基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1抗體定義：指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。醫(yī)學(xué)應(yīng)用：科研應(yīng)用：免疫共沉淀、免疫印跡、染色質(zhì)免疫共沉淀、免疫熒光技術(shù)、ELISA等1.診斷：各類血清學(xué)檢測(cè)，抗人球蛋白測(cè)試，早孕檢測(cè)等2.治療：?jiǎn)慰寺】贵w療法（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化癥等），腫瘤治療。抗體定義：指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)2多抗來源動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中，即為多克隆抗體。多抗來源動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不3多克隆抗體制備動(dòng)物選擇：兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動(dòng)物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產(chǎn)抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用。多克隆抗體制備動(dòng)物選擇：4基本步驟延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間增強(qiáng)吞噬作用刺激抗原提呈促進(jìn)細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖影響T細(xì)胞“極化”佐劑的作用機(jī)理：抗原制備：商品化或自行表達(dá)基礎(chǔ)免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐劑（ComplateFreund’adjuvand,含礦物油,卡介苗等)。加強(qiáng)免疫：第2次以后，抗原量減半，多次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).取血測(cè)效價(jià)：加強(qiáng)免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清：可一次放血(頸動(dòng)脈)也可多次取血(耳靜脈)基本步驟延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間促進(jìn)細(xì)胞因子分泌佐劑的作用機(jī)理：抗5實(shí)驗(yàn)方法新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),健康,無病原基礎(chǔ)免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆?？乖?0.5ml佛式完全佐劑(CFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射加強(qiáng)免疫間隔2-4周,可進(jìn)行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射實(shí)驗(yàn)方法新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),健康,無病原6實(shí)驗(yàn)方法免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測(cè)效價(jià)酶聯(lián)法：1:104以上，能達(dá)到1:106。免疫雙擴(kuò)散：1:16以上，能達(dá)到1:64效價(jià)達(dá)到要求的可放血制備血清可一次放血(頸動(dòng)脈)也可多次取血(耳靜脈)實(shí)驗(yàn)方法免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測(cè)效價(jià)7米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。于450nm處，以空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔OD值。誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）；抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標(biāo)記。答：膜和膠塊存在氣泡，轉(zhuǎn)膜時(shí)趕盡膜和膠塊之間的氣泡SDS0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點(diǎn)注射0.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.以P/N值(陽(yáng)性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫電鏡)免疫熒光

是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標(biāo)記技術(shù)，通過熒光激發(fā)，來對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。多抗的特點(diǎn)多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質(zhì)是一個(gè)群體綜合的性質(zhì)。比單抗更容易捕捉抗原。因?yàn)楹锌共煌砦坏目贵w，多種抗體都可與抗原結(jié)合。特異性相對(duì)較差：因?yàn)橛刹煌再|(zhì)的抗體組成，只要其中含交叉反應(yīng)的抗體，多抗就有交叉反應(yīng)，所以多抗更容易有交叉反應(yīng)?？贵w的純化、標(biāo)記比單抗難：因?yàn)楹懈鞣N不同類型、亞類的抗體，提純、標(biāo)記的方法有所差別。同時(shí),血清中含有的雜蛋白比較多。米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在8什么情況下需要制備單克隆抗體目的蛋白有結(jié)構(gòu)類似物抗原不純，無法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應(yīng)）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑什么情況下需要制備單克隆抗體目的蛋白有結(jié)構(gòu)類似物9單抗制備原理如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。1975年分子生物學(xué)家克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。將這種雜交瘤作單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，可形成單細(xì)胞系，即單克隆。利用培養(yǎng)或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等都是一致的，而且在培養(yǎng)過程中，只要沒有變異，不同時(shí)間所分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)與機(jī)能。單抗制備原理如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，10單抗制備原理HGRPT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黃嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)單抗制備原理HGRPT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶T11基本步驟基本步驟12實(shí)驗(yàn)方法免疫小鼠選擇體重18－20gBALB/C雌性小鼠，用制備抗原免疫。50—100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。細(xì)胞融合取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50%PEG（Sigma）作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法免疫小鼠13陽(yáng)性細(xì)胞篩選細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法，用包被液稀釋成1－10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃過夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1－10％的脫脂奶粉或1－3％BSA或3－6％牛血清封閉30-60min;加入陽(yáng)性孔培養(yǎng)上清100ul/孔，37℃1－2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃1－2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/LH2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD492的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。獲分別對(duì)上述抗原有特異性反應(yīng)的陽(yáng)性孔。篩選出的特異性陽(yáng)性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲對(duì)上述抗原有特異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存。陽(yáng)性細(xì)胞篩選細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次14雜交瘤細(xì)胞的凍存雜交瘤細(xì)胞通常用含有8％--10%的二甲亞砜和20％小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個(gè)月短期保存。凍存細(xì)胞需要緩慢降溫，復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。雜交瘤細(xì)胞的凍存雜交瘤細(xì)胞通常用含有8％--10%的二甲亞砜15單克隆抗體腹水制備及純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體：取1倍體積腹水加2倍體積0.06MPH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70℃保存。單克隆抗體腹水制備及純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注16其他抗體純化方法鹽析法（硫酸銨沉淀)離子交換法親和層析法凝膠過濾法其他抗體純化方法鹽析法（硫酸銨沉淀)17鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下,蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀硫酸銨是最常用的中性鹽不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同硫酸銨的加入量通常以飽和度表示

