將目前中藥復(fù)方藥理研究方法新進(jìn)展作一綜述并對(duì)今后發(fā)展概況作一分析。3*在藥效學(xué)研究方面主要可以分為全方研究和拆方研究一、體外細(xì)胞培養(yǎng)

隨著細(xì)胞生物學(xué)與生化技術(shù)的不斷發(fā)展，體外藥理研究方法以其需時(shí)短、實(shí)驗(yàn)條件和干擾因素容易控制，便于進(jìn)行相對(duì)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以避免實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)問題等優(yōu)點(diǎn)而得到迅速的發(fā)展。由于體外實(shí)驗(yàn)的受試對(duì)象多為細(xì)胞，對(duì)于復(fù)方中藥，無論直接添加藥物還是制成含藥血清間接添加均有較高的要求。直接添加的復(fù)方中藥制劑一般要求制備成水煎液或水提醇沉液，并經(jīng)過過濾、濃縮、調(diào)節(jié)PH、微孔濾膜或高溫除菌；間接添加法的含藥血清的制備則是先給供體臨床等效劑量的藥物，然后按通法或標(biāo)準(zhǔn)法確定的時(shí)間采血并分離血清，將含藥血清或由此制備的凍干粉加入反應(yīng)系統(tǒng)，使之達(dá)到需要濃度。4一、體外細(xì)胞培養(yǎng)隨著細(xì)胞生物學(xué)與生化技術(shù)的不斷*

體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可采用外周血單核細(xì)胞、血小板、巨嗜細(xì)胞，也可采用體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞；與含有藥物的培養(yǎng)液共同孵育一定時(shí)間后，根據(jù)對(duì)細(xì)胞的增殖、產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性以及細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)的差異顯示進(jìn)行觀察?，F(xiàn)在人們已經(jīng)應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法從分子基因水平研究了多種復(fù)方對(duì)免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞作用的機(jī)理。5*體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可采用外周血單核細(xì)胞、血小板、*目前體外細(xì)胞培養(yǎng)方法的主要問題在于培育合適的病理細(xì)胞模型，建立指標(biāo)檢測(cè)方法；另外需要考慮細(xì)胞體外生長(zhǎng)規(guī)律，確定最佳的用藥時(shí)間和細(xì)胞濃度。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及中醫(yī)證本質(zhì)的深入研究，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備細(xì)胞模型將極大的推動(dòng)中藥復(fù)方的藥理研究。6*目前體外細(xì)胞培養(yǎng)方法的主要問題在于培育合適的病二、中藥血清藥理學(xué)

中藥血清藥理學(xué)是指在動(dòng)物經(jīng)口服給藥后的一定時(shí)間采血分離血清，用此含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種研究方法。中藥血清藥理學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)在于：①它克服了中藥粗提物本身理化性質(zhì)如雜質(zhì)、酸堿度、滲透壓、pH值等對(duì)實(shí)驗(yàn)的直接干擾，使體外培養(yǎng)系統(tǒng)與細(xì)胞原先所處的內(nèi)環(huán)境基本相同；②它克服了復(fù)方的體內(nèi)代謝物或機(jī)體反應(yīng)物等有效成分引起的假陰性及機(jī)體非吸收物質(zhì)的體外作用造成的假陽性，體現(xiàn)了復(fù)方藥物的體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化效應(yīng)。

7二、中藥血清藥理學(xué)中藥血清藥理學(xué)是指在動(dòng)物經(jīng)口*中藥血清藥理學(xué)是一種體內(nèi)與體外相結(jié)合，研究中藥藥理作用的實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)，其特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)有較好的一致性，能夠通過有效成分在血中的動(dòng)態(tài)變化更好的反映中藥復(fù)方的配伍原則和藥物的量效關(guān)系，而且還能反映有可能由藥物誘導(dǎo)的機(jī)體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用及中藥和其可能的代謝產(chǎn)物的藥理作用，為中藥復(fù)方的藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

8*中藥血清藥理學(xué)是一種體內(nèi)與體外相結(jié)合，研究中藥*

近幾年，我國科技工作者對(duì)血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了一系列的研究，其中包括：整體動(dòng)物的選擇和給藥時(shí)間劑量研究、給藥方案及采血時(shí)間的研究、含藥血清滅活與保存的研究、血清添加量與對(duì)照組設(shè)立的研究等方面，使該基本方法、實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)一步規(guī)范完善。

