微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件

發(fā)育——從生長(zhǎng)到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過程，這一過程稱為發(fā)育。個(gè)體生長(zhǎng)——微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個(gè)體生長(zhǎng)。群體生長(zhǎng)——群體中個(gè)體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓?、體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長(zhǎng)來反映個(gè)體生長(zhǎng)的狀況）個(gè)體生長(zhǎng)個(gè)體繁殖群體生長(zhǎng)群體生長(zhǎng)=個(gè)體生長(zhǎng)+個(gè)體繁殖發(fā)育——從生長(zhǎng)到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從量變1在微生物學(xué)中把從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng)。在微生物學(xué)中培養(yǎng)和發(fā)酵兩個(gè)概念是相同。在工業(yè)上大規(guī)模的進(jìn)行微生物培養(yǎng)稱為微生物發(fā)酵。微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件2第一節(jié)微生物生長(zhǎng)測(cè)定描述不同種類、不同生長(zhǎng)狀態(tài)的微生物生長(zhǎng)情況，需選用不同的測(cè)定指標(biāo)。（一）微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)法直接法（血球計(jì)數(shù)板、比例計(jì)數(shù)法）間接法（活菌計(jì)數(shù)法、液體稀釋法、膜過濾法）（二）微生物生長(zhǎng)量和生理指標(biāo)測(cè)定法直接法(干重法，堆體積法)間接法（比濁法，碳、氮含量法，其它生理指標(biāo)）第一節(jié)微生物生長(zhǎng)測(cè)定描述不同種類、不同生長(zhǎng)狀態(tài)的微生物生長(zhǎng)3一、直接計(jì)數(shù)法1、顯微計(jì)數(shù)法（血球計(jì)數(shù)板法）原理：將1cm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。一、直接計(jì)數(shù)法4適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對(duì)酵母菌可同時(shí)測(cè)定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適5微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件6微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件7

2、比濁法（比色發(fā)）原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便；但易受干擾。2、比濁法（比色發(fā)）原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中8

3.平板菌落計(jì)數(shù)法技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無(wú)菌操作；注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的微生物；誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作。3.平板菌落計(jì)數(shù)法9微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件104、干重測(cè)定法將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12—10-13g。該法適合菌濃較高的樣品。如大腸桿菌一個(gè)細(xì)胞一般重約10–12~10–13g，液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2×109個(gè)/ml時(shí)，100ml培養(yǎng)物可得10~90mg干重的細(xì)胞。4、干重測(cè)定法11

5、菌絲長(zhǎng)度測(cè)定法該法適用于對(duì)絲狀真菌生長(zhǎng)長(zhǎng)度的測(cè)定。方法：將真菌接種在固體培養(yǎng)基的平皿中央，定時(shí)測(cè)定菌落的直徑或面積，直到菌落覆蓋整個(gè)平皿。缺點(diǎn)：不能反映菌絲的縱向生長(zhǎng)，不能計(jì)算菌落的厚度和培養(yǎng)集中的菌絲。接種量也能影響結(jié)果，不能反映菌絲的總量。也可用U型管培養(yǎng)法，該法方便不易污染，但通氣不良。5、菌絲長(zhǎng)度測(cè)定法12

6、細(xì)胞堆積體積測(cè)定法方法：將細(xì)胞懸浮液裝入毛細(xì)沉淀管內(nèi)，離心，根據(jù)堆積體積計(jì)算含菌量。該法快速、簡(jiǎn)便，培養(yǎng)液中如有其他固體顆粒，則誤差較大。也可以用有刻度的離心管離心，通過所得的沉淀體積推算出細(xì)胞的質(zhì)量。6、細(xì)胞堆積體積測(cè)定法13

7、電子計(jì)數(shù)器法方法：在計(jì)數(shù)器中放有電解質(zhì)及兩個(gè)電極，將電極一端放入帶微孔的小管，通電抽真空，使含有菌體的電解質(zhì)從小孔進(jìn)入管內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞通過小孔時(shí)，電阻增大，電阻增大會(huì)引起脈沖變化，則每個(gè)細(xì)胞通過時(shí)均被記錄下來。因樣品的體積已知，故可以計(jì)算菌體的濃度，同時(shí)菌體的大小與電阻的大小成正比。該方法方便、快捷，但不能測(cè)定含有顆粒的菌液，對(duì)鏈狀和絲狀菌無(wú)效。7、電子計(jì)數(shù)器法148、液體稀釋法8、液體稀釋法159、薄膜過濾計(jì)數(shù)法常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。9、薄膜過濾計(jì)數(shù)法常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微16

10、涂片染色法應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適

于土壤、牛奶中細(xì)菌計(jì)數(shù)。方法：用鏡臺(tái)測(cè)微尺計(jì)算出視野面積；取

0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計(jì)數(shù)后代入公式：每ml原菌液含菌數(shù)=視野中平均菌數(shù)×涂布面積/視野面積×100×稀釋倍數(shù)10、涂片染色法應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適

17二、間接測(cè)定法1、測(cè)定細(xì)胞的組分含量進(jìn)行估算（1）測(cè)定DNA的含量（2）測(cè)定蛋白質(zhì)的含量（3）測(cè)定ATP的含量二、間接測(cè)定法18