(100%飽和度:767g/L)特點(diǎn)成本低，步驟簡(jiǎn)單?？贵w的回收率比較高?？贵w純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適合于做各種標(biāo)記。需要高速離心機(jī)。鹽析法（硫酸銨沉淀)原理18正辛酸-硫酸銨沉淀法原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白.

正辛酸是一種有機(jī)酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀.特點(diǎn)成本較低，步驟較復(fù)雜?？贵w回收率很低。抗體純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標(biāo)記。需要高速離心機(jī)，耐高速離心的玻璃離心管。正辛酸-硫酸銨沉淀法原理19目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。1212-60免疫共沉淀（Co-IP)可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。而用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性?？贵w組成單一復(fù)雜BloodVesselsWesternBlot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必須盡量使各組之間總蛋白量基本一致;2．細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白酶抑制劑的種類很多，要根據(jù)具體情況具體選擇。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。也有用PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見。丙烯酰胺濃度(%)線性分離范圍／KDa7.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，洗滌3次，5min/次。但是對(duì)有些病毒的株系，夾心ELISA并不是很好的選擇。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也是作為判斷結(jié)果的對(duì)照。1．盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失。將樣品的pH值調(diào)至等電點(diǎn)以上,使樣品帶負(fù)電荷.新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),健康,無病原陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也是作為判斷結(jié)果的對(duì)照。將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。治療：?jiǎn)慰寺】贵w療法（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化癥等），腫瘤治療。3封閉不充分，延長(zhǎng)封閉時(shí)間；BloodVessels檢查樣品凝膠是否與轉(zhuǎn)移槽的“-”側(cè)保持一致，以確保樣品蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。切勿反復(fù)凍融已制備好的樣品。1×PBS80ml硫酸銨是最常用的中性鹽種屬來源絕大多數(shù)是小鼠兔、羊、豚鼠等SDS0.離子交換法原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離.DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷

(Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)將樣品的pH值調(diào)至等電點(diǎn)以上,使樣品帶負(fù)電荷.采用鹽溶液洗脫,通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分.特點(diǎn)成本較低，步驟較簡(jiǎn)單?？贵w回收率較高?？贵w純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動(dòng)收集器。目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret20親和層析法原理利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合（抗體-抗原，受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合,捕捉與它相配的物質(zhì)。洗脫一般采用改變pH值的方法特點(diǎn)成本較低，步驟較簡(jiǎn)單?？贵w回收率較高?？贵w純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動(dòng)收集器。親和層析法原理21凝膠過濾法(分子篩)原理將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質(zhì),由于流經(jīng)路徑的差異,使不同分子質(zhì)量的組分分離.大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外通過，走得快；小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來，走得慢。適合于IgM類抗體的純化

(五聚體,分子量約800KD)特點(diǎn)成本高，步驟較簡(jiǎn)單?？贵w回收率較高，分離條件緩和，抗體活性不受影響。抗體純度較高。需要自動(dòng)收集器。凝膠過濾法(分子篩)原理22純化方法選擇原則不需要純化則不純化；（具體應(yīng)用）依據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求及實(shí)驗(yàn)室條件。純化方法選擇原則不需要純化則不純化；（具體應(yīng)用）23腹水效價(jià)測(cè)定用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，腹水效價(jià)在10-5-10-7之間的可用于實(shí)際應(yīng)用。腹水效價(jià)測(cè)定用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，腹水效24單抗與多抗比較

