基因診斷與基因治療課件

第二十一章基因診斷與基因治療1第二十一章基因診斷與基因治療1第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的含義基因診斷（genediagnosis）亦稱(chēng)分子診斷、DNA診斷。采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來(lái)分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu)（DNA水平）或功能（RNA水平）是否異常，以此來(lái)對(duì)相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷。2第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的含義2二、基因診斷的原理及方法1基因診斷的原理

檢測(cè)相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常

2基因診斷的方法 （1）DNA診斷 （2）RNA診斷3二、基因診斷的原理及方法1基因診斷的原理3（1）DNA診斷

1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性2）等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe） 3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） 4）DNA序列分析（2）RNA診斷1）RNA印跡（Northernblot）2)RT-PCR4（1）DNA診斷41）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 —基因連鎖分析（1）方法原理：

待測(cè)DNA序列中的點(diǎn)突變導(dǎo)致了某一限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變可引起其特異的限制性?xún)?nèi)切酶片段的大小與多少隨之改變，即而通過(guò)Southern印跡雜交和限制性?xún)?nèi)切酶酶譜分析診斷出點(diǎn)突變。51）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（1）方法原理：56（2）診斷原理

在人群中，個(gè)體間DNA的核苷酸序列存在差異，稱(chēng)為DNA多態(tài)性。DNA多態(tài)性可以改變限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。66（2）診斷原理

在人群中，個(gè)體間DNA的核苷酸序列存在差7

RFLP按照孟德?tīng)柗绞竭z傳，在某一特定家族中，如果某一種致病基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可利用這一多態(tài)性片段作為一種遺傳性標(biāo)志來(lái)判斷家族成員或胎兒的基因組中是否攜帶致病基因。77

RFLP按照孟德?tīng)柗绞竭z傳，在某一特定家88889（2）應(yīng)用A

sickle-cellanemia的基因診斷a.

病因血紅蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常為谷氨酸，貧血時(shí)突變?yōu)轭R氨酸。99（2）應(yīng)用91012345610101234511b.

檢測(cè)限制性?xún)?nèi)切酶：Sau1酶切位點(diǎn)：CCTNAGG探針：標(biāo)記的β珠蛋白1111b.

檢測(cè)1112

c.結(jié)果分析切割正常待測(cè)血紅蛋白β珠蛋白，DNA與探針雜交后產(chǎn)生1.1kb切割異常待測(cè)血紅蛋白β珠蛋白，DNA與探針雜交后產(chǎn)生1.3kb1212

c.結(jié)果分析121313131314

1414

1415（1）原理

根據(jù)已知的基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于突變基因異常核苷酸序列的寡核苷酸作為雜交探針，從而直接檢測(cè)和鑒定突變基因。2）等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法

（allelespecificoligonucleotide,ASO）

1515（1）原理

根據(jù)已知的基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合16

相應(yīng)于突變基因異常相應(yīng)于正?；?/p>

核苷酸序列的寡核苷核苷酸序列的寡核苷雜交探針?biāo)犭s交探針與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交

發(fā)生雜交

均可雜交與異常不發(fā)生雜交(突變純和子）

（雜和子）與正常發(fā)生雜交(正常純和子）

1616

相應(yīng)于突變基因異常相應(yīng)于正常基病因H-ras（化學(xué)誘導(dǎo)）

ras家族K-ras編碼P21蛋白N-ras（自然發(fā)生)ras家族點(diǎn)突變好發(fā)于12、13、61位密碼子

（2）應(yīng)用

—大腸癌K-ras的基因診斷18181）病因（2）應(yīng)用

—大腸癌K-ras的基因診斷1192）檢測(cè)

a、PCR擴(kuò)增

用人工合成的位于待測(cè)點(diǎn)突變兩側(cè)的引物，分別擴(kuò)增含12、13、及61位點(diǎn)的基因片段。19192）檢測(cè)

a、PCR擴(kuò)增

用人工合成的位于待測(cè)點(diǎn)20b、ASO分析

①

將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合在尼龍膜上分別與ras原癌基因密碼子12、13、61所有可能引起堿基突變的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交；

②

雜交后，膜經(jīng)嚴(yán)格的洗滌，僅允許完全相配的雜交雙鏈存在；

③針結(jié)合處在光膠片上呈陽(yáng)性斑點(diǎn)2020b、ASO分析

①將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合在尼龍膜上分別與ras2121223）mRNA的檢測(cè)

（1）原理

通過(guò)對(duì)mRNA進(jìn)行定量、檢測(cè)其剪接加工的缺陷以及外顯子變異等判斷基因能否轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄物（mRNA）是否正常以及轉(zhuǎn)錄效率的高低。22223）mRNA的檢測(cè)