9*近幾年，我國科技工作者對(duì)血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)*

無疑中藥血清藥理學(xué)方法的出現(xiàn)，使中藥復(fù)方藥理效應(yīng)的研究不再局限于整體的功能性研究，而可以從細(xì)胞、分子、基因水平上對(duì)復(fù)方的作用機(jī)理加以研究。目前，含藥血清的藥效觀察已用于器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和基因表達(dá)等方面；其中以細(xì)胞藥效學(xué)研究最多，細(xì)胞的種類涉及到單核細(xì)胞、造血細(xì)胞等近二十種。10*無疑中藥血清藥理學(xué)方法的出現(xiàn)，使中藥復(fù)方藥理*雖然應(yīng)用血清藥理學(xué)方法在復(fù)方研究中取得了一些進(jìn)展，但仍舊具有一定的局限性；作為一種尚不成熟的實(shí)驗(yàn)方法，還需要發(fā)展完善。例如，由于技術(shù)原因，含藥血清在培養(yǎng)液中的濃度一般不能超過10%（？）；這使得體外培養(yǎng)難以達(dá)到體內(nèi)的真實(shí)血藥濃度；而且含藥血清材料來自不同生理病理的個(gè)體，會(huì)出現(xiàn)含藥血清的差異；而且經(jīng)過體內(nèi)反應(yīng)，藥物含量進(jìn)一步被稀釋，成分會(huì)更加復(fù)雜，增加了質(zhì)量控制的難度。血清中部分物質(zhì)已是藥物作用于機(jī)體細(xì)胞的反應(yīng)；如果細(xì)胞存在著反饋機(jī)制，血清二次重復(fù)作用于細(xì)胞，將可能掩蓋含藥血清的實(shí)際作用。含藥血清對(duì)離體系統(tǒng)同樣也有干擾，如血清本身對(duì)體外酶活性的影響等。因此，含藥血清的中藥藥理研究方法不可能完全替代在體動(dòng)物的中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法。11*雖然應(yīng)用血清藥理學(xué)方法在復(fù)方研究中取得了一些進(jìn)*對(duì)于中藥復(fù)方體外藥理研究而言，復(fù)方提取物直接添加和制備成含藥血清間接添加各自有其優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)研究中，如果將兩者緊密地結(jié)合起來，不僅有助于揭示中藥復(fù)方在胃腸內(nèi)處置過程中活性成分的轉(zhuǎn)化與改變，而且有利于中藥真正有效活性部位、有效成分的發(fā)現(xiàn)，為新藥開發(fā)提供基礎(chǔ)。12*對(duì)于中藥復(fù)方體外藥理研究而言，復(fù)方提取物直接添三、中藥腦脊液藥理學(xué)方法

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障的存在，使得神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的微觀生存環(huán)境和屏障以外的其他細(xì)胞有很大的區(qū)別。為了研究一種合理有效的中藥作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥效學(xué)研究方法，梅建勛等人利用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，以3種不同濃度觀察血清、含藥血清、腦脊液、含藥腦脊液對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用含藥腦脊液進(jìn)行中藥對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥效觀察明顯優(yōu)于含藥血清。因此，提出“腦脊液藥理學(xué)概念”。13三、中藥腦脊液藥理學(xué)方法由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏*中藥可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用，如采用血清藥理學(xué)方法，那么血清本身的毒害作用將掩蓋藥效作用，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；而如果采用腦脊液，則可以避免上述缺陷，同時(shí)由于腦脊液中真正含有通透血腦屏障的成分，從而增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