單抗多抗抗體組成單一復(fù)雜抗體性質(zhì)個(gè)體的屬性群體綜合的性質(zhì)純化標(biāo)記容易，效果好難度高一些種屬來源絕大多數(shù)是小鼠兔、羊、豚鼠等制備周期長(zhǎng)(最短4個(gè)月）短（2個(gè)月）制備技術(shù)復(fù)雜簡(jiǎn)單經(jīng)費(fèi)多少單抗與多抗比較25酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）蛋白免疫印跡（Westernblot）免疫熒光技術(shù)（IF）免疫共沉淀（Co-IP)染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch-IP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）26ELISA基本原理酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。ELISA基本原理酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzymelink27ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中28常用ELISA方法1）直接ELISA：待測(cè)抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特異性的酶-特異性抗體偶聯(lián)物。因?yàn)樗玫拿敢呀?jīng)標(biāo)記在特定的抗體上，可檢測(cè)的病毒種類只能局限于某一種。2）間接ELISA：先用抗原包被微量滴定板，然后加入待測(cè)抗體，再加入酶標(biāo)抗體。與直接ELISA相比，間接ELISA適用的范圍更為廣泛，并且特異性也較好。3）夾心ELISA：使用俘獲抗體（包括單抗和多抗）包被微量滴定板，其余步驟同間接ELISA。根據(jù)包被抗體種類的不同，又可以分為同種單抗夾心ELISA，異種單抗夾心ELISA，多種單抗混合夾心ELISA和多抗夾心ELISA等幾種方法。與間接ELISA相比，夾心ELISA多了一步以抗體俘獲富集抗原的過程，因而其靈敏度和特異性也相應(yīng)提高。但是對(duì)有些病毒的株系，夾心ELISA并不是很好的選擇。這可能與單克隆抗體識(shí)別的是蛋白亞基的抗原表位還是病毒粒子表面的抗原表位有關(guān)常用ELISA方法1）直接ELISA：待測(cè)抗原直接包被塑料微29基本步驟包被封閉孵育洗滌顯色結(jié)果測(cè)定基本步驟包被30基本步驟包被：將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包被的1/10乃至于/100?；静襟E包被：不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相31包被條件：

包被液：pH9.6碳酸鹽緩沖液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液、pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。包被緩沖液的選擇要依靠你所包被的物質(zhì)而定，沒有絕對(duì)的選擇，但有一個(gè)原則就是要盡可能的保持包被物的活性不被損失。目前常用的包被緩沖液有PBS、CBS、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液等，一般來說，緩沖液的pH要大于蛋白質(zhì)的pI，以保持其活性。堿性包被液如碳酸緩沖液用的較多，尤其是在小分子和載體蛋白的偶聯(lián)物的包被，其主要的優(yōu)勢(shì)在于堿性環(huán)境可以使蛋白更容易與板子結(jié)合。也有用PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見。包被條件：32洗滌：ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。常用的洗滌液為含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，洗滌3次，5min/次。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌：33封閉：封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而避免ELISA后續(xù)步驟中抗原或抗體與固相載體的直接吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉。孵育：抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為孵育，通常37℃孵育0.5-1h。應(yīng)注意孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。封閉：34顯色：于各反應(yīng)孔加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃反應(yīng)10-30min。顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。結(jié)果測(cè)定：于各反應(yīng)孔加入2M硫酸0.05ml，終止反應(yīng)；拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。于450nm處，以空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔OD值。顯色：35結(jié)果判定：目測(cè)定性法：加入底物經(jīng)酶解和終止反應(yīng)后，肉眼觀察陽(yáng)性孔顏色明顯深于(競(jìng)爭(zhēng)法則淺于)陰性對(duì)照；與陰性對(duì)照的顏色接近者，判定為陰性。以P/N值(陽(yáng)性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.1為陽(yáng)性；P/N值小于2.1，但大于1.5為可疑；P/N小于1.5為陰性。

結(jié)果判定：36對(duì)照設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也是作為判斷結(jié)果的對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。參考標(biāo)準(zhǔn)品：定量測(cè)定應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度。對(duì)照設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也是37ELISA的應(yīng)用ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大，原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當(dāng)，在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（HaptoGlobin）等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）。檢查抗體方面：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲病的血清學(xué)診斷，亦開始廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲病方面，它用于對(duì)瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學(xué)診斷；在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測(cè)定以及對(duì)過敏的診斷，例如檢測(cè)各種過敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等；在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測(cè)食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。ELISA的應(yīng)用ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大38免疫印跡（westernblot）印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－DNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。

