枯草芽孢桿菌的分離純化課件

枯草芽孢桿菌的分離純化1可編輯課件枯草芽孢桿菌的分離純化1可編輯課件目錄菌種簡(jiǎn)介分離步驟生理生化鑒定發(fā)酵條件的優(yōu)化脂肽類(lèi)抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類(lèi)抗生素的HPLC定量檢測(cè)討論2可編輯課件目錄菌種簡(jiǎn)介2可編輯課件菌種簡(jiǎn)介

無(wú)莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌。可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中。3可編輯課件菌種簡(jiǎn)介無(wú)莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢

枯草芽孢桿菌在自然生長(zhǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類(lèi)抗生素具有很強(qiáng)的抗真菌、病毒、腫瘤、支原體活性，在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景。4可編輯課件枯草芽孢桿菌在自然生長(zhǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類(lèi)分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會(huì)失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌會(huì)失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。5可編輯課件分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會(huì)失分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室分離。6可編輯課件分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土10（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿20ml左右倒6個(gè)平板。7可編輯課件（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿2（3）稀釋分離法：稱取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，搖動(dòng)片刻，然后將此瓶用小火加熱至懸濁液沸騰，維持15min。而后靜止5min，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無(wú)菌水的試管中，制成1:100濃度的懸液，然后吸取土壤懸濁液0.2ml滴加到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)1-2天。8可編輯課件（3）稀釋分離法：稱取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度等均一致）9可編輯課件（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體生理生化鑒定一過(guò)氧化氫酶測(cè)定將測(cè)試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過(guò)氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過(guò)氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽(yáng)性，無(wú)氣泡者為陰性。10可編輯課件生理生化鑒定一過(guò)氧化氫酶測(cè)定10可編輯課件二需氧性試驗(yàn)原理：不同種類(lèi)的芽孢桿菌對(duì)氧氣的需求性常有差異，因此本實(shí)驗(yàn)可作為鑒定芽孢桿菌的一個(gè)較重要指標(biāo)。操作步驟：菌液穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，一般于培養(yǎng)3—7天觀察結(jié)果。若芽孢桿菌在瓊脂柱表面生長(zhǎng)為好氧菌，沿著穿刺線上生長(zhǎng)者為厭氧菌或兼性厭氧菌11可編輯課件二需氧性試驗(yàn)11可編輯課件三、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)原理：有些芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，并將產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即表示試驗(yàn)陽(yáng)性。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補(bǔ)充胍基，可加速反應(yīng)。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。調(diào)節(jié)PH6.5，每管分裝4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌步驟：將芽孢桿菌測(cè)試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（約0.5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為試驗(yàn)陽(yáng)性。12可編輯課件三、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)12可編輯課件四淀粉水解原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。步驟：將培養(yǎng)基做成平板，凝固后取菌種點(diǎn)種于平板上（每皿點(diǎn)種2點(diǎn)），一般于30攝氏度培養(yǎng)2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周?chē)缬袩o(wú)色透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。13可編輯課件四淀粉水解13可編輯課件經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用14可編輯課件經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。15可編輯課件發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,3發(fā)酵過(guò)程中采用單因素試驗(yàn)方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時(shí)間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基)對(duì)脂肽類(lèi)抗生素產(chǎn)量的影響。16可編輯課件發(fā)酵過(guò)程中采用單因素試驗(yàn)方法,考察不同培養(yǎng)溫結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為L(zhǎng)andy培養(yǎng)基,初始pH7·0,接種量3%,發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間38h。17可編輯課件結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為L(zhǎng)andy培養(yǎng)基,初始脂肽類(lèi)抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束后,7000r/min離心10min,取上清，加HCl調(diào)節(jié)pH為5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min離心10min,收集沉淀。將沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,稱重即為脂肽類(lèi)抗生素粗提物的干重。比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類(lèi)抗生素所需的最佳pH值。18可編輯課件脂肽類(lèi)抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束后,70脂肽類(lèi)抗生素的HPLC定量檢測(cè)將脂肽類(lèi)抗生素粗提物過(guò)SephadexLH-20層析柱，每管收集液分別經(jīng)真空干燥后,加入0·2ml乙醇溶解。對(duì)每管乙醇溶液進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn),試驗(yàn)真菌為油菜菌核病菌,將具有抑菌活性的收集液合并在一起,用離心濃縮儀濃縮至完全干燥,即為脂肽類(lèi)抗生素的干重。19可編輯課件脂肽類(lèi)抗生素的HPLC定量檢測(cè)將脂肽類(lèi)抗生素討論