14*中藥可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用，如采用四、腸內(nèi)菌代謝研究法

口服的中藥成分在消化道內(nèi)與腸內(nèi)菌群相互作用，一些成分經(jīng)相應(yīng)細(xì)菌代謝轉(zhuǎn)換后被機(jī)體吸收。例如大黃及番瀉的主要瀉下成分番瀉苷靜注時(shí)無瀉下作用，口服后則產(chǎn)生作用。小橋恭一等通過對(duì)大鼠及人腸內(nèi)菌群的研究，認(rèn)為番瀉苷經(jīng)番瀉苷代謝酶水解為番瀉苷院元，又被消化道鏈球菌代謝酶NADH-黃素還原酶還原為有活性的大黃酸蒽酮。另外蘆薈苷、去羥梔子苷、芍藥苷、人參皂苷與柴胡皂苷也是被腸內(nèi)菌分別代謝為活性物質(zhì)而發(fā)揮作用的。15四、腸內(nèi)菌代謝研究法口服的中藥成分在消化道內(nèi)*另有一些成分則以原形被吸收，在肝臟解毒后經(jīng)膽汁排泄，與腸內(nèi)菌群發(fā)生結(jié)合裂解等代謝轉(zhuǎn)換再次被吸收。例如靜脈注射的甘草甜素排泄到膽汁中，在腸內(nèi)水解生成甘草次酸后方被吸收而發(fā)揮作用。黃芩苷在腸內(nèi)菌群作用下代謝轉(zhuǎn)換為黃芩素后被吸收，再通過小腸粘膜細(xì)胞中的UDPG-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶復(fù)原為黃芩苷后被轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈。而有的成分不被胃腸吸收直接被排泄掉。16*另有一些成分則以原形被吸收，在肝臟解毒后經(jīng)膽汁排*劉鐵漢等用放射免疫測(cè)定方法比較淫羊藿苷及其腸菌代謝產(chǎn)物對(duì)人組織細(xì)胞瘤THP-1細(xì)胞分泌4種細(xì)胞因子的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，淫羊藿苷及其腸菌代謝產(chǎn)物對(duì)各種炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生均有特異性調(diào)節(jié)作用。通過對(duì)藥物腸內(nèi)菌群代謝的研究，有助于發(fā)現(xiàn)天然前體藥物，揭示中藥復(fù)方的真正作用成分，推動(dòng)藥物動(dòng)力學(xué)的研究。17*劉鐵漢等用放射免疫測(cè)定方法比較淫羊藿苷及其腸菌代謝五、證治藥動(dòng)學(xué)方法

黃熙等人提出“證治藥動(dòng)學(xué)”假說，并在此理論的指導(dǎo)下進(jìn)行了研究。證治藥動(dòng)學(xué)可分為“復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)”和“辨證藥動(dòng)學(xué)”兩部分。復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)是指方劑的藥物配伍（君、臣、佐、使）能顯著影響彼此在體內(nèi)化學(xué)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并與療效和毒副作用密切相關(guān)，能驗(yàn)證中醫(yī)“相須、相使”等七情理論是否正確。18五、證治藥動(dòng)學(xué)方法黃熙等人提出“證治藥動(dòng)學(xué)”*辨證藥動(dòng)學(xué)是指藥物在不同證者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有顯著差異，這種差異與療效和毒副作用顯著相關(guān)，經(jīng)辨證施治后這種差異可以減輕或消失；并在此基礎(chǔ)上提出了“脾主藥動(dòng)學(xué)”和“血淤證治藥動(dòng)學(xué)”新假說?！捌⒅魉巹?dòng)學(xué)”認(rèn)為：脾主運(yùn)化，主管藥物的分布、代謝和排泄；脾虛失健運(yùn)者存在著胃腸動(dòng)力學(xué)障礙、腸道菌群失調(diào)、酶系統(tǒng)的改變等都將影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄過程。19*辨證藥動(dòng)學(xué)是指藥物在不同證者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有*“血淤證治藥動(dòng)學(xué)”主要包括“血淤辨證藥動(dòng)學(xué)”和“活血化淤復(fù)方藥動(dòng)學(xué)”兩方面內(nèi)容；前者指同一藥物在血淤證者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，有顯著差異；后者主要分析活血化淤方劑藥動(dòng)學(xué)，復(fù)方中的君臣佐使和劑量加重和減輕將嚴(yán)重影響其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，這種影響所引起的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，有顯著意義。20*“血淤證治藥動(dòng)學(xué)”主要包括“血淤辨證藥動(dòng)學(xué)”和*“證治藥動(dòng)學(xué)”的創(chuàng)新之處在于：

①能定量定性，二維和三維色鋪、四譜、氣—質(zhì)和液—質(zhì)聯(lián)用儀，特別適用于復(fù)方體內(nèi)多組分的快速定性定量。近年來對(duì)復(fù)方藥動(dòng)學(xué)的研究已充分說明了這一點(diǎn)；②與母方療效有關(guān)。方劑效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)必然是方劑進(jìn)入體內(nèi)的化學(xué)成分及其相關(guān)成分；③能測(cè)到的物質(zhì)數(shù)目有限；只有能被胃腸液溶出的而且被吸收利用的具有生理活性的成分才是有效成分，而且任何強(qiáng)效物質(zhì)均要達(dá)到一定量才能具有意義；④藥物之間存在著藥動(dòng)學(xué)相互作用并與療效有關(guān)；有人證明甘草悟用芍藥可明顯提高體內(nèi)甘草酸的濃度；⑤與機(jī)體相互作用后可產(chǎn)生新的生理活性物質(zhì)。例如有的成分經(jīng)腸內(nèi)菌群代謝生成活性物質(zhì)而被吸收入血；⑥能被機(jī)體獨(dú)特的處置；其中前3個(gè)要素是研究復(fù)方效應(yīng)成分藥理學(xué)的3個(gè)不可缺少的先決條件。