埃德溫·邁勒·薩瑟恩（EdwinMellorSouthern）免疫印跡（westernblot）印跡法（blotting39基本原理基本原理40應(yīng)用范圍檢測(cè)組織、細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況（定性、半定量）應(yīng)用范圍416.最后加上相應(yīng)的底物溶液，當(dāng)二抗上的酶催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光時(shí),用X光片曝光，洗片后就會(huì)產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示目的蛋白質(zhì)的位置和強(qiáng)弱。3.通過電泳將蛋白樣品分開。5.印跡首先用封閉液（如5％的脫脂奶粉）處理以封閉固相載體上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印跡中只有目的蛋白質(zhì)與一抗特異性結(jié)合。洗去游離的一抗后，用再與酶標(biāo)記的二抗孵育4.將電泳分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體.轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜就稱為一個(gè)印跡（blot），用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。1.提取細(xì)胞或組織蛋白，測(cè)定總蛋白濃度2.測(cè)定總蛋白濃度，并處理樣品基本步驟6.最后加上相應(yīng)的底物溶液，當(dāng)二抗上的酶催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光42細(xì)胞總蛋白的提取提取細(xì)胞蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理。提取蛋白質(zhì)的方法很多，鑒于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白性質(zhì)的要求不同，因此很難找到一種萬能的裂解方法。

不論采用那種方法，都應(yīng)遵循以下原則：

1．盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失。

2．細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白酶抑制劑的種類很多，要根據(jù)具體情況具體選擇。本實(shí)驗(yàn)中選用PMSF(苯甲基磺酰氟)作為蛋白酶抑制劑。

3．樣品裂解液應(yīng)該新鮮制備，并且分裝凍存于-80℃。切勿反復(fù)凍融已制備好的樣品。B．RIPAbuffer：Tris-HCl50mM,pH7.4NP-401%去氧膽酸鈉0.25%NaCl150mMEDTA1mM目的：要獲得高豐度、高品質(zhì)的蛋白質(zhì)，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求A．細(xì)胞總蛋白裂解緩沖液(100ml)：

1×PBS80mlTritonx-1001ml

去氧膽酸鈉0.5gSDS0.1g

補(bǔ)1×PBS緩沖液至100ml.細(xì)胞總蛋白的提取提取細(xì)胞蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白43注意事項(xiàng)：1.注意個(gè)人防護(hù)。PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)有致命危險(xiǎn)。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，立即用大量水沖洗。2.所用離心機(jī)需提前預(yù)冷。3.為防止蛋白降解，所有操作應(yīng)在冰上完成。4.吸取蛋白上清液時(shí)，注意不要把沉淀吸上來。注意事項(xiàng)：1.注意個(gè)人防護(hù)。PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛44WesternBlot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必須盡量使各組之間總蛋白量基本一致;

蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定;蛋白質(zhì)含量太高則會(huì)使帶形扭曲,甚至?xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪谝陨蟽煞矫嬖颍谶M(jìn)行蛋白電泳之前，先要對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行含量測(cè)定蛋白定量WesternBlot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必45目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。

蛋白定量方法目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret46SDS電泳SDS是一種離子性的表面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈。當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時(shí)，它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以磺酸根離子外露與水分子作用。大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例的SDS后，由于SDS帶強(qiáng)負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)原先所帶電荷顯得微不足道,且每單位重量的蛋白質(zhì)所帶電荷一致，所以不同蛋白質(zhì)的遷移率大小就主要由蛋白分子大小這一主要因素決定。SDS電泳SDS是一種離子性的表面活性劑,它有強(qiáng)47SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍丙烯酰胺濃度(%)線性分離范圍／KDa

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10-431212-601020-807.536-945.057-212SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于灌膠的聚丙烯酰胺的濃481.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱量或配膠時(shí)應(yīng)戴手套及口罩2.過硫酸銨會(huì)緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制3.溶液中一旦加入TEMED，應(yīng)立即混勻并快速灌注入玻璃夾槽中4.為保持電泳的平衡，在無樣品孔中也應(yīng)加入適量的4×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液5.正確連接電泳連線（負(fù)極在上，正極在下）以保證蛋白由上向下方向電泳6.電泳盡量在4℃冰箱中進(jìn)行注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：49轉(zhuǎn)膜凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC（硝酸纖維素）膜、尼龍膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。選擇膜的主要根據(jù)有：1.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量）2.膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適合用于所選顯色方法，信噪比好）4.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜轉(zhuǎn)膜凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)50基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件51-濾紙凝膠膜濾紙+-濾紙凝膠膜濾紙+521.轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)用2.檢查樣品凝膠是否與轉(zhuǎn)移槽的“-”側(cè)保持一致，以確保樣品蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。3.NC膜應(yīng)小心操作，防止破裂注意事項(xiàng)：1.轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)用注意事項(xiàng)：53轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）發(fā)光或DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測(cè)目的蛋白。ECL試劑采用氧化還原反應(yīng)的原理：利用二抗上標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)，使底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生化學(xué)。固相免疫檢測(cè)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）發(fā)光54DAB顯色原理：DAB在HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物，從而指示目的蛋白位置及強(qiáng)弱。ECL發(fā)光相對(duì)于DAB顯色而言，具有發(fā)光持久，靈敏度高(一般可達(dá)到pg級(jí)以上)等優(yōu)點(diǎn)，且DAB具有致癌性。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光，膜可以再生檢測(cè)其他蛋白。DAB顯色原理：DAB在HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物，從551.處理膜的過程中，切勿使膜干掉（否則導(dǎo)致背景增高）2.選擇合適的一抗及二抗?jié)舛龋舛雀卟灰欢ㄐЧ?，過高會(huì)導(dǎo)致背景變黑）3.選擇合適的封閉液（如果膜需要再生，最好選用脫脂奶粉，而非BSA）4.應(yīng)考慮ＥＣＬ試劑的發(fā)光強(qiáng)度及其衰滅時(shí)間，來選擇合適的曝光時(shí)間注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：56一、膜上沒有信號(hào)

