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關(guān)于克隆操作中使用的工具酶第一頁,共五十二頁,2022年,8月28日第一節(jié)基因操作工具酶第二頁,共五十二頁,2022年,8月28日酶酶限制性核酸內(nèi)切酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA連接酶末端轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

S1核酸酶Klenow酶DNA酶Ⅰ

TaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶堿性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶第三頁,共五十二頁,2022年,8月28日主要內(nèi)容1限制性核酸內(nèi)切酶2DNA連接酶3DNA聚合酶4修

酶5小結(jié)第四頁,共五十二頁,2022年,8月28日酶主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA特定序列,切割DNA分子DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探針;2合成cDNA第二鏈;3填補(bǔ)雙鏈DNA3`凹端;4DNA測(cè)序。TaqDNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化,制末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶Ⅰ在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口RNA酶A降解RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補(bǔ)平反應(yīng),合成cDNA或制探針堿性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome第五頁,共五十二頁,2022年,8月28日1限制性核酸內(nèi)切酶1.1引言1.2命名1.3分類1.4活性及影響因素Home第六頁,共五十二頁,2022年,8月28日核酸酶(Nuclease):通過切割相鄰兩個(gè)核苷酸殘基間磷酸二酯鍵,導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈水解斷裂的蛋白酶。(1)按作用對(duì)象分:DNAase&RNAase(2)按斷裂核酸分子不同方式分:

Endonuclease&Exonuclease1.1引言—兩個(gè)概念第七頁,共五十二頁,2022年,8月28日限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendonuclease):

指一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列,并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。限制酶與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)(Restriction-ModificationSystem)。Back第八頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.2命名命名原則:第一個(gè)字母(大寫,斜體):該酶來源的微生物屬名;第二、三個(gè)字母(小寫、斜體):微生物種名;若該微生物有不同的變種和品系,再加上該變種和品系的第一個(gè)字母(大寫)若從同一微生物發(fā)現(xiàn)多種限制性內(nèi)切酶,則依照發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。例如:EcoRⅠ從大腸桿菌R株分離的第一種限制酶命名為EcoRⅠ,其中E代表屬名(Escherichia),co代表種名(coli),R代表株系(RY13),Ⅰ代表該菌株中首次分離到。Back第九頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.3分類1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶1.3.2

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶1.3.3Ⅲ

型限制性內(nèi)切酶Back第十頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶(1)功能:限制、修飾(2)特點(diǎn):需輔助因子Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為;隨機(jī)切割,切割位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)和不一致,無固定切割位點(diǎn);(3)應(yīng)用:不常用。Back第十一頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.3.3Ⅲ型限制性內(nèi)切酶(1)功能:限制、修飾(2)特點(diǎn):需輔助因子Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為;特異切割,切割位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)3`端24-26bp處。(3)應(yīng)用:數(shù)量很少,無實(shí)際作用。Back第十二頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.3.2Ⅱ型限制性內(nèi)切酶(1)功能:識(shí)別并特異切割DNA分子。

即通常所指DNA限制性核酸內(nèi)切酶;(2)特點(diǎn):僅需輔助因子Mg2+作催化反應(yīng);特異切割,能識(shí)別雙鏈DNA特殊序列,并產(chǎn)生特異片段;(3)應(yīng)用:種類繁多,分子克隆中最為常用第十三頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.3.2.1基本特性①識(shí)別序列:長(zhǎng)度:為4-8個(gè)核苷酸的特異序列;結(jié)構(gòu):且許多識(shí)別序列具回文結(jié)構(gòu),如HindⅢ的識(shí)別序列:5`AAGCTT3`3`TTCGAA5②切割產(chǎn)生的末端有粘端(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)第十四頁,共五十二頁,2022年,8月28日EnzymeRecognitionseuqenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofRestrictionEndonucleases第十五頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.3.2.2同功異源酶(isoschizomer)

定義:來源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。又稱同裂酶。如:BamHI

和BstI(G↓GATCC)注:有一些同功異源酶對(duì)于切割位點(diǎn)上的甲基化堿基的敏感度有所不同。第十六頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.3.2.3同尾酶(isocaudamer)

定義:識(shí)別序列不同,但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。如:BamHI:G↓GATCC

BglII:A↓GATCTBack第十七頁,共五十二頁,2022年,8月28日1.4

活性及影響因素(1)活性大?。好笇?duì)DNA水解程度不同。(2)酶的活性單位:

指1μg純的指定DNA在指定緩沖液中,于37℃(最適溫度更準(zhǔn)確)1h完全酶解DNA中所有該限制酶識(shí)別位點(diǎn)所需的酶量。第十八頁,共五十二頁,2022年,8月28日(3)影響因素①DNA模板的純度②DNA的甲基化程度③酶切反應(yīng)溫度④DNA的分子結(jié)構(gòu)⑤緩沖液Back第十九頁,共五十二頁,2022年,8月28日2DNA連接酶2.1定義2.2種類及作用機(jī)理2.3使用時(shí)的注意事項(xiàng)Home第二十頁,共五十二頁,2022年,8月28日2.1定義及功能定義:可使一段DNA3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯鍵,把兩DNA片段連在一起封閉雙鏈上形成的切口的酶(DNAligase)。第二十一頁,共五十二頁,2022年,8月28日OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase連接缺刻(nick)Back第二十二頁,共五十二頁,2022年,8月28日(1)種類:

◆T4DNA連接酶(ATP提供能量)