2、從培養(yǎng)基中的某營(yíng)養(yǎng)物的消耗來估算

3、從菌體代謝產(chǎn)物來估算

4、從發(fā)酵液的黏度來估算

5、從發(fā)酵的放熱量估算

6、從發(fā)酵液的酸堿度來估算2、從培養(yǎng)基中的某營(yíng)養(yǎng)物的消耗來估算19測(cè)含氮量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測(cè)含氮量就可推知微生物的濃度。一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測(cè)得粗蛋白的含量。含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。測(cè)含氮量20第二節(jié)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律

由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個(gè)體生長(zhǎng)存在著技術(shù)上的困難。同步生長(zhǎng)的概念：一個(gè)細(xì)胞群體中各個(gè)細(xì)胞都在同一時(shí)間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長(zhǎng)，進(jìn)行同步分裂的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞。同步細(xì)胞群體在任何一時(shí)刻都處在細(xì)胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料。第二節(jié)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律由于微生物細(xì)胞極其微小21微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件22獲得同步生長(zhǎng)的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機(jī)選擇，不影響細(xì)胞代謝。獲得同步生長(zhǎng)的方法主要有兩類：23一、單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)曲線單細(xì)胞微生物主要包括細(xì)菌和酵母菌，其群體生長(zhǎng)是以群體中細(xì)胞數(shù)量的增加來表示的，由一個(gè)細(xì)胞分裂成為兩個(gè)細(xì)胞的時(shí)間間隔稱為世代，一個(gè)世代所需的時(shí)間就是代時(shí)，代時(shí)也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大一倍所需時(shí)間，有時(shí)也稱為倍增時(shí)間。單位時(shí)間內(nèi)繁殖的代數(shù)成為生長(zhǎng)速率。一、單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)曲線單細(xì)胞微生物主要包括24

圖中表示的是一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過若干代分裂后的情況。從圖可見，每經(jīng)過一個(gè)代時(shí)，細(xì)胞數(shù)目就增加一倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長(zhǎng)，這就是單細(xì)胞群體生長(zhǎng)的特征。

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以細(xì)菌為例介紹單細(xì)胞微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律，其結(jié)論也基本適用于酵母菌。生長(zhǎng)曲線代表了細(xì)菌在新的環(huán)境中從開始生長(zhǎng)、分裂直至死亡的整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。每種細(xì)菌都有各自的典型生長(zhǎng)曲線，但它們的生長(zhǎng)過程卻有著共同的規(guī)律性。一般可以將生長(zhǎng)曲線劃分為四個(gè)時(shí)期。以細(xì)菌為例介紹單細(xì)胞微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律，其結(jié)論也基本26生長(zhǎng)曲線：把少量的細(xì)菌接種到合適的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定單位體積的細(xì)胞數(shù)，并繪制所得的曲線：以細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，得出細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中的曲線圖。根據(jù)生長(zhǎng)曲線的變化規(guī)律，可分為延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個(gè)階段。生長(zhǎng)曲線：27微生物的生長(zhǎng)規(guī)律

延滯期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期衰亡期

單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律延滯期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期28

微生物的生長(zhǎng)曲線微生物的生長(zhǎng)曲線29將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長(zhǎng)數(shù)目的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在30

1、延遲期是微生物細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境的適應(yīng)時(shí)期，也是細(xì)胞調(diào)整其大分子和小分子物質(zhì)的組成（包括酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分）又稱為調(diào)整期。微生物延遲期的長(zhǎng)短以細(xì)菌、酵母較短，霉菌次之，放線菌最長(zhǎng)。

其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期。1、延遲期31現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)=0；細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)；細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)；合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；對(duì)外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素、化學(xué)藥物、輻射等）原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物?，F(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。32影響延滯期長(zhǎng)短的因素菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短。接種物菌齡：用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接種時(shí)，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期。接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）。培養(yǎng)基成分：在營(yíng)養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)短；接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長(zhǎng)，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。影響延滯期長(zhǎng)短的因素菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲33對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；采取的縮短延遲期的措施有：①增加接種量；（群體優(yōu)勢(shì)----適應(yīng)性增強(qiáng)）②采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。④選用繁殖快的菌種在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；34

2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期代時(shí)以G表示，生長(zhǎng)速率已R表示，設(shè)t1時(shí)刻的菌數(shù)為N1，經(jīng)過n次分裂后，t2時(shí)刻的菌數(shù)為N2

2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期35微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件36例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B），經(jīng)4h（t）后增加到49，000，000（b），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12借助于n和t，還可以計(jì)算出不同培養(yǎng)條件下的代時(shí)G，G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時(shí)為20分鐘。在4小時(shí)內(nèi)共繁殖了12代。例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B），經(jīng)37代時(shí)能夠反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，代時(shí)短，生長(zhǎng)速率快，代時(shí)長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率慢。在很多微生物學(xué)研究中常常要了解微生物的代時(shí)。代時(shí)在不同種微生物中的變化很大，多數(shù)微生物的代時(shí)為1~3h,然而有些快速生長(zhǎng)的微生物的代時(shí)還不到10min,而另一些微生物的代時(shí)卻可長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)或幾天；另外，同一種微生物，在不同的生長(zhǎng)條件下其代時(shí)的長(zhǎng)短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代時(shí)是恒定的，因此它是微生物菌種的一個(gè)重要特征。代時(shí)能夠反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，代時(shí)短，生長(zhǎng)速率快，代時(shí)38