答：原因有很多：1細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；2細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性，并且提取過程冰上操作；3轉(zhuǎn)膜過程出現(xiàn)失誤；4抗體或酶失活，選擇在有效期內(nèi)的試劑；5抗體不能識(shí)別目的蛋白，多看看說明，看該抗體是否適用于western。結(jié)果分析結(jié)果分析57二、目的帶很弱

答：1標(biāo)本中靶蛋白含量低，可以加大樣品的上樣量。2轉(zhuǎn)膜不充分，可以通過提高轉(zhuǎn)膜電流或延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間來解決。3抗體效價(jià)低，可以減少抗體的稀釋倍數(shù)，增加抗體濃度。三、膠片背景很臟，有什么解決方法？答：1膜沒有均勻浸濕，PVDF膜轉(zhuǎn)膜前應(yīng)該用100%甲醇將膜完全浸濕10秒，快速激活；2膜或者緩沖液污染，拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，及時(shí)更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液；3封閉不充分，延長(zhǎng)封閉時(shí)間；4抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)，檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)，如果有，考慮更換封閉液；5抗體濃度過高，增加抗體稀釋倍數(shù)二、目的帶很弱

答：1標(biāo)本中靶蛋白含量低，可以加大樣品的上58四、條帶中出現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？答：膜和膠塊存在氣泡，轉(zhuǎn)膜時(shí)趕盡膜和膠塊之間的氣泡五、制備的凝膠不平？答：膠板洗刷干凈，加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻，溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻，室溫較高時(shí)，操作應(yīng)迅速。四、條帶中出現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？59六、用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？答：一般來說用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。七、檢測(cè)到的抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？

答：抗原形成了二聚體。增多β-巰基乙醇的量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開二聚體?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件60八、做western必須要內(nèi)參嗎？答：內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用，只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致的情況下，目的蛋白條帶出現(xiàn)的差異才有意義,表明的確是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的干預(yù)因素造成目的蛋白量的變化，而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化.所以內(nèi)參是必須做的。MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY,May2005,p.3563–3574八、做western必須要內(nèi)參嗎？MOLECULARAND61

內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，一般要選擇一個(gè)在處理因素作用的條件下蛋白含量不會(huì)發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍Tubulin55kD胞漿和全細(xì)胞VCDA1/Porin31kD線粒體COXIV16kD線粒體LaminB166kD細(xì)胞核TBP38kD細(xì)胞核內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家62八、非特異條帶多答：1抗體特異性不夠，考慮使用單抗，保證抗體的特異性；2蛋白降解，應(yīng)盡量使用新鮮制備的樣品，提取后一定要分裝，避免反復(fù)凍融。九、曝光后出現(xiàn)反像答：HRP含量過高導(dǎo)致，建議降低二抗的使用濃度八、非特異條帶多63免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence，IF）定義：將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。

原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence，IF）643T3LinePtK1LineNBL-6LineRK13LineLongitudinalFissureBloodVesselsCerebellum定位3T3LinePtK1LineNBL-6LineRK165直接法：熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。間接法：特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