21*“證治藥動(dòng)學(xué)”的創(chuàng)新之處在于：①能定量定性，*辨證藥動(dòng)學(xué)除概念外，還包括機(jī)體可能存在著鮮為人知的處置中藥復(fù)方的特殊規(guī)律；因此又提出方劑體內(nèi)/血清成分譜/靶成分概念。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在脾虛大鼠中，大鼠處于典型的“濃、粘、凝、聚”的血淤狀態(tài)，腸道菌群在量方面存在著異常；與健康者比較脾虛血淤大鼠的磷酸川芎嗪灌胃后在體內(nèi)的空間處置狀態(tài)由雙室型變?yōu)閱问夷Ｐ?，空間“轉(zhuǎn)運(yùn)”速率明顯加快，吸收加快，生物利用度增強(qiáng)，分布減少；而四君子湯可以恢復(fù)脾虛大鼠異常的磷酸川芎嗪的體內(nèi)過程特性。以上結(jié)果為驗(yàn)證“辨證藥動(dòng)學(xué)”假說提供了科學(xué)依據(jù)。薄荷醇能增加柴胡鎮(zhèn)痛成分的吸收，使吸收率增大，吸收相半衰期縮短，達(dá)峰時(shí)間提前，驗(yàn)證了“復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)”。

22*辨證藥動(dòng)學(xué)除概念外，還包括機(jī)體可能存在著鮮為人六、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)

組學(xué)研究方法

生命科學(xué)的進(jìn)步，尤其是基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)及基因芯片技術(shù)的研究，不僅給現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶來新機(jī)遇，也為中藥復(fù)方現(xiàn)代化研究帶來極好的機(jī)遇和契機(jī)?；蚪M學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)將成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究、方劑復(fù)雜物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機(jī)理研究的最佳平臺(tái)及切入點(diǎn)。23六、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)

*中藥復(fù)方突出的特點(diǎn)是活性多組分、作用多途徑、多靶點(diǎn)。對(duì)治療疾病的認(rèn)識(shí)，突出的是多層次、多臟器、多水平的調(diào)理過程。而以整體和全局為出發(fā)點(diǎn)的前沿科學(xué)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)有著天然的親和性?，F(xiàn)代研究認(rèn)為人類的疾病不管是單基因遺傳病還是腫瘤，不管是慢性病還是傳染病，都直接或間接與人類的基因有關(guān)。所使用的藥物除了直接殺滅病原體的藥物外，都直接或間接地通過影響、調(diào)整、修飾、改變?nèi)祟惢虻谋磉_(dá)與產(chǎn)物的功效而產(chǎn)生效應(yīng)的。研究表明，藥動(dòng)學(xué)與遺傳及基因異常相關(guān)；證也與遺傳基因相關(guān)并且可以用基因工程方法復(fù)制出證的動(dòng)物模型。遺傳基因的組成不同可以構(gòu)成不同的個(gè)體藥動(dòng)學(xué)特征；機(jī)體病理生理狀態(tài)不同可以得出不同的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。這對(duì)于掌握不同機(jī)體對(duì)藥物的作用規(guī)律、設(shè)計(jì)合理的個(gè)體化用藥方案具有重要作用。

24*中藥復(fù)方突出的特點(diǎn)是活性多組分、作用多途徑、多*因此，可以設(shè)想采用基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)及生物信息學(xué)等方法對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行多靶點(diǎn)的超高通量篩選，研究中藥復(fù)方對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。將中藥復(fù)方的多組分、多靶點(diǎn)、多途徑作用特點(diǎn)與基因、蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)起來，比較各自的不同表達(dá)差異譜，確定不同有效成分的對(duì)應(yīng)基因及蛋白表達(dá)靶點(diǎn)，并根據(jù)表達(dá)量的多少與復(fù)方的君臣佐使理論和用藥劑量相關(guān)聯(lián)；同時(shí)分析不同有效成分對(duì)應(yīng)基因及蛋白靶點(diǎn)的相互作用，分析各組成復(fù)方的單味藥之間的密切關(guān)系，闡明復(fù)方的組成原理。