一些細(xì)菌的代時(shí)菌名 培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度代時(shí)E.coli（大腸桿菌） 肉湯 37℃17minE.coli 牛奶 3712.5Enterobacteraerogenes（產(chǎn)氣腸細(xì)菌） 肉湯或牛奶3716~18E.aerogenes 組合3729~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯3018B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 3766~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 3726S.lactis 乳糖肉湯3748Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌） 肉湯 3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25344~46Mycobacteriumtuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合 37792~93Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌） 組合 271200一些細(xì)菌的代時(shí)菌名 39

不同溫度下的代時(shí)溫度對(duì)微生物的代時(shí)有明顯影響：E.Coli在不同溫度下的代時(shí)溫度（℃） 代時(shí)（分） 溫度（℃） 代時(shí)（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77不同溫度下的代時(shí)溫度對(duì)微生物的代時(shí)有明40

現(xiàn)象：細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。特點(diǎn)：（1）生長(zhǎng)速率常數(shù)最大，即代時(shí)最短；（2）細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致；（3）代謝最旺盛；（4）細(xì)胞對(duì)理化因素較敏感影響因素：（1）菌種（2）營(yíng)養(yǎng)成分（3）營(yíng)養(yǎng)物濃度（4）培養(yǎng)溫度微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件41對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：①由于此時(shí)期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長(zhǎng)該期，以達(dá)到較高的菌體密度③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期④是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：42營(yíng)養(yǎng)物濃度與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量作用方式：影響微生物的生長(zhǎng)速率和總生長(zhǎng)量。生長(zhǎng)限制因子：凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率和菌體產(chǎn)量的營(yíng)養(yǎng)物就稱生長(zhǎng)限制因子。8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長(zhǎng)速度和最大收獲量受影響時(shí)間營(yíng)養(yǎng)物濃度與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量作用方式：影響微生物的生長(zhǎng)速433、穩(wěn)定期又稱：恒定期或最高生長(zhǎng)期特點(diǎn)：①新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長(zhǎng)速率處于動(dòng)態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值。②細(xì)胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌開始產(chǎn)芽孢。③此時(shí)期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時(shí)期。3、穩(wěn)定期又稱：恒定期或最高生長(zhǎng)期44產(chǎn)生原因：營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡；營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適；有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）；物化條件（pH、氧化還原勢(shì)等）不合適。產(chǎn)生原因：45對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：（1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長(zhǎng)此期，提高產(chǎn)量，措施如下：補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料即流加）調(diào)pH

調(diào)整溫度（2）穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：46生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長(zhǎng)得率）：概念：表示微生物對(duì)基質(zhì)利用效率的高低

Y=菌體干重/消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度根據(jù)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要量。如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營(yíng)養(yǎng)物（葡萄糖）10g。生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長(zhǎng)得率）：47四、衰亡期特點(diǎn)：①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細(xì)胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)所謂的負(fù)生長(zhǎng)。②細(xì)胞內(nèi)顆粒更明顯，細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等，發(fā)生自溶的菌生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)為向下跌落的趨勢(shì)。衰亡期比其他各時(shí)期時(shí)間長(zhǎng)，它的長(zhǎng)短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。四、衰亡期特點(diǎn)：①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超48產(chǎn)生原因：生長(zhǎng)條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡。微生物生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物形成的關(guān)系：微生物發(fā)酵形成產(chǎn)物的過程與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的過程并不總是一致的。一般認(rèn)為：初級(jí)代謝是給予生物能量和生成中間產(chǎn)物的過程，初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過程同步，微生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定期是這些產(chǎn)物的最佳收獲時(shí)機(jī)；產(chǎn)生原因：生長(zhǎng)條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合49次級(jí)代謝產(chǎn)物與微生物的生存、生長(zhǎng)和繁殖無(wú)關(guān)。次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過程不同步。在分批培養(yǎng)中，它們的形成高峰往往在微生物生長(zhǎng)穩(wěn)定期的后期或衰亡期。lg細(xì)胞數(shù)或產(chǎn)物濃度時(shí)間細(xì)胞產(chǎn)物I型 II型次級(jí)代謝產(chǎn)物與微生物的生存、生長(zhǎng)和繁殖無(wú)關(guān)。次50主要的生長(zhǎng)參數(shù)遲緩時(shí)間：實(shí)際達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間與理想條件下達(dá)到對(duì)數(shù)期所需時(shí)間之差。延緩生長(zhǎng)量反映了遲緩期給細(xì)胞物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)造成的損失。比生長(zhǎng)率：表示生長(zhǎng)速度與生長(zhǎng)基質(zhì)濃度之間的關(guān)系，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度很低時(shí)，比生長(zhǎng)率與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度成正比?？偵L(zhǎng)量：通過培養(yǎng)獲得的微生物總量與原來接種的微生物量之差值。產(chǎn)量常數(shù)：總生長(zhǎng)量與消耗基質(zhì)總量之比。主要的生長(zhǎng)參數(shù)遲緩時(shí)間：實(shí)際達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間與理想條件51第三節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無(wú)菌技術(shù)無(wú)菌技術(shù)：是將微生物分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)時(shí)防止被其它微生物污染的技術(shù)。

1、對(duì)使用的器皿及用具的滅菌

2、對(duì)培養(yǎng)基的滅菌通常使用的方法有高溫蒸汽滅菌和高溫干熱滅菌，效果達(dá)到無(wú)菌（不含任何微生物)。第三節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無(wú)菌技術(shù)52