（1）原理

通過(guò)對(duì)m23*mRNA不穩(wěn)定可將其轉(zhuǎn)為cDNA再用PCR技術(shù)進(jìn)行研究（RT-PCR）2323*mRNA不穩(wěn)定可將其轉(zhuǎn)為cDNA再用PCR技術(shù)進(jìn)行研究24（2）應(yīng)用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：Rb基因缺陷 Rb1基因的mRNA全長(zhǎng)4.7kb采用RT-PCR技術(shù)分析外顯子突變或mRNA前體剪接異常。2424（2）應(yīng)用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：Rb基因缺陷2425分析外顯子19至22間的基因突變

逆轉(zhuǎn)錄引物：外顯子22反義鏈序列

5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3 `

PCR引物:外顯子22正義鏈序列

5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3`

外顯子19正義鏈序列

5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`2525分析外顯子19至22間的基因突變

逆轉(zhuǎn)錄引物：外顯子2226用RT-PCR檢測(cè)艾滋病2626用RT-PCR檢測(cè)艾滋病26三、基因診斷的應(yīng)用1.遺傳疾病的診斷 產(chǎn)前診斷、遺傳病易感性2感染性疾?。?）病毒性感染（2）細(xì)菌性感染（3）寄生蟲(chóng)（4）其他27三、基因診斷的應(yīng)用1.遺傳疾病的診斷273惡性腫瘤4法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用283惡性腫瘤28（1）DNA指紋分析（DNAfingerprinting）可變串聯(lián)重復(fù)序列小衛(wèi)星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）29（1）DNA指紋分析（DNAfingerprinting）（2）短串聯(lián)重復(fù)（shorttandemrepeat,STR）多態(tài)性分析微衛(wèi)星DNASTR—PCR30（2）短串聯(lián)重復(fù)（shorttandemrepeat,第二節(jié)基因治療的基本概念和基本策略

一基因治療（genetherapy）的概念1、背景與歷史疾病的分子生物學(xué)了解

新技術(shù)新方法（特別是重組DNA）的迅速發(fā)展31第二節(jié)基因治療的基本概念和31

1989年5月28日

第一個(gè)基因標(biāo)記計(jì)劃

（TIL-NeoR）

1990年9月11日

第一個(gè)基因治療計(jì)劃

（ADA-SCID）

32

1989年5月28日

第一個(gè)基因標(biāo)記計(jì)劃

1995年NIH組織Orkin、Motoksy對(duì)頭5年基因治療評(píng)估3點(diǎn)建議：發(fā)展載體技術(shù)疾病的分子機(jī)制動(dòng)物模型成立3個(gè)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室2000年2月532個(gè)計(jì)劃，3400余個(gè)病人

33

1995年NIH組織Orkin、Mot病種：惡性腫瘤62.2%

遺傳性疾病13.3%

AIDS6.8%

心血管疾病6.8%

其他1.3%

34病種：惡性腫瘤62.2%

2、定義

基因角度：正?；蛴泄δ艿幕蛑脫Q或增補(bǔ)缺陷基因。治療角度：新的遺傳物轉(zhuǎn)移到某個(gè)體獲治療效果。

352、定義353、方式

基因矯正和置換:同源重組

基因增補(bǔ):ADA、血友病

基因封閉:myc基因過(guò)度表

達(dá)，反義抑制

活化前體藥物基因治療：363、方式

基因矯正和置換:同源重組

基因增補(bǔ):

單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞合成HSV-TK無(wú)毒性的抗病毒有毒性的抗病毒藥物（GCV）藥物（GCV三磷酸）

細(xì)胞死亡37

單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因374、導(dǎo)入方式

exvivo基因轉(zhuǎn)移

invivo基因轉(zhuǎn)移384、導(dǎo)入方式

第三節(jié)基因治療的條件1、

目的基因的種類(lèi)：細(xì)胞因子、缺陷基因、抑癌基因、受體基因39

第三節(jié)基因治療的條件391、

目的基因的獲得方法

1）

真核基因組DNA文庫(kù)中

目的基因的克隆

2）

cDNA文庫(kù)中目的基因的

克隆

3）

人工合成基因片段

4）

PCR法篩選擴(kuò)增目的基因401、

目的基因的獲得方法

1）

真核1、

外源基因的要求

1）

含信號(hào)肽的cDNA，序列

正確

2）

必要的調(diào)控元件（順式

作用元件啟動(dòng)子、增強(qiáng)