◆大腸桿菌DNA連接酶(NAD+提供能量)2.2種類及作用機(jī)理第二十三頁,共五十二頁,2022年,8月28日(2)作用機(jī)理:T4DNAligaseBack第二十四頁,共五十二頁,2022年,8月28日(1)不能催化兩單鏈DNA分子連接;(2)只能連雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick);不能連接雙鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失所致缺口(gap)。2.3使用注意第二十五頁,共五十二頁,2022年,8月28日DNAligase的活性Back第二十六頁,共五十二頁,2022年,8月28日3DNA聚合酶(DNApolymerase)3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆轉(zhuǎn)錄酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶Home第二十七頁,共五十二頁,2022年,8月28日3.1DNA聚合酶Ⅰ活性:5`→3`聚合活性,5`→3`外切和3`→5`外切活性。發(fā)揮生物學(xué)活性的條件:(1)DNA模板(可以是單鏈或雙鏈)(2)帶有3`-端游離羥基的引物鏈(3)底物和激活劑注:對(duì)雙鏈DNA,當(dāng)有dNTP存在時(shí),3`→5`降解活性會(huì)被5`→3`方向的聚合活性所抑制。應(yīng)用:缺口平移法制備DNA分子雜交探針第二十八頁,共五十二頁,2022年,8月28日缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制備DNA分子探針Back第二十九頁,共五十二頁,2022年,8月28日活性:5`→3`聚合活性,3`→5`外切酶活性。無5`→3`外切酶活性。用途:(1)填補(bǔ)或標(biāo)記DNA的3`隱蔽末端;(2)催化合成cDNA第二鏈;(3)DNA序列測(cè)定3.2Klenow聚合酶第三十頁,共五十二頁,2022年,8月28日EcoRI酶切末端同位素標(biāo)記的EcoRI酶切末端α-32P-dATPBack第三十一頁,共五十二頁,2022年,8月28日(1)顯著特點(diǎn):熱穩(wěn)定性。70℃反應(yīng)2h殘留活性90%;93℃反應(yīng)2h殘留活性60%;94℃反應(yīng)2h殘留活性40%。(2)應(yīng)用:

①特定DNA片段的體外擴(kuò)增;②DNA測(cè)序。3.3TaqDNA聚合酶Back第三十二頁,共五十二頁,2022年,8月28日(1)定義:RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶(reversetranscriptase)。(2)活性:5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA,引物是帶3`-OH的RNA或DNA。3.4逆轉(zhuǎn)錄酶第三十三頁,共五十二頁,2022年,8月28日逆轉(zhuǎn)錄酶的活性第三十四頁,共五十二頁,2022年,8月28日(3)用途①在體外以mRNA為模板合成cDNA;②對(duì)有5`突出末端的DNA片段作末端標(biāo)記或補(bǔ)平;③雙脫氧法測(cè)序;④以DNA或RNA為模板合成核酸探針。Back第三十五頁,共五十二頁,2022年,8月28日(1)活性:

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性。注意:3`→5`外切酶活性對(duì)單鏈DNA的作用比對(duì)雙鏈DNA強(qiáng);高濃度dNTP環(huán)竟下前者活性更強(qiáng)。(2)應(yīng)用:標(biāo)記DNA平末端或隱蔽3`末端3.5T4DNA聚合酶Back第三十六頁,共五十二頁,2022年,8月28日(1)活性:5`→3`聚合酶活性;有單鏈及雙鏈的3`→5`外切酶活性。但無5`→3`外切酶活性;(2)特點(diǎn):極佳的連續(xù)合成能力(3)應(yīng)用:①長(zhǎng)DNA片段體外擴(kuò)增;②通過單純延伸或取代合成途徑標(biāo)記DNA3`末端;③補(bǔ)平:使雙鏈DNA5`或3`突出末端變平末端。3.6T7DNA聚合酶Back第三十七頁,共五十二頁,2022年,8月28日4修飾酶4.1堿性磷酸酶4.2末端轉(zhuǎn)移酶4.3T4多核苷酸激酶4.4S1核酸酶

Home第三十八頁,共五十二頁,2022年,8月28日4.1堿性磷酸酶(1)功能:催化核酸脫5`-磷酸基團(tuán),使DNA或RNA片段5`-P末端轉(zhuǎn)換成5`-OH末端。(2)來源:大腸桿菌:

bacterialalkalinephosphatase(BAP);小牛腸道:

calfintestinalalkalinephosphatase

(CIP)。第三十九頁,共五十二頁,2022年,8月28日堿性磷酸酶的活性第四十頁,共五十二頁,2022年,8月28日注意:CIP的比活性比BAP高出10-20倍,且CIP在SDS中68℃就可完全失活,而BAP卻是熱抗性酶。Back第四十一頁,共五十二頁,2022年,8月28日(1)來源:

前淋巴細(xì)胞和分化早期的類淋巴細(xì)胞。(2)功能:催化DNA進(jìn)行5`→3`方向的聚合作用,逐個(gè)將dNTP分子加到線性DNA分子3`-OH端。4.2末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)第四十二頁,共五十二頁,2022年,8月28日末端轉(zhuǎn)移酶的催化作用第四十三頁,共五十二頁,2022年,8月28日(3)用途:①給外源DNA片段和及載體加互補(bǔ)同聚物尾巴;②標(biāo)記DNA片段的3`末端。Back第四十四頁,共五十

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