3、無(wú)菌的環(huán)境（1）在操作過程中的無(wú)菌要求：接種、分離過程的無(wú)菌效果（在火焰上部進(jìn)行操作）。（2）在超凈工作臺(tái)、無(wú)菌室和無(wú)菌箱中進(jìn)行操作。使用甲醛、紫外線、75%的乙醇等進(jìn)行預(yù)處理及其他的必要措施。（3）如進(jìn)行好氧培養(yǎng)需對(duì)空氣進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)室用多層紗布、棉塞和硅膠塞過濾空氣，工業(yè)中使用空氣過濾器過濾空氣。3、無(wú)菌的環(huán)境53二、微生物的分離方法

1、平皿劃線分離法二、微生物的分離方法54

將滅好菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后用接種針取少量的需分離菌，在培養(yǎng)基的表面上進(jìn)行劃線，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。菌落在劃線開始處較密集，在劃線的結(jié)束處少，當(dāng)有單個(gè)孤立的菌落時(shí)，就達(dá)到分離的目的。劃線的方法有：連續(xù)劃線法、扇形劃線法、方格劃線法和平行劃線法。

將滅好菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后用接種55特點(diǎn)：快速、方便。分區(qū)劃線適用于濃度較大的樣品；連續(xù)劃線適用于濃度較小的樣品；特點(diǎn)：快速、方便。56連續(xù)劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片連續(xù)劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片57

2、稀釋分離法（1）液體稀釋法2、稀釋分離法58（1）液體稀釋法首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長(zhǎng),那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個(gè)微生物個(gè)體繁殖而來的純培養(yǎng)物。這種方法適合于細(xì)胞較大的微生物。（1）液體稀釋法59（2）稀釋倒平板法首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，取一定稀釋度的樣品涂布平板或者取一定稀釋度的樣品和熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合（對(duì)于熱敏感菌不適用），培養(yǎng)到平板上長(zhǎng)出單一的菌落。對(duì)于涂布平板的樣品菌落通常僅張?jiān)谄桨宓谋砻?，?duì)于與營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合的樣品菌落通常出現(xiàn)在平板的表面和內(nèi)部。（2）稀釋倒平板法60（3）涂布平板法將經(jīng)過稀釋的樣品滴加入已制好并滅好菌的培養(yǎng)皿表面，用滅好菌的涂布棒將菌液均勻的涂抹在整個(gè)平板上，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出單一菌落。具體分為兩種方法：將0.1ml樣品加入固體培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布棒均勻涂抹進(jìn)行培養(yǎng)（適用于某些嚴(yán)格好氧菌）或者將樣品加入到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，加入45~50℃固體培養(yǎng)基迅速混勻進(jìn)行培養(yǎng)。（3）涂布平板法61

3、單細(xì)胞（單孢子）挑取法采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。3、單細(xì)胞（單孢子）挑取法采用顯微分離法從混雜62

4、選擇性培養(yǎng)分離法為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離。利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離富集培養(yǎng)4、選擇性培養(yǎng)分離法為了從混雜的微生物群體中分離63

三、微生物的培養(yǎng)

1、好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)好氧培養(yǎng)以空氣為氧的來源。實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)方法用平皿培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)；工業(yè)生產(chǎn)時(shí)用自然對(duì)流和機(jī)械通風(fēng)法來供氧；液體培養(yǎng)時(shí)微生物利用培養(yǎng)液中的溶解氧；液體三角瓶培養(yǎng)時(shí)利用搖床機(jī)達(dá)到供氧的目的；發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)用通入無(wú)菌壓縮空氣達(dá)到供氧的目的。三、微生物的培養(yǎng)64厭氧培養(yǎng)是通過隔絕空氣或驅(qū)除氧氣的方法來實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)，可將菌種接種到固體、半固體培養(yǎng)基的深層進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)加入還原劑；也可將厭氧微生物放入真空干燥器，抽出空氣，并充入氮?dú)饣虻獨(dú)夂投趸嫉幕旌蠚怏w。厭氧培養(yǎng)是通過隔絕空氣或驅(qū)除氧氣的方法來實(shí)現(xiàn)的65

2、分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)分批培養(yǎng)：將微生物置于一定容積的、定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入，不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。分批培養(yǎng)的過程中菌體、各種代謝產(chǎn)物的數(shù)目與營(yíng)養(yǎng)物的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)性。當(dāng)微生物生長(zhǎng)及基質(zhì)變化達(dá)到一定時(shí)，菌體生長(zhǎng)則會(huì)停止。在發(fā)酵工業(yè)中可用中間補(bǔ)料或連續(xù)流加物料，使培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度保持在適合菌體生長(zhǎng)和有利于菌體積累代謝產(chǎn)物的環(huán)境中。2、分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)66連續(xù)培養(yǎng)：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長(zhǎng)時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：由于對(duì)典型生長(zhǎng)曲線中穩(wěn)定期到來原因的認(rèn)識(shí)，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。連續(xù)培養(yǎng)：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新67

連續(xù)培養(yǎng)原理

當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長(zhǎng)期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長(zhǎng)狀態(tài)和穩(wěn)定的生長(zhǎng)速率。連續(xù)培養(yǎng)原理當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生68

連續(xù)培養(yǎng)和單批培養(yǎng)的比較單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng)

連續(xù)培養(yǎng) 時(shí)間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ml）連續(xù)培養(yǎng)