子、靜止子）

411、外源基因的要求

1）

含信號(hào)肽的cDNA，序列3）

外源基因進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄，

再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿，間隔序

列（內(nèi)含子），剪接信號(hào)

（SA,SD）PolyA信號(hào)，核

內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子

4）

翻譯的起始密碼子、終止

密碼子、內(nèi)核糖體進(jìn)入位

點(diǎn)（IRES）元件

5）

外源基因的丟失、失活、甲基

化

423）

外源基因進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄，

再轉(zhuǎn)移至細(xì)4、基因治療的靶細(xì)胞（targetcell）1）

生殖細(xì)胞全世界受?chē)?yán)格控制2）體細(xì)胞選擇的標(biāo)準(zhǔn)：A、

容易取出和移植B、

容易體外培養(yǎng)C、

目的基因高效導(dǎo)入D、

細(xì)胞壽命長(zhǎng)434、基因治療的靶細(xì)胞（targetcell）43常用靶細(xì)胞；

自體、

同種異體、

異種、

淋巴、骨髓、皮膚、肝、肌、

腫瘤細(xì)胞等

44常用靶細(xì)胞；

自體、

同種異體、

異4545基因?qū)氲姆绞剑?/p>

exvivo——體外將基因?qū)雝arget

cell,然后將此修飾過(guò)

的細(xì)胞回輸給病人。

Invivo——外源基因直接導(dǎo)入體

內(nèi)有關(guān)的組織器官。

46基因?qū)氲姆绞剑?/p>

exvivo——體外將基因

3、基因?qū)耄ㄞD(zhuǎn)移）的工具與方法。將外源基因或DNA片斷導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，需要有一個(gè)能在該宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的載體（vector）來(lái)攜帶。前者與后者在體外構(gòu)成重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。473、基因?qū)耄ㄞD(zhuǎn)移）的工具與方法。47

1）非病毒方法

481）非病毒方法

48

4949（一）磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)磷酸鈣--DNA導(dǎo)入細(xì)胞吞噬體轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞器瞬時(shí)穩(wěn)定外源基因存在外源基因非特異于染色體DNA外與宿主染色體DNA重組12小時(shí)內(nèi)表達(dá)持續(xù)約3-4天降解穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞株50（一）磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)50（二）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)（略）

51（二）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)（略）51（三）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（20%）聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體-DNA脂質(zhì)體DNA陽(yáng)離子復(fù)合物

負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸收此復(fù)合物（融合吸收）優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、低毒性、無(wú)免疫原性、無(wú)病毒產(chǎn)生、化學(xué)成分已知可大量商業(yè)供應(yīng)缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率低，短暫表達(dá)

52（三）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（20%）52（四）電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

靶細(xì)胞（懸浮態(tài)）+外源目的DNA

電穿孔儀高壓電脈沖

靶細(xì)胞膜發(fā)生瞬時(shí)可逆性破裂

形成微孔

外源目的DNA進(jìn)入靶細(xì)胞

53（四）電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

靶細(xì)胞（懸浮態(tài)）+外源目的DNA

（五）基因槍技術(shù)電子發(fā)射裝置或高壓氣流

金或鎢顆粒包裹外源目的DNA形成“子彈”

打入靶細(xì)胞54（五）基因槍技術(shù)54上述物理、化學(xué)方法轉(zhuǎn)移基因的缺點(diǎn)：

1）

轉(zhuǎn)移效率低，多應(yīng)用于實(shí)

驗(yàn)研究

2）

維持時(shí)間短

2、病毒方法

55上述物理、化學(xué)方法轉(zhuǎn)移基因的缺點(diǎn)：

1）

轉(zhuǎn)移效率低，多在以基因治療為目的的載體系統(tǒng)中，以病毒載體最為常用，其優(yōu)點(diǎn)：1）

易于改造與操作2）

轉(zhuǎn)移效率高3）較高的靶細(xì)胞特異性56在以基因治療為目的的載體系統(tǒng)中，以病毒載體最為常用，其病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)載體

————用于具有分裂功能的

細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移

與表達(dá)57病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)

腺病毒(adenovirus)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated-virus—————用于非增殖性細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)

58

腺病毒(adenovirus)、腺相關(guān)病毒(ade（六）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)

由2條相同的38S單鏈

RNA組成

2、逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

59（六）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)

60

606161

感染宿主細(xì)胞

病毒基因組的整和

原病毒DNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯

逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的釋放62

感染宿主細(xì)胞623、原病毒DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)633、原病毒DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)63

64

644、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建654、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建65