枯草芽孢桿菌脂肽類(lèi)抗生素在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景,但由于其產(chǎn)量不高使其應(yīng)用受到限制，通過(guò)研究枯草芽孢桿菌的發(fā)酵技術(shù)和對(duì)其進(jìn)行遺傳改造可以提高脂肽類(lèi)抗生素產(chǎn)量。20可編輯課件討論

枯草芽孢桿菌脂肽類(lèi)抗生素在防治植物病害上

Thankyou！??！21可編輯課件21可編輯課件感謝親觀看此幻燈片，此課件部分內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們刪除，謝謝配合！感謝親觀看此幻燈片，此課件部分內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，枯草芽孢桿菌的分離純化23可編輯課件枯草芽孢桿菌的分離純化1可編輯課件目錄菌種簡(jiǎn)介分離步驟生理生化鑒定發(fā)酵條件的優(yōu)化脂肽類(lèi)抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類(lèi)抗生素的HPLC定量檢測(cè)討論24可編輯課件目錄菌種簡(jiǎn)介2可編輯課件菌種簡(jiǎn)介

無(wú)莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中。25可編輯課件菌種簡(jiǎn)介無(wú)莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢

枯草芽孢桿菌在自然生長(zhǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類(lèi)抗生素具有很強(qiáng)的抗真菌、病毒、腫瘤、支原體活性，在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景。26可編輯課件枯草芽孢桿菌在自然生長(zhǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類(lèi)分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會(huì)失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌會(huì)失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。27可編輯課件分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會(huì)失分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室分離。28可編輯課件分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土10（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿20ml左右倒6個(gè)平板。29可編輯課件（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿2（3）稀釋分離法：稱取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，搖動(dòng)片刻，然后將此瓶用小火加熱至懸濁液沸騰，維持15min。而后靜止5min，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無(wú)菌水的試管中，制成1:100濃度的懸液，然后吸取土壤懸濁液0.2ml滴加到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)1-2天。30可編輯課件（3）稀釋分離法：稱取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度等均一致）31可編輯課件（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體生理生化鑒定一過(guò)氧化氫酶測(cè)定將測(cè)試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過(guò)氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過(guò)氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽(yáng)性，無(wú)氣泡者為陰性。32可編輯課件生理生化鑒定一過(guò)氧化氫酶測(cè)定10可編輯課件二需氧性試驗(yàn)原理：不同種類(lèi)的芽孢桿菌對(duì)氧氣的需求性常有差異，因此本實(shí)驗(yàn)可作為鑒定芽孢桿菌的一個(gè)較重要指標(biāo)。操作步驟：菌液穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，一般于培養(yǎng)3—7天觀察結(jié)果。若芽孢桿菌在瓊脂柱表面生長(zhǎng)為好氧菌，沿著穿刺線上生長(zhǎng)者為厭氧菌或兼性厭氧菌33可編輯課件二需氧性試驗(yàn)11可編輯課件三、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)原理：有些芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，并將產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即表示試驗(yàn)陽(yáng)性。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補(bǔ)充胍基，可加速反應(yīng)。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。調(diào)節(jié)PH6.5，每管分裝4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌步驟：將芽孢桿菌測(cè)試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（約0.5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為試驗(yàn)陽(yáng)性。34可編輯課件三、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)12可編輯課件四淀粉水解原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。步驟：將培養(yǎng)基做成平板，凝固后取菌種點(diǎn)種于平板上（每皿點(diǎn)種2點(diǎn)），一般于30攝氏度培養(yǎng)2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周?chē)缬袩o(wú)色透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。35可編輯課件四淀粉水解13可編輯課件經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用36可編輯課件經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。37可編輯課件發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,3發(fā)酵過(guò)程中采用單因素試驗(yàn)方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時(shí)間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基)對(duì)脂肽類(lèi)抗生素產(chǎn)量的影響。38可編輯課件發(fā)酵過(guò)程中采用單因素試驗(yàn)方法,考察不同培養(yǎng)溫結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為L(zhǎng)andy培養(yǎng)基,初始pH7·0,接種量3%,發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間38h。39可編輯課件結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為L(zhǎng)andy培養(yǎng)基,初始脂肽類(lèi)抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束