單批培養(yǎng)單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時(shí)間連續(xù)流入lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)69

連續(xù)培養(yǎng)器連續(xù)培養(yǎng)器按控制方式分按培養(yǎng)器的級(jí)數(shù)分按細(xì)胞狀態(tài)分按用途分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長(zhǎng)速率）：恒化器單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)器連續(xù)按控制方式分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器70

連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長(zhǎng)速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營(yíng)養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長(zhǎng)因子等），使其始終成為生長(zhǎng)限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。特點(diǎn)：維持營(yíng)養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長(zhǎng)速率。菌體生長(zhǎng)速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究。連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物71恒化器恒化器72

連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng)概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：通過調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采用恒濁器，當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng)概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使73連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng)特點(diǎn)：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長(zhǎng)，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，煩瑣。使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒濁培養(yǎng)特點(diǎn)：基質(zhì)過量，微生物始終以74

恒濁器與恒化器的比較恒濁器與恒化器的比較75

連續(xù)發(fā)酵連續(xù)培養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，相對(duì)于單批發(fā)酵而言。優(yōu)點(diǎn)：高效，簡(jiǎn)化了操作了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等單元操作；自控：便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定節(jié)約大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。連續(xù)發(fā)酵連續(xù)培養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，相對(duì)于單批發(fā)76連續(xù)發(fā)酵缺點(diǎn)：菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營(yíng)養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月~1年。

連續(xù)發(fā)酵77

固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)

細(xì)胞固定化是通過包埋法、微膠囊法、吸附法等將細(xì)胞固定在載體的內(nèi)部或表面，加入營(yíng)養(yǎng)液及合適的培養(yǎng)條件，得到代謝產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：可提供高密度的細(xì)胞；減少細(xì)胞的流失，反復(fù)利用；簡(jiǎn)化細(xì)胞與代謝產(chǎn)物的分離工藝。缺點(diǎn)：成本高；易污染；物質(zhì)傳遞阻力大；只能用于細(xì)胞分泌型產(chǎn)物的發(fā)酵。固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)78

3、混菌培養(yǎng)

兩種或兩種以上的微生物的培養(yǎng)。通常是在發(fā)酵工業(yè)中用兩種或兩種以上的具有互補(bǔ)性質(zhì)的菌種進(jìn)行混合培養(yǎng)。3、混菌培養(yǎng)79發(fā)育——從生長(zhǎng)到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過程，這一過程稱為發(fā)育。個(gè)體生長(zhǎng)——微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個(gè)體生長(zhǎng)。群體生長(zhǎng)——群體中個(gè)體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓俊Ⅲw積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長(zhǎng)來反映個(gè)體生長(zhǎng)的狀況）個(gè)體生長(zhǎng)個(gè)體繁殖群體生長(zhǎng)群體生長(zhǎng)=個(gè)體生長(zhǎng)+個(gè)體繁殖發(fā)育——從生長(zhǎng)到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從量變80在微生物學(xué)中把從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng)。在微生物學(xué)中培養(yǎng)和發(fā)酵兩個(gè)概念是相同。在工業(yè)上大規(guī)模的進(jìn)行微生物培養(yǎng)稱為微生物發(fā)酵。微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件81第一節(jié)微生物生長(zhǎng)測(cè)定描述不同種類、不同生長(zhǎng)狀態(tài)的微生物生長(zhǎng)情況，需選用不同的測(cè)定指標(biāo)。（一）微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)法直接法（血球計(jì)數(shù)板、比例計(jì)數(shù)法）間接法（活菌計(jì)數(shù)法、液體稀釋法、膜過濾法）（二）微生物生長(zhǎng)量和生理指標(biāo)測(cè)定法直接法(干重法，堆體積法)間接法（比濁法，碳、氮含量法，其它生理指標(biāo)）第一節(jié)微生物生長(zhǎng)測(cè)定描述不同種類、不同生長(zhǎng)狀態(tài)的微生物生長(zhǎng)82一、直接計(jì)數(shù)法1、顯微計(jì)數(shù)法（血球計(jì)數(shù)板法）原理：將1cm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。一、直接計(jì)數(shù)法83適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對(duì)酵母菌可同時(shí)測(cè)定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適84微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件85微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件86

2、比濁法（比色發(fā)）原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便；但易受干擾。2、比濁法（比色發(fā)）原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中87

3.平板菌落計(jì)數(shù)法技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無(wú)菌操作；注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的微生物；誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作。3.平板菌落計(jì)數(shù)法88微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件894、干重測(cè)定法將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12—10-13g。該法適合菌濃較高的樣品。如大腸桿菌一個(gè)細(xì)胞一般重約10–12~10–13g，液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2×109個(gè)/ml時(shí)，100ml培養(yǎng)物可得10~90mg干重的細(xì)胞。4、干重測(cè)定法90

5、菌絲長(zhǎng)度測(cè)定法該法適用于對(duì)絲狀真菌生長(zhǎng)長(zhǎng)度的測(cè)定。方法：將真菌接種在固體培養(yǎng)基的平皿中央，定時(shí)測(cè)定菌落的直徑或面積，直到菌落覆蓋整個(gè)平皿。缺點(diǎn)：不能反映菌絲的縱向生長(zhǎng)，不能計(jì)算菌落的厚度和培養(yǎng)集中的菌絲。接種量也能影響結(jié)果，不能反映菌絲的總量。也可用U型管培養(yǎng)法，該法方便不易污染，但通氣不良。5、菌絲長(zhǎng)度測(cè)定法91