66

665、包裝細(xì)胞系的構(gòu)建

1）沒(méi)有包裝細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體就不能裝配成假

病毒顆粒感染靶細(xì)胞，完成外源基因的高效轉(zhuǎn)移675、包裝細(xì)胞系的構(gòu)建

1）沒(méi)有包裝細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體就不能

2）去除莫洛尼氏小鼠5’端含有包裝信號(hào)ψ一段序列

輔助病毒

整和NIH3T3染色體形成包裝細(xì)胞系

轉(zhuǎn)錄編碼病毒結(jié)構(gòu)基因攜帶外源基因的逆不能包裝成病毒顆粒轉(zhuǎn)錄病毒載體（含有包裝信號(hào)）導(dǎo)入該細(xì)胞系提供病毒結(jié)構(gòu)基因提供包裝信號(hào)

包裝成僅含有外源目的基因假病毒68

2）去除莫洛尼氏小鼠5’端含有包裝信號(hào)ψ一段序列686、逆轉(zhuǎn)錄病毒-包裝細(xì)胞系的

特點(diǎn)

1）

感染增殖分裂的細(xì)胞

2）

轉(zhuǎn)移效率高

3）

有效整和、傳代

4）

宿主范圍廣

（七）腺病毒載體

1、腺病毒載體的結(jié)構(gòu)

696、逆轉(zhuǎn)錄病毒-包裝細(xì)胞系的

特點(diǎn)

1）

707071713、腺病毒載體的特點(diǎn)

1）

可感染非增殖分裂的細(xì)胞

2）

易于培養(yǎng)與儲(chǔ)存

3）

非整和

4）

可致免疫反應(yīng)

（八）質(zhì)粒DNA直接注射723、腺病毒載體的特點(diǎn)

1）

可感染非增殖分裂的細(xì)胞

基因治療的基本過(guò)程

73

基因治療的基本過(guò)程73

靶基因+載體————重組DNA分子—————靶細(xì)胞————病人

74靶基因+載體————重組DNA分子—————靶細(xì)胞————舉例：

細(xì)胞因子修飾腫瘤細(xì)胞降

低其致瘤性提高其免疫原性

75舉例：

細(xì)胞因子修飾腫瘤細(xì)胞降

1、

靶基因：細(xì)胞因子（α-

TNF,IL-2,γ-IFN,等）

2載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒

ψ

LTRgagpolenvLTR

76

1、

靶基因：細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLN系列：

ψ

LTRNEOLTR

77逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLN系列：

ψ

3、包裝細(xì)胞：PA317,包裝

為病毒

4、感染靶細(xì)胞

5、在靶細(xì)胞中表達(dá)基因產(chǎn)物

78

基因治療的安全性問(wèn)題:2次事故靶向性、效、基因整合位點(diǎn)、表達(dá)調(diào)控79基因治療的安全性問(wèn)題:79基因敲除（knockout）與基因添加（knockin）遺傳工程生物中，一個(gè)正?；蚩杀粠追N方式所改變方法1：正常基因完全被基因的突變拷貝所替換

可以在沒(méi)有正?；虻母蓴_下提供突變基因活性的信息

80基因敲除（knockout）與基因添加80方法2正常基因徹底失活

應(yīng)用于獲得正?；蛟谡w生物中的可能功能的信息方法3一個(gè)突變基因加入到基因組

最易進(jìn)行的遺傳工程81方法2正?；驈氐资Щ?18282轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念