25*因此，可以設(shè)想采用基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)束語對(duì)于中藥復(fù)方藥理學(xué)的研究，科研人員提出了各種假說并進(jìn)行了有益的探索。但是中藥復(fù)方治病的物質(zhì)基礎(chǔ)是其的有效化學(xué)成分；只有認(rèn)清中藥復(fù)方的化學(xué)成分，才能真正搞清其作用機(jī)理。因此，中藥復(fù)方藥理學(xué)的研究必須與復(fù)方的有效成分研究結(jié)合起來。如將中藥血清藥化學(xué)與中藥血清藥理學(xué)協(xié)同研究。26結(jié)束語對(duì)于中藥復(fù)方藥理學(xué)的研究，科研人員提出*同時(shí)，在進(jìn)行藥效學(xué)研究時(shí)，與中藥有效成分藥動(dòng)學(xué)—藥效學(xué)同步分析且與統(tǒng)一模型相結(jié)合，同時(shí)檢測(cè)多種成分的血藥濃度變化以及藥效變化，建立藥效—藥動(dòng)—時(shí)間三維模型，研究其相關(guān)性，將具有更高的科學(xué)價(jià)值。此外，中藥復(fù)方藥理學(xué)的研究離不開相關(guān)學(xué)科技術(shù)的支持，它需要物理學(xué)、植物化學(xué)、分析化學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科的交叉滲透。中藥復(fù)方藥理學(xué)的研究應(yīng)盡量采用新的技術(shù)和方法，才有可能揭示復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理，揭示中藥配伍的深刻內(nèi)涵以及規(guī)律。27*同時(shí)，在進(jìn)行藥效學(xué)研究時(shí)，與中藥有效成分藥動(dòng)學(xué)*

敬請(qǐng)批評(píng)指正

28*敬請(qǐng)28中藥復(fù)方現(xiàn)代化

藥理研究方法進(jìn)展

王樹榮山東中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室29中藥復(fù)方現(xiàn)代化

藥理研究方法進(jìn)展王樹榮1*

中藥復(fù)方是指在中醫(yī)辨證審因決定治法以后，選擇合適的藥物酌定藥物用量，按照組方原則妥善配伍而成的一組藥物。其所含化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用具有多靶位、多層次的特點(diǎn)，而且干擾因素眾多；因此復(fù)方中藥藥理研究的難度頗大。近年來，中藥復(fù)方藥理研究尤其在方法學(xué)研究方面取得了一定的進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)許多行之有效的而且比較成熟的中藥復(fù)方藥理研究方法。

30*中藥復(fù)方是指在中醫(yī)辨證審因決定治法以后，選擇合*在藥效學(xué)研究方面主要可以分為全方研究和拆方研究?jī)纱箢?，其中拆方研究又分為?jiǎn)單拆方法、撤藥拆方分析法及正交設(shè)計(jì)法。在藥動(dòng)學(xué)研究方面主要有體內(nèi)藥物濃度法及生物效應(yīng)法兩大類研究方法，生物效應(yīng)法又包括藥物累積法、藥理效應(yīng)法和微生物指標(biāo)法。本文僅將目前中藥復(fù)方藥理研究方法新進(jìn)展作一綜述并對(duì)今后發(fā)展概況作一分析。31*在藥效學(xué)研究方面主要可以分為全方研究和拆方研究一、體外細(xì)胞培養(yǎng)

隨著細(xì)胞生物學(xué)與生化技術(shù)的不斷發(fā)展，體外藥理研究方法以其需時(shí)短、實(shí)驗(yàn)條件和干擾因素容易控制，便于進(jìn)行相對(duì)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以避免實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)問題等優(yōu)點(diǎn)而得到迅速的發(fā)展。由于體外實(shí)驗(yàn)的受試對(duì)象多為細(xì)胞，對(duì)于復(fù)方中藥，無論直接添加藥物還是制成含藥血清間接添加均有較高的要求。直接添加的復(fù)方中藥制劑一般要求制備成水煎液或水提醇沉液，并經(jīng)過過濾、濃縮、調(diào)節(jié)PH、微孔濾膜或高溫除菌；間接添加法的含藥血清的制備則是先給供體臨床等效劑量的藥物，然后按通法或標(biāo)準(zhǔn)法確定的時(shí)間采血并分離血清，將含藥血清或由此制備的凍干粉加入反應(yīng)系統(tǒng)，使之達(dá)到需要濃度。32一、體外細(xì)胞培養(yǎng)隨著細(xì)胞生物學(xué)與生化技術(shù)的不斷*