6、細(xì)胞堆積體積測(cè)定法方法：將細(xì)胞懸浮液裝入毛細(xì)沉淀管內(nèi)，離心，根據(jù)堆積體積計(jì)算含菌量。該法快速、簡(jiǎn)便，培養(yǎng)液中如有其他固體顆粒，則誤差較大。也可以用有刻度的離心管離心，通過所得的沉淀體積推算出細(xì)胞的質(zhì)量。6、細(xì)胞堆積體積測(cè)定法92

7、電子計(jì)數(shù)器法方法：在計(jì)數(shù)器中放有電解質(zhì)及兩個(gè)電極，將電極一端放入帶微孔的小管，通電抽真空，使含有菌體的電解質(zhì)從小孔進(jìn)入管內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞通過小孔時(shí)，電阻增大，電阻增大會(huì)引起脈沖變化，則每個(gè)細(xì)胞通過時(shí)均被記錄下來。因樣品的體積已知，故可以計(jì)算菌體的濃度，同時(shí)菌體的大小與電阻的大小成正比。該方法方便、快捷，但不能測(cè)定含有顆粒的菌液，對(duì)鏈狀和絲狀菌無(wú)效。7、電子計(jì)數(shù)器法938、液體稀釋法8、液體稀釋法949、薄膜過濾計(jì)數(shù)法常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。9、薄膜過濾計(jì)數(shù)法常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微95

10、涂片染色法應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適

于土壤、牛奶中細(xì)菌計(jì)數(shù)。方法：用鏡臺(tái)測(cè)微尺計(jì)算出視野面積；取

0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計(jì)數(shù)后代入公式：每ml原菌液含菌數(shù)=視野中平均菌數(shù)×涂布面積/視野面積×100×稀釋倍數(shù)10、涂片染色法應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適

96二、間接測(cè)定法1、測(cè)定細(xì)胞的組分含量進(jìn)行估算（1）測(cè)定DNA的含量（2）測(cè)定蛋白質(zhì)的含量（3）測(cè)定ATP的含量二、間接測(cè)定法97

2、從培養(yǎng)基中的某營(yíng)養(yǎng)物的消耗來估算

3、從菌體代謝產(chǎn)物來估算

4、從發(fā)酵液的黏度來估算

5、從發(fā)酵的放熱量估算

6、從發(fā)酵液的酸堿度來估算2、從培養(yǎng)基中的某營(yíng)養(yǎng)物的消耗來估算98測(cè)含氮量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測(cè)含氮量就可推知微生物的濃度。一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測(cè)得粗蛋白的含量。含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。測(cè)含氮量99第二節(jié)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律

由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個(gè)體生長(zhǎng)存在著技術(shù)上的困難。同步生長(zhǎng)的概念：一個(gè)細(xì)胞群體中各個(gè)細(xì)胞都在同一時(shí)間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長(zhǎng)，進(jìn)行同步分裂的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞。同步細(xì)胞群體在任何一時(shí)刻都處在細(xì)胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料。第二節(jié)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律由于微生物細(xì)胞極其微小100微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件101獲得同步生長(zhǎng)的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機(jī)選擇，不影響細(xì)胞代謝。獲得同步生長(zhǎng)的方法主要有兩類：102一、單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)曲線單細(xì)胞微生物主要包括細(xì)菌和酵母菌，其群體生長(zhǎng)是以群體中細(xì)胞數(shù)量的增加來表示的，由一個(gè)細(xì)胞分裂成為兩個(gè)細(xì)胞的時(shí)間間隔稱為世代，一個(gè)世代所需的時(shí)間就是代時(shí)，代時(shí)也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大一倍所需時(shí)間，有時(shí)也稱為倍增時(shí)間。單位時(shí)間內(nèi)繁殖的代數(shù)成為生長(zhǎng)速率。一、單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)曲線單細(xì)胞微生物主要包括103

圖中表示的是一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過若干代分裂后的情況。從圖可見，每經(jīng)過一個(gè)代時(shí)，細(xì)胞數(shù)目就增加一倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長(zhǎng)，這就是單細(xì)胞群體生長(zhǎng)的特征。

104

以細(xì)菌為例介紹單細(xì)胞微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律，其結(jié)論也基本適用于酵母菌。生長(zhǎng)曲線代表了細(xì)菌在新的環(huán)境中從開始生長(zhǎng)、分裂直至死亡的整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。每種細(xì)菌都有各自的典型生長(zhǎng)曲線，但它們的生長(zhǎng)過程卻有著共同的規(guī)律性。一般可以將生長(zhǎng)曲線劃分為四個(gè)時(shí)期。以細(xì)菌為例介紹單細(xì)胞微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律，其結(jié)論也基本105生長(zhǎng)曲線：把少量的細(xì)菌接種到合適的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定單位體積的細(xì)胞數(shù)，并繪制所得的曲線：以細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，得出細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中的曲線圖。根據(jù)生長(zhǎng)曲線的變化規(guī)律，可分為延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個(gè)階段。生長(zhǎng)曲線：106微生物的生長(zhǎng)規(guī)律

延滯期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期衰亡期

單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律延滯期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期107

微生物的生長(zhǎng)曲線微生物的生長(zhǎng)曲線108將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長(zhǎng)數(shù)目的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在109