用實(shí)驗(yàn)方法把外源基因?qū)雱?dòng)物的受精卵，再將這一受精卵接種到借腹懷孕的寄養(yǎng)雌性動(dòng)物（fostermother）的子宮內(nèi)，使之發(fā)育繁殖，這時(shí)外源基因與動(dòng)物本身的基因組整合，外源基因就能隨細(xì)胞分裂而增殖，再體內(nèi)表達(dá)，并傳給下一代，這樣生育的動(dòng)物稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物83轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念838484小鼠基因置換過(guò)程的總結(jié)85小鼠基因置換過(guò)程的總結(jié)858686動(dòng)物藥廠的基本概念87動(dòng)物藥廠的基本概念878888樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。12月-2212月-22Thursday,December15,2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。23:17:2923:17:2923:1712/15/202211:17:29PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。12月-2223:17:2923:17Dec-2215-Dec-22加強(qiáng)交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。23:17:2923:17:2923:17Thursday,December15,2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。12月-2212月-2223:17:2923:17:29December15,2022踏實(shí)肯干，努力奮斗。2022年12月15日11:17下午12月-2212月-22追求至善憑技術(shù)開(kāi)拓市場(chǎng)，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹(shù)立形象。15十二月202211:17:29下午23:17:2912月-22嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。十二月2211:17下午12月-2223:17December15,2022作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱。2022/12/1523:17:2923:17:2915December2022好的事情馬上就會(huì)到來(lái)，一切都是最好的安排。11:17:29下午11:17下午23:17:2912月-22專(zhuān)注今天，好好努力，剩下的交給時(shí)間。12月-2212月-2223:1723:17:2923:17:29Dec-22牢記安全之責(zé)，善謀安全之策，力務(wù)安全之實(shí)。2022/12/1523:17:29Thursday,December15,2022相信相信得力量。12月-222022/12/1523:17:2912月-22謝謝大家！樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。12月-2212月-22樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。12月-2212月-22Thursday,December15,2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。23:17:2923:17:2923:1712/15/202211:17:29PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。12月-2223:17:2923:17Dec-2215-Dec-22加強(qiáng)交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。23:17:2923:17:2923:17Thursday,December15,2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。12月-2212月-2223:17:2923:17:29December15,2022踏實(shí)肯干，努力奮斗。2022年12月15日11:17下午12月-2212月-22追求至善憑技術(shù)開(kāi)拓市場(chǎng)，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹(shù)立形象。15十二月202211:17:29下午23:17:2912月-22嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。十二月2211:17下午12月-2223:17December15,2022作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱。2022/12/1523:17:2923:17:2915December2022好的事情馬上就會(huì)到來(lái)，一切都是最好的安排。11:17:29下午11:17下午23:17:2912月-22專(zhuān)注今天，好好努力，剩下的交給時(shí)間。12月-2212月-2223:1723:17:2923:17:29Dec-22牢記安全之責(zé)，善謀安全之策，力務(wù)安全之實(shí)。2022/12/1523:17:29Thursday,December15,2022相信相信得力量。12月-222022/12/1523:17:2912月-22謝謝大家！樹(shù)立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識(shí)。12月-2212月-22第二十一章基因診斷與基因治療91第二十一章基因診斷與基因治療1第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的含義基因診斷（genediagnosis）亦稱(chēng)分子診斷、DNA診斷。采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來(lái)分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu)（DNA水平）或功能（RNA水平）是否異常，以此來(lái)對(duì)相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷。92第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的含義2二、基因診斷的原理及方法1基因診斷的原理

檢測(cè)相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常

2基因診斷的方法 （1）DNA診斷 （2）RNA診斷93二、基因診斷的原理及方法1基因診斷的原理3（1）DNA診斷

1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性2）等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe） 3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） 4）DNA序列分析（2）RNA診斷1）RNA印跡（Northernblot）2)RT-PCR94（1）DNA診斷41）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 —基因連鎖分析（1）方法原理：

待測(cè)DNA序列中的點(diǎn)突變導(dǎo)致了某一限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變可引起其特異的限制性?xún)?nèi)切酶片段的大小與多少隨之改變，即而通過(guò)Southern印跡雜交和限制性?xún)?nèi)切酶酶譜分析診斷出點(diǎn)突變。951）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（1）方法原理：596（2）診斷原理

在人群中，個(gè)體間DNA的核苷酸序列存在差異，稱(chēng)為DNA多態(tài)性。DNA多態(tài)性可以改變限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。966（2）診斷原理

在人群中，個(gè)體間DNA的核苷酸序列存在差97

RFLP按照孟德?tīng)柗绞竭z傳，在某一特定家族中，如果某一種致病基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可利用這一多態(tài)性片段作為一種遺傳性標(biāo)志來(lái)判斷家族成員或胎兒的基因組中是否攜帶致病基因。977

RFLP按照孟德?tīng)柗绞竭z傳，在某一特定家98988899（2）應(yīng)用A

sickle-cellanemia的基因診斷a.

病因血紅蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常為谷氨酸，貧血時(shí)突變?yōu)轭R氨酸。999（2）應(yīng)用91001234561001012345101b.

檢測(cè)限制性?xún)?nèi)切酶：Sau1酶切位點(diǎn)：CCTNAGG探針：標(biāo)記的β珠蛋白10111b.