體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可采用外周血單核細(xì)胞、血小板、巨嗜細(xì)胞，也可采用體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞；與含有藥物的培養(yǎng)液共同孵育一定時(shí)間后，根據(jù)對(duì)細(xì)胞的增殖、產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性以及細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)的差異顯示進(jìn)行觀察?，F(xiàn)在人們已經(jīng)應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法從分子基因水平研究了多種復(fù)方對(duì)免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞作用的機(jī)理。33*體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可采用外周血單核細(xì)胞、血小板、*目前體外細(xì)胞培養(yǎng)方法的主要問題在于培育合適的病理細(xì)胞模型，建立指標(biāo)檢測(cè)方法；另外需要考慮細(xì)胞體外生長(zhǎng)規(guī)律，確定最佳的用藥時(shí)間和細(xì)胞濃度。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及中醫(yī)證本質(zhì)的深入研究，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備細(xì)胞模型將極大的推動(dòng)中藥復(fù)方的藥理研究。34*目前體外細(xì)胞培養(yǎng)方法的主要問題在于培育合適的病二、中藥血清藥理學(xué)

中藥血清藥理學(xué)是指在動(dòng)物經(jīng)口服給藥后的一定時(shí)間采血分離血清，用此含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種研究方法。中藥血清藥理學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)在于：①它克服了中藥粗提物本身理化性質(zhì)如雜質(zhì)、酸堿度、滲透壓、pH值等對(duì)實(shí)驗(yàn)的直接干擾，使體外培養(yǎng)系統(tǒng)與細(xì)胞原先所處的內(nèi)環(huán)境基本相同；②它克服了復(fù)方的體內(nèi)代謝物或機(jī)體反應(yīng)物等有效成分引起的假陰性及機(jī)體非吸收物質(zhì)的體外作用造成的假陽性，體現(xiàn)了復(fù)方藥物的體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化效應(yīng)。

35二、中藥血清藥理學(xué)中藥血清藥理學(xué)是指在動(dòng)物經(jīng)口*中藥血清藥理學(xué)是一種體內(nèi)與體外相結(jié)合，研究中藥藥理作用的實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)，其特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)有較好的一致性，能夠通過有效成分在血中的動(dòng)態(tài)變化更好的反映中藥復(fù)方的配伍原則和藥物的量效關(guān)系，而且還能反映有可能由藥物誘導(dǎo)的機(jī)體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用及中藥和其可能的代謝產(chǎn)物的藥理作用，為中藥復(fù)方的藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

36*中藥血清藥理學(xué)是一種體內(nèi)與體外相結(jié)合，研究中藥*

近幾年，我國科技工作者對(duì)血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了一系列的研究，其中包括：整體動(dòng)物的選擇和給藥時(shí)間劑量研究、給藥方案及采血時(shí)間的研究、含藥血清滅活與保存的研究、血清添加量與對(duì)照組設(shè)立的研究等方面，使該基本方法、實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)一步規(guī)范完善。

37*近幾年，我國科技工作者對(duì)血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)*

無疑中藥血清藥理學(xué)方法的出現(xiàn)，使中藥復(fù)方藥理效應(yīng)的研究不再局限于整體的功能性研究，而可以從細(xì)胞、分子、基因水平上對(duì)復(fù)方的作用機(jī)理加以研究。目前，含藥血清的藥效觀察已用于器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和基因表達(dá)等方面；其中以細(xì)胞藥效學(xué)研究最多，細(xì)胞的種類涉及到單核細(xì)胞、造血細(xì)胞等近二十種。38*無疑中藥血清藥理學(xué)方法的出現(xiàn)，使中藥復(fù)方藥理*雖然應(yīng)用血清藥理學(xué)方法在復(fù)方研究中取得了一些進(jìn)展，但仍舊具有一定的局限性；作為一種尚不成熟的實(shí)驗(yàn)方法，還需要發(fā)展完善。例如，由于技術(shù)原因，含藥血清在培養(yǎng)液中的濃度一般不能超過10%（？）；這使得體外培養(yǎng)難以達(dá)到體內(nèi)的真實(shí)血藥濃度；而且含藥血清材料來自不同生理病理的個(gè)體，會(huì)出現(xiàn)含藥血清的差異；而且經(jīng)過體內(nèi)反應(yīng)，藥物含量進(jìn)一步被稀釋，成分會(huì)更加復(fù)雜，增加了質(zhì)量控制的難度。血清中部分物質(zhì)已是藥物作用于機(jī)體細(xì)胞的反應(yīng)；如果細(xì)胞存在著反饋機(jī)制，血清二次重復(fù)作用于細(xì)胞，將可能掩蓋含藥血清的實(shí)際作用。含藥血清對(duì)離體系統(tǒng)同樣也有干擾，如血清本身對(duì)體外酶活性的影響等。因此，含藥血清的中藥藥理研究方法不可能完全替代在體動(dòng)物的中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法。39*雖然應(yīng)用血清藥理學(xué)方法在復(fù)方研究中取得了一些進(jìn)*對(duì)于中藥復(fù)方體外藥理研究而言，復(fù)方提取物直接添加和制備成含藥血清間接添加各自有其優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)研究中，如果將兩者緊密地結(jié)合起來，不僅有助于揭示中藥復(fù)方在胃腸內(nèi)處置過程中活性成分的轉(zhuǎn)化與改變，而且有利于中藥真正有效活性部位、有效成分的發(fā)現(xiàn)，為新藥開發(fā)提供基礎(chǔ)。40*對(duì)于中藥復(fù)方體外藥理研究而言，復(fù)方提取物直接添三、中藥腦脊液藥理學(xué)方法