1、延遲期是微生物細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境的適應(yīng)時(shí)期，也是細(xì)胞調(diào)整其大分子和小分子物質(zhì)的組成（包括酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分）又稱為調(diào)整期。微生物延遲期的長(zhǎng)短以細(xì)菌、酵母較短，霉菌次之，放線菌最長(zhǎng)。

其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期。1、延遲期110現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)=0；細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)；細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)；合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；對(duì)外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素、化學(xué)藥物、輻射等）原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物。現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。111影響延滯期長(zhǎng)短的因素菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短。接種物菌齡：用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接種時(shí)，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期。接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）。培養(yǎng)基成分：在營(yíng)養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)短；接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長(zhǎng)，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。影響延滯期長(zhǎng)短的因素菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲112對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；采取的縮短延遲期的措施有：①增加接種量；（群體優(yōu)勢(shì)----適應(yīng)性增強(qiáng)）②采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。④選用繁殖快的菌種在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；113

2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期代時(shí)以G表示，生長(zhǎng)速率已R表示，設(shè)t1時(shí)刻的菌數(shù)為N1，經(jīng)過n次分裂后，t2時(shí)刻的菌數(shù)為N2

2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期114微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件115例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B），經(jīng)4h（t）后增加到49，000，000（b），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12借助于n和t，還可以計(jì)算出不同培養(yǎng)條件下的代時(shí)G，G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時(shí)為20分鐘。在4小時(shí)內(nèi)共繁殖了12代。例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B），經(jīng)116代時(shí)能夠反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，代時(shí)短，生長(zhǎng)速率快，代時(shí)長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率慢。在很多微生物學(xué)研究中常常要了解微生物的代時(shí)。代時(shí)在不同種微生物中的變化很大，多數(shù)微生物的代時(shí)為1~3h,然而有些快速生長(zhǎng)的微生物的代時(shí)還不到10min,而另一些微生物的代時(shí)卻可長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)或幾天；另外，同一種微生物，在不同的生長(zhǎng)條件下其代時(shí)的長(zhǎng)短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代時(shí)是恒定的，因此它是微生物菌種的一個(gè)重要特征。代時(shí)能夠反應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，代時(shí)短，生長(zhǎng)速率快，代時(shí)117

一些細(xì)菌的代時(shí)菌名 培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度代時(shí)E.coli（大腸桿菌） 肉湯 37℃17minE.coli 牛奶 3712.5Enterobacteraerogenes（產(chǎn)氣腸細(xì)菌） 肉湯或牛奶3716~18E.aerogenes 組合3729~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯3018B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 3766~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 3726S.lactis 乳糖肉湯3748Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌） 肉湯 3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25344~46Mycobacteriumtuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合 37792~93Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌） 組合 271200一些細(xì)菌的代時(shí)菌名 118

不同溫度下的代時(shí)溫度對(duì)微生物的代時(shí)有明顯影響：E.Coli在不同溫度下的代時(shí)溫度（℃） 代時(shí)（分） 溫度（℃） 代時(shí)（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77不同溫度下的代時(shí)溫度對(duì)微生物的代時(shí)有明119

現(xiàn)象：細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。特點(diǎn)：（1）生長(zhǎng)速率常數(shù)最大，即代時(shí)最短；（2）細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致；（3）代謝最旺盛；（4）細(xì)胞對(duì)理化因素較敏感影響因素：（1）菌種（2）營(yíng)養(yǎng)成分（3）營(yíng)養(yǎng)物濃度（4）培養(yǎng)溫度微生物的生長(zhǎng)和純培養(yǎng)課件120對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：①由于此時(shí)期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長(zhǎng)該期，以達(dá)到較高的菌體密度③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期④是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：121營(yíng)養(yǎng)物濃度與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量作用方式：影響微生物的生長(zhǎng)速率和總生長(zhǎng)量。生長(zhǎng)限制因子：凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率和菌體產(chǎn)量的營(yíng)養(yǎng)物就稱生長(zhǎng)限制因子。8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長(zhǎng)速度和最大收獲量受影響時(shí)間營(yíng)養(yǎng)物濃度與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量作用方式：影響微生物的生長(zhǎng)速1223、穩(wěn)定期又稱：恒定期或最高生長(zhǎng)期特點(diǎn)：①新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長(zhǎng)速率處于動(dòng)態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值。②細(xì)胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌開始產(chǎn)芽孢。③此時(shí)期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時(shí)期。3、穩(wěn)定期又稱：恒定期或最高生長(zhǎng)期123產(chǎn)生原因：營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡；營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適；有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）；物化條件（pH、氧化還原勢(shì)等）不合適。產(chǎn)生原因：124對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：（1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長(zhǎng)此期，提高產(chǎn)量，措施如下：補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料即流加）調(diào)pH

調(diào)整溫度（2）穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：125生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長(zhǎng)得率）：概念：表示微生物對(duì)基質(zhì)利用效率的高低