檢測(cè)11102

c.結(jié)果分析切割正常待測(cè)血紅蛋白β珠蛋白，DNA與探針雜交后產(chǎn)生1.1kb切割異常待測(cè)血紅蛋白β珠蛋白，DNA與探針雜交后產(chǎn)生1.3kb10212

c.結(jié)果分析121031031313104

10414

14105（1）原理

根據(jù)已知的基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于突變基因異常核苷酸序列的寡核苷酸作為雜交探針，從而直接檢測(cè)和鑒定突變基因。2）等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法

（allelespecificoligonucleotide,ASO）

10515（1）原理

根據(jù)已知的基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合106

相應(yīng)于突變基因異常相應(yīng)于正常基因

核苷酸序列的寡核苷核苷酸序列的寡核苷雜交探針?biāo)犭s交探針與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交

發(fā)生雜交

均可雜交與異常不發(fā)生雜交(突變純和子）

（雜和子）與正常發(fā)生雜交(正常純和子）

10616

相應(yīng)于突變基因異常相應(yīng)于正?；?0710717171081）病因H-ras（化學(xué)誘導(dǎo)）

ras家族K-ras編碼P21蛋白N-ras（自然發(fā)生)ras家族點(diǎn)突變好發(fā)于12、13、61位密碼子

（2）應(yīng)用

—大腸癌K-ras的基因診斷108181）病因（2）應(yīng)用

—大腸癌K-ras的基因診斷11092）檢測(cè)

a、PCR擴(kuò)增

用人工合成的位于待測(cè)點(diǎn)突變兩側(cè)的引物，分別擴(kuò)增含12、13、及61位點(diǎn)的基因片段。109192）檢測(cè)

a、PCR擴(kuò)增

用人工合成的位于待測(cè)點(diǎn)110b、ASO分析

①

將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合在尼龍膜上分別與ras原癌基因密碼子12、13、61所有可能引起堿基突變的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交；

②

雜交后，膜經(jīng)嚴(yán)格的洗滌，僅允許完全相配的雜交雙鏈存在；

③針結(jié)合處在光膠片上呈陽(yáng)性斑點(diǎn)11020b、ASO分析

①將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合在尼龍膜上分別與ras111211123）mRNA的檢測(cè)

（1）原理

通過(guò)對(duì)mRNA進(jìn)行定量、檢測(cè)其剪接加工的缺陷以及外顯子變異等判斷基因能否轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄物（mRNA）是否正常以及轉(zhuǎn)錄效率的高低。112223）mRNA的檢測(cè)

（1）原理

通過(guò)對(duì)m113*mRNA不穩(wěn)定可將其轉(zhuǎn)為cDNA再用PCR技術(shù)進(jìn)行研究（RT-PCR）11323*mRNA不穩(wěn)定可將其轉(zhuǎn)為cDNA再用PCR技術(shù)進(jìn)行研究114（2）應(yīng)用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：Rb基因缺陷 Rb1基因的mRNA全長(zhǎng)4.7kb采用RT-PCR技術(shù)分析外顯子突變或mRNA前體剪接異常。11424（2）應(yīng)用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：Rb基因缺陷24115分析外顯子19至22間的基因突變

逆轉(zhuǎn)錄引物：外顯子22反義鏈序列

5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3 `

PCR引物:外顯子22正義鏈序列

5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3`

外顯子19正義鏈序列

5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`11525分析外顯子19至22間的基因突變

逆轉(zhuǎn)錄引物：外顯子22116用RT-PCR檢測(cè)艾滋病11626用RT-PCR檢測(cè)艾滋病26三、基因診斷的應(yīng)用1.遺傳疾病的診斷 產(chǎn)前診斷、遺傳病易感性2感染性疾?。?）病毒性感染（2）細(xì)菌性感染（3）寄生蟲(chóng)（4）其他117三、基因診斷的應(yīng)用1.遺傳疾病的診斷273惡性腫瘤4法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用1183惡性腫瘤28（1）DNA指紋分析（DNAfingerprinting）可變串聯(lián)重復(fù)序列小衛(wèi)星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）119（1）DNA指紋分析（DNAfingerprinting）（2）短串聯(lián)重復(fù)（shorttandemrepeat,STR）多態(tài)性分析微衛(wèi)星DNASTR—PCR120（2）短串聯(lián)重復(fù)（shorttandemrepeat,第二節(jié)基因治療的基本概念和基本策略

一基因治療（genetherapy）的概念1、背景與歷史疾病的分子生物學(xué)了解

新技術(shù)新方法（特別是重組DNA）的迅速發(fā)展121第二節(jié)基因治療的基本概念和31

1989年5月28日

第一個(gè)基因標(biāo)記計(jì)劃

（TIL-NeoR）

1990年9月11日

第一個(gè)基因治療計(jì)劃

（ADA-SCID）

122

1989年5月28日

第一個(gè)基因標(biāo)記計(jì)劃

1995年NIH組織Orkin、Motoksy對(duì)頭5年基因治療評(píng)估3點(diǎn)建議：發(fā)展載體技術(shù)疾病的分子機(jī)制動(dòng)物模型成立3個(gè)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室2000年2月532個(gè)計(jì)劃，3400余個(gè)病人