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障的存在，使得神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的微觀生存環(huán)境和屏障以外的其他細(xì)胞有很大的區(qū)別。為了研究一種合理有效的中藥作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥效學(xué)研究方法，梅建勛等人利用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，以3種不同濃度觀察血清、含藥血清、腦脊液、含藥腦脊液對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用含藥腦脊液進(jìn)行中藥對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥效觀察明顯優(yōu)于含藥血清。因此，提出“腦脊液藥理學(xué)概念”。41三、中藥腦脊液藥理學(xué)方法由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏*中藥可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用，如采用血清藥理學(xué)方法，那么血清本身的毒害作用將掩蓋藥效作用，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；而如果采用腦脊液，則可以避免上述缺陷，同時(shí)由于腦脊液中真正含有通透血腦屏障的成分，從而增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

42*中藥可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用，如采用四、腸內(nèi)菌代謝研究法

口服的中藥成分在消化道內(nèi)與腸內(nèi)菌群相互作用，一些成分經(jīng)相應(yīng)細(xì)菌代謝轉(zhuǎn)換后被機(jī)體吸收。例如大黃及番瀉的主要瀉下成分番瀉苷靜注時(shí)無瀉下作用，口服后則產(chǎn)生作用。小橋恭一等通過對(duì)大鼠及人腸內(nèi)菌群的研究，認(rèn)為番瀉苷經(jīng)番瀉苷代謝酶水解為番瀉苷院元，又被消化道鏈球菌代謝酶NADH-黃素還原酶還原為有活性的大黃酸蒽酮。另外蘆薈苷、去羥梔子苷、芍藥苷、人參皂苷與柴胡皂苷也是被腸內(nèi)菌分別代謝為活性物質(zhì)而發(fā)揮作用的。43四、腸內(nèi)菌代謝研究法口服的中藥成分在消化道內(nèi)*另有一些成分則以原形被吸收，在肝臟解毒后經(jīng)膽汁排泄，與腸內(nèi)菌群發(fā)生結(jié)合裂解等代謝轉(zhuǎn)換再次被吸收。例如靜脈注射的甘草甜素排泄到膽汁中，在腸內(nèi)水解生成甘草次酸后方被吸收而發(fā)揮作用。黃芩苷在腸內(nèi)菌群作用下代謝轉(zhuǎn)換為黃芩素后被吸收，再通過小腸粘膜細(xì)胞中的UDPG-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶復(fù)原為黃芩苷后被轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈。而有的成分不被胃腸吸收直接被排泄掉。44*另有一些成分則以原形被吸收，在肝臟解毒后經(jīng)膽汁排*劉鐵漢等用放射免疫測(cè)定方法比較淫羊藿苷及其腸菌代謝產(chǎn)物對(duì)人組織細(xì)胞瘤THP-1細(xì)胞分泌4種細(xì)胞因子的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，淫羊藿苷及其腸菌代謝產(chǎn)物對(duì)各種炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生均有特異性調(diào)節(jié)作用。通過對(duì)藥物腸內(nèi)菌群代謝的研究，有助于發(fā)現(xiàn)天然前體藥物，揭示中藥復(fù)方的真正作用成分，推動(dòng)藥物動(dòng)力學(xué)的研究。45*劉鐵漢等用放射免疫測(cè)定方法比較淫羊藿苷及其腸菌代謝五、證治藥動(dòng)學(xué)方法