Y=菌體干重/消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度根據(jù)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要量。如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營(yíng)養(yǎng)物（葡萄糖）10g。生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長(zhǎng)得率）：126四、衰亡期特點(diǎn)：①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細(xì)胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)所謂的負(fù)生長(zhǎng)。②細(xì)胞內(nèi)顆粒更明顯，細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等，發(fā)生自溶的菌生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)為向下跌落的趨勢(shì)。衰亡期比其他各時(shí)期時(shí)間長(zhǎng)，它的長(zhǎng)短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。四、衰亡期特點(diǎn)：①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超127產(chǎn)生原因：生長(zhǎng)條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡。微生物生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物形成的關(guān)系：微生物發(fā)酵形成產(chǎn)物的過程與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的過程并不總是一致的。一般認(rèn)為：初級(jí)代謝是給予生物能量和生成中間產(chǎn)物的過程，初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過程同步，微生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定期是這些產(chǎn)物的最佳收獲時(shí)機(jī)；產(chǎn)生原因：生長(zhǎng)條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合128次級(jí)代謝產(chǎn)物與微生物的生存、生長(zhǎng)和繁殖無(wú)關(guān)。次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細(xì)胞的形成過程不同步。在分批培養(yǎng)中，它們的形成高峰往往在微生物生長(zhǎng)穩(wěn)定期的后期或衰亡期。lg細(xì)胞數(shù)或產(chǎn)物濃度時(shí)間細(xì)胞產(chǎn)物I型 II型次級(jí)代謝產(chǎn)物與微生物的生存、生長(zhǎng)和繁殖無(wú)關(guān)。次129主要的生長(zhǎng)參數(shù)遲緩時(shí)間：實(shí)際達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間與理想條件下達(dá)到對(duì)數(shù)期所需時(shí)間之差。延緩生長(zhǎng)量反映了遲緩期給細(xì)胞物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)造成的損失。比生長(zhǎng)率：表示生長(zhǎng)速度與生長(zhǎng)基質(zhì)濃度之間的關(guān)系，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度很低時(shí)，比生長(zhǎng)率與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度成正比?？偵L(zhǎng)量：通過培養(yǎng)獲得的微生物總量與原來接種的微生物量之差值。產(chǎn)量常數(shù)：總生長(zhǎng)量與消耗基質(zhì)總量之比。主要的生長(zhǎng)參數(shù)遲緩時(shí)間：實(shí)際達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間與理想條件130第三節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無(wú)菌技術(shù)無(wú)菌技術(shù)：是將微生物分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)時(shí)防止被其它微生物污染的技術(shù)。

1、對(duì)使用的器皿及用具的滅菌

2、對(duì)培養(yǎng)基的滅菌通常使用的方法有高溫蒸汽滅菌和高溫干熱滅菌，效果達(dá)到無(wú)菌（不含任何微生物)。第三節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無(wú)菌技術(shù)131

3、無(wú)菌的環(huán)境（1）在操作過程中的無(wú)菌要求：接種、分離過程的無(wú)菌效果（在火焰上部進(jìn)行操作）。（2）在超凈工作臺(tái)、無(wú)菌室和無(wú)菌箱中進(jìn)行操作。使用甲醛、紫外線、75%的乙醇等進(jìn)行預(yù)處理及其他的必要措施。（3）如進(jìn)行好氧培養(yǎng)需對(duì)空氣進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)室用多層紗布、棉塞和硅膠塞過濾空氣，工業(yè)中使用空氣過濾器過濾空氣。3、無(wú)菌的環(huán)境132二、微生物的分離方法

1、平皿劃線分離法二、微生物的分離方法133

將滅好菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后用接種針取少量的需分離菌，在培養(yǎng)基的表面上進(jìn)行劃線，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。菌落在劃線開始處較密集，在劃線的結(jié)束處少，當(dāng)有單個(gè)孤立的菌落時(shí)，就達(dá)到分離的目的。劃線的方法有：連續(xù)劃線法、扇形劃線法、方格劃線法和平行劃線法。

將滅好菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后用接種134特點(diǎn)：快速、方便。分區(qū)劃線適用于濃度較大的樣品；連續(xù)劃線適用于濃度較小的樣品；特點(diǎn)：快速、方便。135連續(xù)劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片連續(xù)劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片136

2、稀釋分離法（1）液體稀釋法2、稀釋分離法137（1）液體稀釋法首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長(zhǎng),那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個(gè)微生物個(gè)體繁殖而來的純培養(yǎng)物。這種方法適合于細(xì)胞較大的微生物。（1）液體稀釋法138（2）稀釋倒平板法首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，取一定稀釋度的樣品涂布平板或者取一定稀釋度的樣品和熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合（對(duì)于熱敏感菌不適用），培養(yǎng)到平板上長(zhǎng)出單一的菌落。對(duì)于涂布平板的樣品菌落通常僅張?jiān)谄桨宓谋砻?，?duì)于與營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合的樣品菌落通常出現(xiàn)在平板的表面和內(nèi)部。（2）稀釋倒平板法139（3）涂布平板法將經(jīng)過稀釋的樣品滴加入已制好并滅好菌的培養(yǎng)皿表面，用滅好菌的涂布棒將菌液均勻的涂抹在整個(gè)平板上，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出單一菌落。具體分為兩種方法：將0.1ml樣品加入固體培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布棒均勻涂抹進(jìn)行培養(yǎng)（適用于某些嚴(yán)格好氧菌）或者將樣品加入到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，加入45~50℃固體培養(yǎng)基迅速混勻進(jìn)行培養(yǎng)。（3）涂布平板法140

3、單細(xì)胞（單孢子）挑取法采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。3、單細(xì)胞（單孢子）挑取法采用顯微分離法從混雜141

4、選擇性培養(yǎng)分離法