123

1995年NIH組織Orkin、Mot病種：惡性腫瘤62.2%

遺傳性疾病13.3%

AIDS6.8%

心血管疾病6.8%

其他1.3%

124病種：惡性腫瘤62.2%

2、定義

基因角度：正?；蛴泄δ艿幕蛑脫Q或增補(bǔ)缺陷基因。治療角度：新的遺傳物轉(zhuǎn)移到某個(gè)體獲治療效果。

1252、定義353、方式

基因矯正和置換:同源重組

基因增補(bǔ):ADA、血友病

基因封閉:myc基因過(guò)度表

達(dá)，反義抑制

活化前體藥物基因治療：1263、方式

基因矯正和置換:同源重組

基因增補(bǔ):

單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞合成HSV-TK無(wú)毒性的抗病毒有毒性的抗病毒藥物（GCV）藥物（GCV三磷酸）

細(xì)胞死亡127

單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因374、導(dǎo)入方式

exvivo基因轉(zhuǎn)移

invivo基因轉(zhuǎn)移1284、導(dǎo)入方式

第三節(jié)基因治療的條件1、

目的基因的種類(lèi)：細(xì)胞因子、缺陷基因、抑癌基因、受體基因129

第三節(jié)基因治療的條件391、

目的基因的獲得方法

1）

真核基因組DNA文庫(kù)中

目的基因的克隆

2）

cDNA文庫(kù)中目的基因的

克隆

3）

人工合成基因片段

4）

PCR法篩選擴(kuò)增目的基因1301、

目的基因的獲得方法

1）

真核1、

外源基因的要求

1）

含信號(hào)肽的cDNA，序列

正確

2）

必要的調(diào)控元件（順式

作用元件啟動(dòng)子、增強(qiáng)

子、靜止子）

1311、外源基因的要求

1）

含信號(hào)肽的cDNA，序列3）

外源基因進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄，

再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿，間隔序

列（內(nèi)含子），剪接信號(hào)

（SA,SD）PolyA信號(hào)，核

內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子

4）

翻譯的起始密碼子、終止

密碼子、內(nèi)核糖體進(jìn)入位

點(diǎn)（IRES）元件

5）

外源基因的丟失、失活、甲基

化

1323）

外源基因進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄，

再轉(zhuǎn)移至細(xì)4、基因治療的靶細(xì)胞（targetcell）1）

生殖細(xì)胞全世界受?chē)?yán)格控制2）體細(xì)胞選擇的標(biāo)準(zhǔn)：A、

容易取出和移植B、

容易體外培養(yǎng)C、

目的基因高效導(dǎo)入D、

細(xì)胞壽命長(zhǎng)1334、基因治療的靶細(xì)胞（targetcell）43常用靶細(xì)胞；

自體、

同種異體、

異種、

淋巴、骨髓、皮膚、肝、肌、

腫瘤細(xì)胞等

134常用靶細(xì)胞；

自體、

同種異體、

異13545基因?qū)氲姆绞剑?/p>

exvivo——體外將基因?qū)雝arget

cell,然后將此修飾過(guò)

的細(xì)胞回輸給病人。

Invivo——外源基因直接導(dǎo)入體

內(nèi)有關(guān)的組織器官。

136基因?qū)氲姆绞剑?/p>

exvivo——體外將基因

3、基因?qū)耄ㄞD(zhuǎn)移）的工具與方法。將外源基因或DNA片斷導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，需要有一個(gè)能在該宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的載體（vector）來(lái)攜帶。前者與后者在體外構(gòu)成重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞。1373、基因?qū)耄ㄞD(zhuǎn)移）的工具與方法。47

1）非病毒方法

1381）非病毒方法

48

13949（一）磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)磷酸鈣--DNA導(dǎo)入細(xì)胞吞噬體轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞器瞬時(shí)穩(wěn)定外源基因存在外源基因非特異于染色體DNA外與宿主染色體DNA重組12小時(shí)內(nèi)表達(dá)持續(xù)約3-4天降解穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞株140（一）磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)50（二）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)（略）

141（二）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)（略）51（三）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（20%）聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體-DNA脂質(zhì)體DNA陽(yáng)離子復(fù)合物

負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸收此復(fù)合物（融合吸收）優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、低毒性、無(wú)免疫原性、無(wú)病毒產(chǎn)生、化學(xué)成分已知可大量商業(yè)供應(yīng)缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率低，短暫表達(dá)

142（三）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（20%）52（四）電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