黃熙等人提出“證治藥動(dòng)學(xué)”假說，并在此理論的指導(dǎo)下進(jìn)行了研究。證治藥動(dòng)學(xué)可分為“復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)”和“辨證藥動(dòng)學(xué)”兩部分。復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)是指方劑的藥物配伍（君、臣、佐、使）能顯著影響彼此在體內(nèi)化學(xué)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并與療效和毒副作用密切相關(guān)，能驗(yàn)證中醫(yī)“相須、相使”等七情理論是否正確。46五、證治藥動(dòng)學(xué)方法黃熙等人提出“證治藥動(dòng)學(xué)”*辨證藥動(dòng)學(xué)是指藥物在不同證者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有顯著差異，這種差異與療效和毒副作用顯著相關(guān)，經(jīng)辨證施治后這種差異可以減輕或消失；并在此基礎(chǔ)上提出了“脾主藥動(dòng)學(xué)”和“血淤證治藥動(dòng)學(xué)”新假說?！捌⒅魉巹?dòng)學(xué)”認(rèn)為：脾主運(yùn)化，主管藥物的分布、代謝和排泄；脾虛失健運(yùn)者存在著胃腸動(dòng)力學(xué)障礙、腸道菌群失調(diào)、酶系統(tǒng)的改變等都將影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄過程。47*辨證藥動(dòng)學(xué)是指藥物在不同證者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有*“血淤證治藥動(dòng)學(xué)”主要包括“血淤辨證藥動(dòng)學(xué)”和“活血化淤復(fù)方藥動(dòng)學(xué)”兩方面內(nèi)容；前者指同一藥物在血淤證者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，有顯著差異；后者主要分析活血化淤方劑藥動(dòng)學(xué)，復(fù)方中的君臣佐使和劑量加重和減輕將嚴(yán)重影響其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，這種影響所引起的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，有顯著意義。48*“血淤證治藥動(dòng)學(xué)”主要包括“血淤辨證藥動(dòng)學(xué)”和*“證治藥動(dòng)學(xué)”的創(chuàng)新之處在于：

①能定量定性，二維和三維色鋪、四譜、氣—質(zhì)和液—質(zhì)聯(lián)用儀，特別適用于復(fù)方體內(nèi)多組分的快速定性定量。近年來對(duì)復(fù)方藥動(dòng)學(xué)的研究已充分說明了這一點(diǎn)；②與母方療效有關(guān)。方劑效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)必然是方劑進(jìn)入體內(nèi)的化學(xué)成分及其相關(guān)成分；③能測(cè)到的物質(zhì)數(shù)目有限；只有能被胃腸液溶出的而且被吸收利用的具有生理活性的成分才是有效成分，而且任何強(qiáng)效物質(zhì)均要達(dá)到一定量才能具有意義；④藥物之間存在著藥動(dòng)學(xué)相互作用并與療效有關(guān)；有人證明甘草悟用芍藥可明顯提高體內(nèi)甘草酸的濃度；⑤與機(jī)體相互作用后可產(chǎn)生新的生理活性物質(zhì)。例如有的成分經(jīng)腸內(nèi)菌群代謝生成活性物質(zhì)而被吸收入血；⑥能被機(jī)體獨(dú)特的處置；其中前3個(gè)要素是研究復(fù)方效應(yīng)成分藥理學(xué)的3個(gè)不可缺少的先決條件。

49*“證治藥動(dòng)學(xué)”的創(chuàng)新之處在于：①能定量定性，*辨證藥動(dòng)學(xué)除概念外，還包括機(jī)體可能存在著鮮為人知的處置中藥復(fù)方的特殊規(guī)律；因此又提出方劑體內(nèi)/血清成分譜/靶成分概念。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在脾虛大鼠中，大鼠處于典型的“濃、粘、凝、聚”的血淤狀態(tài)，腸道菌群在量方面存在著異常；與健康者比較脾虛血淤大鼠的磷酸川芎嗪灌胃后在體內(nèi)的空間處置狀態(tài)由雙室型變?yōu)閱问夷Ｐ?，空間“轉(zhuǎn)運(yùn)”速率明顯加快，吸收加快，生物利用度增強(qiáng)，分布減少；而四君子湯可以恢復(fù)脾虛大鼠異常的磷酸川芎嗪的體內(nèi)過程特性。以上結(jié)果為驗(yàn)證“辨證藥動(dòng)學(xué)”假說提供了科學(xué)依據(jù)。薄荷醇能增加柴胡鎮(zhèn)痛成分的吸收，使吸收率增大，吸收相半衰期縮短，達(dá)峰時(shí)間提前，驗(yàn)證了“復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)”。

50*辨證藥動(dòng)學(xué)除概念外，還包括機(jī)體可能存在著鮮為人六、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)

組學(xué)研究方法

生命科學(xué)的進(jìn)步，尤其是基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)及基因芯片技術(shù)的研究，不僅給現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶來新機(jī)遇，也為中藥復(fù)方現(xiàn)代化研究帶來極好的機(jī)遇