分類直接法：熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。間接法：特66實(shí)驗(yàn)方法將培養(yǎng)好的貼壁細(xì)胞用PBS輕輕漂洗2次(PBS提前置室溫)，避免細(xì)胞脫落；4%多聚甲醛室溫固定30min(靜置)；PBS涮洗3次，然后搖床緩慢搖洗5min×3次；0.5%Triton-100室溫緩慢搖30min，涮洗3次；用與二抗同源的血清（10%），室溫緩慢搖晃封閉1h，置濕盒內(nèi)；用燒杯裝PBS，涮洗玻片一次；用紙將PBS吸干后，滴加一抗（約100ul），4度過夜，置濕盒中。鼠抗LRP16（1：100），兔抗p65（1：150）；PBS涮洗３次，搖床搖洗10min×３次；用紙將PBS洗干后，滴加二抗（羊抗鼠FITC[1：200］，羊抗兔594［1：600］）,濕盒，避光！室溫２h，加二抗以后所有操作均應(yīng)避光；DAPI染核７min（用PBS按1：2500稀釋）；PBS涮洗３次，搖床慢速搖洗10min×３次；封片：甘油－PBS（1：1），每張片子約需13ul；共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果或-20度保存。實(shí)驗(yàn)方法將培養(yǎng)好的貼壁細(xì)胞用PBS輕輕漂洗2次(PBS提前置67抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為孵育，通常37℃孵育0.室溫２h，加二抗以后所有操作均應(yīng)避光；NaCl150mMBloodVessels2蛋白降解，應(yīng)盡量使用新鮮制備的樣品，提取后一定要分裝，避免反復(fù)凍融。因?yàn)樗玫拿敢呀?jīng)標(biāo)記在特定的抗體上，可檢測(cè)的病毒種類只能局限于某一種。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱量或配膠時(shí)應(yīng)戴手套及口罩將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為孵育，通常37℃孵育0.抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。免疫雙擴(kuò)散：1:16以上，能達(dá)到1:64將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質(zhì),由于流經(jīng)路徑的差異,使不同分子質(zhì)量的組分分離.1．盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失。SDS是一種離子性的表面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈。結(jié)果判斷設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為孵育，通常37℃孵育0.結(jié)果判68免疫學(xué)三大工具比較免疫熒光

是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標(biāo)記技術(shù)，通過熒光激發(fā)，來對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。樣本是細(xì)胞或組織，要在顯微鏡下觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽(yáng)性、質(zhì)陽(yáng)性和核陽(yáng)性。

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）

用到了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色，待測(cè)的樣品多是血清、血漿、尿液、細(xì)胞或組織培養(yǎng)上清液，因而沒有用到組織包埋、切片等技術(shù)，這是與免疫組化的主要區(qū)別，操作上開始需要將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，從而使后來形成的抗原-抗體-酶-底物復(fù)合物粘附在載體上，這就是“吸附”的含義。免疫組化和elisa所用到的原理大致相同，只是因?yàn)樗鶛z測(cè)的樣品不同，從而在操作方法上有所不同。ELISA多用于定量分析，其靈敏度非常高。

westernbolt

先要進(jìn)行SDS，然后將分離開的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來檢測(cè)樣品，可以用于定性和半定量。

免疫學(xué)三大工具比較免疫熒光

是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異69ELISA與westernblot比較westernblotting可以看到特異性的條帶，但是定量比較麻煩ELISA可以直接讀出濃度，但是如果抗體有非特異性結(jié)合，那得到的數(shù)值就不可信；WB只能半定量,但是可以檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白,這點(diǎn)ELISA做不到；WB所檢測(cè)的一般是抗原，而ELISA抗原抗體都可以檢測(cè)；WB所檢測(cè)的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚體、降解產(chǎn)物等，一句話，WB可以確定所用抗體是與那種蛋白起作用的；而ELISA無能為力；WB一次處理量就是一塊膠版，10-20個(gè)樣品最多了。ELISA一塊96孔板一次可以處理96個(gè)樣本，可以設(shè)置多個(gè)復(fù)孔、對(duì)照、梯度樣等來提高檢測(cè)的可信度；ELISA與westernblot比較westernbl70免疫共沉淀（Co-IP)用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。免疫共沉淀（Co-IP)用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該71染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch-IP)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,Ch-IP）是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch-IP)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chrom72購(gòu)買抗體時(shí)要注意廠商的標(biāo)注適合于做什么實(shí)驗(yàn),使用濃度多少WB（Westernblotting，免疫印跡)IH(Immunohistochemistry,免疫組織化學(xué))IC(Immunocytochemistry,免疫細(xì)胞化學(xué))IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫電鏡)FCM(FlowCytometry,流式細(xì)胞儀)ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),酶聯(lián)免疫分析)購(gòu)買抗體時(shí)要注意廠商的標(biāo)注適合于做什么實(shí)驗(yàn),使用濃度多少73舉例舉例74復(fù)習(xí)思考題簡(jiǎn)述IF、westernblot、ELISA的在應(yīng)用中的區(qū)別。

復(fù)習(xí)思考題簡(jiǎn)述IF、westernblot、ELISA的在75實(shí)驗(yàn)方法新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),健康,無病原基礎(chǔ)免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆粒抗原)0.5ml佛式完全佐劑(CFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射加強(qiáng)免疫間隔2-4周,可進(jìn)行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射實(shí)驗(yàn)方法新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),健康,無病原76單抗與多抗比較