靶細(xì)胞（懸浮態(tài)）+外源目的DNA

電穿孔儀高壓電脈沖

靶細(xì)胞膜發(fā)生瞬時(shí)可逆性破裂

形成微孔

外源目的DNA進(jìn)入靶細(xì)胞

143（四）電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

靶細(xì)胞（懸浮態(tài)）+外源目的DNA

（五）基因槍技術(shù)電子發(fā)射裝置或高壓氣流

金或鎢顆粒包裹外源目的DNA形成“子彈”

打入靶細(xì)胞144（五）基因槍技術(shù)54上述物理、化學(xué)方法轉(zhuǎn)移基因的缺點(diǎn)：

1）

轉(zhuǎn)移效率低，多應(yīng)用于實(shí)

驗(yàn)研究

2）

維持時(shí)間短

2、病毒方法

145上述物理、化學(xué)方法轉(zhuǎn)移基因的缺點(diǎn)：

1）

轉(zhuǎn)移效率低，多在以基因治療為目的的載體系統(tǒng)中，以病毒載體最為常用，其優(yōu)點(diǎn)：1）

易于改造與操作2）

轉(zhuǎn)移效率高3）較高的靶細(xì)胞特異性146在以基因治療為目的的載體系統(tǒng)中，以病毒載體最為常用，其病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)載體

————用于具有分裂功能的

細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移

與表達(dá)147病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)

腺病毒(adenovirus)、腺相關(guān)病毒(adeno-associated-virus—————用于非增殖性細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)

148

腺病毒(adenovirus)、腺相關(guān)病毒(ade（六）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)

由2條相同的38S單鏈

RNA組成

2、逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

149（六）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)

150

6015161

感染宿主細(xì)胞

病毒基因組的整和

原病毒DNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯

逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的釋放152

感染宿主細(xì)胞623、原病毒DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1533、原病毒DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)63

154

644、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建1554、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建65

156

665、包裝細(xì)胞系的構(gòu)建

1）沒(méi)有包裝細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體就不能裝配成假

病毒顆粒感染靶細(xì)胞，完成外源基因的高效轉(zhuǎn)移1575、包裝細(xì)胞系的構(gòu)建

1）沒(méi)有包裝細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體就不能

2）去除莫洛尼氏小鼠5’端含有包裝信號(hào)ψ一段序列

輔助病毒

整和NIH3T3染色體形成包裝細(xì)胞系

轉(zhuǎn)錄編碼病毒結(jié)構(gòu)基因攜帶外源基因的逆不能包裝成病毒顆粒轉(zhuǎn)錄病毒載體（含有包裝信號(hào)）導(dǎo)入該細(xì)胞系提供病毒結(jié)構(gòu)基因提供包裝信號(hào)

包裝成僅含有外源目的基因假病毒158

2）去除莫洛尼氏小鼠5’端含有包裝信號(hào)ψ一段序列686、逆轉(zhuǎn)錄病毒-包裝細(xì)胞系的

特點(diǎn)

1）

感染增殖分裂的細(xì)胞

2）

轉(zhuǎn)移效率高

3）

有效整和、傳代

4）

宿主范圍廣

（七）腺病毒載體

1、腺病毒載體的結(jié)構(gòu)

1596、逆轉(zhuǎn)錄病毒-包裝細(xì)胞系的

特點(diǎn)

1）

16070161713、腺病毒載體的特點(diǎn)

1）

可感染非增殖分裂的細(xì)胞

2）

易于培養(yǎng)與儲(chǔ)存

3）

非整和

4）

可致免疫反應(yīng)

（八）質(zhì)粒DNA直接注射1623、腺病毒載體的特點(diǎn)

1）

可感染非增殖分裂的細(xì)胞

基因治療的基本過(guò)程

163

基因治療的基本過(guò)程73

靶基因+載體————重組DNA分子—————靶細(xì)胞————病人

164靶基因+載體————重組DNA分子—————靶細(xì)胞————舉例：

細(xì)胞因子修飾腫瘤細(xì)胞降

低其致瘤性提高其免疫原性

165舉例：

細(xì)胞因子修飾腫瘤細(xì)胞降

1、

靶基因：細(xì)胞因子（α-

TNF,IL-2,γ-IFN,等）

2載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒

ψ

LTRgagpolenvLTR

166

1、

靶基因：細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLN系列：

ψ

LTRNEOLTR

167逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLN系列：

ψ

3、包裝細(xì)胞：PA317,包裝

為病毒

4、感染靶細(xì)胞

5、在靶細(xì)胞中表達(dá)基因產(chǎn)物

168

基因治療的安全性問(wèn)題:2次事故