單抗多抗抗體組成單一復(fù)雜抗體性質(zhì)個(gè)體的屬性群體綜合的性質(zhì)純化標(biāo)記容易，效果好難度高一些種屬來源絕大多數(shù)是小鼠兔、羊、豚鼠等制備周期長(zhǎng)(最短4個(gè)月）短（2個(gè)月）制備技術(shù)復(fù)雜簡(jiǎn)單經(jīng)費(fèi)多少單抗與多抗比較77共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果或-20度保存。ECL發(fā)光相對(duì)于DAB顯色而言，具有發(fā)光持久，靈敏度高(一般可達(dá)到pg級(jí)以上)等優(yōu)點(diǎn)，且DAB具有致癌性。（EdwinMellorSouthern）同時(shí),血清中含有的雜蛋白比較多。每種測(cè)定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。免疫熒光

是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標(biāo)記技術(shù)，通過熒光激發(fā)，來對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。豚鼠（guineapig）：國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用。利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離.3轉(zhuǎn)膜過程出現(xiàn)失誤；細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存。大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.切勿反復(fù)凍融已制備好的樣品。單抗多抗基本步驟包被封閉孵育洗滌顯色結(jié)果測(cè)定共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果或-20度保存?；静襟E包被78應(yīng)用范圍檢測(cè)組織、細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況（定性、半定量）應(yīng)用范圍791.轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)用2.檢查樣品凝膠是否與轉(zhuǎn)移槽的“-”側(cè)保持一致，以確保樣品蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。3.NC膜應(yīng)小心操作，防止破裂注意事項(xiàng)：1.轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)用注意事項(xiàng)：80DAB顯色原理：DAB在HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物，從而指示目的蛋白位置及強(qiáng)弱。ECL發(fā)光相對(duì)于DAB顯色而言，具有發(fā)光持久，靈敏度高(一般可達(dá)到pg級(jí)以上)等優(yōu)點(diǎn)，且DAB具有致癌性。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光，膜可以再生檢測(cè)其他蛋白。DAB顯色原理：DAB在HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物，從81一、膜上沒有信號(hào)

答：原因有很多：1細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；2細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性，并且提取過程冰上操作；3轉(zhuǎn)膜過程出現(xiàn)失誤；4抗體或酶失活，選擇在有效期內(nèi)的試劑；5抗體不能識(shí)別目的蛋白，多看看說明，看該抗體是否適用于western。結(jié)果分析結(jié)果分析82免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence，IF）定義：將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。

原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence，IF）83免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)84抗體定義：指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。醫(yī)學(xué)應(yīng)用：科研應(yīng)用：免疫共沉淀、免疫印跡、染色質(zhì)免疫共沉淀、免疫熒光技術(shù)、ELISA等1.診斷：各類血清學(xué)檢測(cè)，抗人球蛋白測(cè)試，早孕檢測(cè)等2.治療：?jiǎn)慰寺】贵w療法（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化癥等），腫瘤治療?？贵w定義：指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)85多抗來源動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中，即為多克隆抗體。多抗來源動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不86多克隆抗體制備動(dòng)物選擇：兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動(dòng)物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產(chǎn)抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用。多克隆抗體制備動(dòng)物選擇：87基本步驟延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間增強(qiáng)吞噬作用刺激抗原提呈促進(jìn)細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖影響T細(xì)胞“極化”佐劑的作用機(jī)理：抗原制備：商品化或自行表達(dá)基礎(chǔ)免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐劑（ComplateFreund’adjuvand,含礦物油,卡介苗等)。加強(qiáng)免疫：第2次以后，抗原量減半，多次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).取血測(cè)效價(jià)：加強(qiáng)免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清：可一次放血(頸動(dòng)脈)也可多次取血(耳靜脈)基本步驟延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間促進(jìn)細(xì)胞因子分泌佐劑的作用機(jī)理：抗88實(shí)驗(yàn)方法新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),健康,無病原基礎(chǔ)免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆?？乖?0.5ml佛式完全佐劑(CFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射加強(qiáng)免疫間隔2-4周,可進(jìn)行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射實(shí)驗(yàn)方法新西蘭大耳白，2000g(雌雄均可),健康,無病原89實(shí)驗(yàn)方法免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測(cè)效價(jià)酶聯(lián)法：1:104以上，能達(dá)到1:106。免疫雙擴(kuò)散：1:16以上，能達(dá)到1:64效價(jià)達(dá)到要求的可放血制備血清可一次放血(頸動(dòng)脈)也可多次取血(耳靜脈)實(shí)驗(yàn)方法免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測(cè)效價(jià)90米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。于450nm處，以空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔OD值。誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）；抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標(biāo)記。答：膜和膠塊存在氣泡，轉(zhuǎn)膜時(shí)趕盡膜和膠塊之間的氣泡SDS0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點(diǎn)注射0.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.以P/N值(陽(yáng)性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫電鏡)免疫熒光

是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標(biāo)記技術(shù)，通過熒光激發(fā)，來對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。多抗的特點(diǎn)多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質(zhì)是一個(gè)群體綜合的性質(zhì)。比單抗更容易捕捉抗原。因?yàn)楹锌共煌砦坏目贵w，多種抗體都可與抗原結(jié)合。特異性相對(duì)較差：因?yàn)橛刹煌再|(zhì)的抗體組成，只要其中含交叉反應(yīng)的抗體，多抗就有交叉反應(yīng)，所以多抗更容易有交叉反應(yīng)?？贵w的純化、標(biāo)記比單抗難：因?yàn)楹懈鞣N不同類型、亞類的抗體，提純、標(biāo)記的方法有所差別。同時(shí),血清中含有的雜蛋白比較多。米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在91什么情況下需要制備單克隆抗體目的蛋白有結(jié)構(gòu)類似物抗原不純，無法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應(yīng)）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑什么情況下需要制備單克隆抗體目的蛋白有結(jié)構(gòu)類似物92單抗制備原理如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。1975年分子生物學(xué)家克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。將這種雜交瘤作單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，可形成單細(xì)胞系，即單克隆。利用培養(yǎng)或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等都是一致的，而且在培養(yǎng)過程中，只要沒有變異，不同時(shí)間所分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)與機(jī)能。單抗制備原理如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，93單抗制備原理HGRPT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黃嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)單抗制備原理HGRPT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶T94基本步驟基本步驟95實(shí)驗(yàn)方法免疫小鼠選擇體重18－20gBALB/C雌性小鼠，用制備抗原免疫。50—100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。細(xì)胞融合取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50%PEG（Sigma）作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法免疫小鼠96陽(yáng)性細(xì)胞篩選細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法，用包被液稀釋成1－10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃過夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1－10％的脫脂奶粉或1－3％BSA或3－6％牛血清封閉30-60min;加入陽(yáng)性孔培養(yǎng)上清100ul/孔，37℃1－2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃1－2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/LH2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD492的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。獲分別對(duì)上述抗原有特異性反應(yīng)的陽(yáng)性孔。篩選出的特異性陽(yáng)性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲對(duì)上述抗原有特異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存。陽(yáng)性細(xì)胞篩選細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次97雜交瘤細(xì)胞的凍存雜交瘤細(xì)胞通常用含有8％--10%的二甲亞砜和20％小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個(gè)月短期保存。凍存細(xì)胞需要緩慢降溫，復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。雜交瘤細(xì)胞的凍存雜交瘤細(xì)胞通常用含有8％--10%的二甲亞砜98單克隆抗體腹水制備及純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體：取1倍體積腹水加2倍體積0.06MPH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70℃保存。單克隆抗體腹水制備及純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注99其他抗體純化方法鹽析法（硫酸銨沉淀)離子交換法親和層析法凝膠過濾法其他抗體純化方法鹽析法（硫酸銨沉淀)100鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下,蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀硫酸銨是最常用的中性鹽不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同硫酸銨的加入量通常以飽和度表示

(100%飽和度:767g/L)特點(diǎn)成本低，步驟簡(jiǎn)單?？贵w的回收率比較高?？贵w純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適合于做各種標(biāo)記。需要高速離心機(jī)。鹽析法（硫酸銨沉淀)原理101正辛酸-硫酸銨沉淀法原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白.

正辛酸是一種有機(jī)酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀.特點(diǎn)成本較低，步驟較復(fù)雜?？贵w回收率很低?？贵w純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標(biāo)記。需要高速離心機(jī)，耐高速離心的玻璃離心管。正辛酸-硫酸銨沉淀法原理102目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。1212-60免疫共沉淀（Co-IP)可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。而用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性?？贵w組成單一復(fù)雜BloodVesselsWesternBlot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必須盡量使各組之間總蛋白量基本一致;2．細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白酶抑制劑的種類很多，要根據(jù)具體情況具體選擇。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。也有用PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見。丙烯酰胺濃度(%)線性分離范圍／KDa7.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，洗滌3次，5min/次。但是對(duì)有些病毒的株系，夾心ELISA并不是很好的選擇。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也是作為判斷結(jié)果的對(duì)照。1．盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失。將樣品的pH值調(diào)至等電點(diǎn)以上,使樣品帶負(fù)電荷.