HY∕T 147.5-2013 海洋監(jiān)測技術規(guī)程 第5部分：海洋生態(tài)

學兔兔學兔兔標準下載HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載中華人民共和國海洋行業(yè)標準HY/T147.5—2013海洋監(jiān)測技術規(guī)程

第5部分:海洋生態(tài)Codeofpracticeformarinemonitoringtechnology一

Part5：Marineecology2013-04-25發(fā)布國家海洋局2013-05-01實施2013-04-25發(fā)布國家海洋局TOC\o"1-5"\h\zHUW V1酬 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14浮游病毒總數(shù)——染色計數(shù)法 25沉積物中病毒總數(shù)——染色計數(shù)法 46弧菌總數(shù)——平板計數(shù)法 67腸球菌——最大可能數(shù)法(MPN)和濾膜法 68糞大腸菌群——測試片法 69分級葉綠素a——熒光法 1110分級初級生產(chǎn)力——“C同位素法 1511赤潮甲藻孢囊——光學顯微鏡法 1812微微型浮游植物——熒光顯微鏡計數(shù)法 1813微型浮游生物——顯微鏡個體計數(shù)法 2014小型浮游生物——顯微鏡個體計數(shù)法 2415魚類浮游生物——體視顯微鏡計數(shù)法 2416珍稀瀕危動物調(diào)査——調(diào)訪觀測法 2717濱海濕地植物——野外勘查法 3018腹瀉性貝毒一酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA) 3319麻痹性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA) 3320麻痹性貝毒——髙效液相法(HPLC) 3321記憶缺失性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA) 3622神經(jīng)性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA) 3623金黃色葡萄球菌——測試片法 3624沙門氏菌一微孔板試劑盒法 3925李斯特菌——測試片法 4226真菌 測試片法 4527海水中副溶血弧菌——聚合酶鏈式反應(PCR)法 4728海水中創(chuàng)傷弧菌——聚合酶鏈式反應(PCR)法 4929海水中河流弧菌——聚合酶鏈式反應(PCR)法 5030海水中溶藻弧菌——聚合酶鏈式反應(PCR)法 5131海水中哈氏弧菌一聚合酶鏈式反應(PCR)法 5232海水中霍亂弧菌——聚合酶鏈式反應(PCR)法 53HY/T147.5—2013TOC\o"1-5"\h\z33海水中鰻弧菌——聚合酶鏈式反應(PCR)法 5434海水中甲肝病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法 5535海水中諾如病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法 5536海水中星狀病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法 5537海水中輪狀病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法 5738海水中腺病毒——聚合酶鏈式反應(PCR)法 5839海水中腸道病毒一反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法 5940蝦類桃拉病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法 6041蝦類白斑綜合征病毒——聚合酶鏈式反應(PCR)法 6042魚類淋巴囊腫病毒——聚合酶鏈式反應(PCR)法 6043魚類虹彩病毒——聚合酶鏈式反應(PCR)法 6144貝類帕金蟲——雷氏液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)(RFTM)法和聚合酶鏈式反應(PCR)法……6145貝類單孢子蟲——聚合酶鏈式反應(PCR)法 6146微生物分子鑒定——限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)法 6147糞便污染源微生物示蹤監(jiān)測——重復性基因外回文序列聚合酶鏈式反應(REP-PCR)法 6448赤潮藻種分子鑒定——熒光原位雜交(FISH)法 6849海洋污染物生物毒性檢驗——發(fā)光細菌法 7050海洋污染物生物毒性檢驗——藻類檢驗法 7351海洋污染物生物毒性檢驗——多毛類檢驗法 7652海洋污染物生物毒性檢驗——軟體動物檢驗法 8053海洋污染物生物毒性檢驗一甲殼類檢驗法 8254海洋污染物生物毒性檢驗——棘皮類檢驗法 8555海洋污染物生物毒性檢驗——魚類檢驗法 8756海洋沉積物生物毒性檢驗——端足類檢驗法 89附錄A(規(guī)范性附錄)記錄表 96附錄B(資料性附錄)生理鹽水和細菌、真菌計數(shù)表 129附錄C(規(guī)范性附錄)被檢樣品中細菌最可能數(shù)(MPN)表 132附錄D(規(guī)范性附錄)浮游生物樣品編號、生物量測定、計數(shù) 133附錄E(規(guī)范性附錄)比色卡 135附錄F(規(guī)范性附錄)沙門氏菌確認檢驗流程圖 136附錄G(規(guī)范性附錄)單核細胞增生李斯特菌確認檢驗流程 137附錄H(資料性附錄)PCR法檢測7種弧菌電泳模擬圖 138附錄1(資料性附錄)PCR.RT-PCR法檢測10種病毒電泳模擬圖 139附錄J(資料性附錄)受試生物——日本大螯蜚 140圖1糞大腸菌群測試片直接計數(shù)法檢測程序 8圖2糞大腸菌群測試片MPN計數(shù)法檢測程序 10nTOC\o"1-5"\h\z圖3文昌魚年齡結構模式圖 30圖4金黃色葡萄球菌測試片直接計數(shù)法檢驗程序 37圖5金黃色葡萄球菌測試片MPN計數(shù)法檢驗程序 39圖6微孔板試劑盒法快速檢測沙門氏菌流程 40圖7單核細胞增生李斯特菌測試片檢驗程序 44圖8霉菌與酵母菌的檢驗程序 46圖E.1沙門氏菌微孔板試劑盒檢測法結果判讀比色卡 135圖F.1沙門氏菌確認檢驗流程圖 136圖G.1單核細胞增生李斯特菌確認檢驗流程 137圖H.1PCR法檢測7種弧菌電泳模擬圖 138圖1.1PCR、RT-PCR法檢測10種病毒電泳模擬圖 139表1水樣采集層次 11表2各種網(wǎng)具規(guī)格及適用對象 25表3植物群落樣地描述調(diào)査表 31表4各類麻痹性貝毒檢出限參考表 35表5用于熒光原位雜交試驗的探針情況 69表6氯化汞工作液稀釋配制系數(shù) 71表A.1浮游病毒及微微型浮游生物海上采樣記錄表 96表A.2浮游或沉積物病毒直接計數(shù)記錄表 97表A.3葉綠素采樣記錄表 98表A.4葉綠素（萃取熒光法）測定記錄表 99表A.5初級生產(chǎn)力粒度分級采樣、過濾、測定記錄表 100表A.6微微型光合浮游生物細胞數(shù)量記錄表 101表A.7微型浮游生物海上采樣記錄表 102表A.8微型浮游生物樣品登記表 103表A.9水樣浮游生物標本個數(shù)計數(shù)記錄表 104表A.10微型浮游生物標本個數(shù)計數(shù)記錄表 105表A.11微型浮游生物數(shù)量統(tǒng)計表 106表A.12微型浮游生物種類名錄 107表A.13魚類浮游生物海上采集記錄表 108表A.14魚類浮游生物標本登記表 109表A.15魚類浮游生物計數(shù)記錄表 110表A.16魚類浮游生物數(shù)量統(tǒng)計表 111表A.17海洋珍稀瀕危游泳動物觀測記錄表 112表A.18海洋珍稀瀕危游泳動物觀測結果統(tǒng)計表 112表A.19珍稀瀕危海鳥類樣點觀測記錄表 113表A.20珍稀瀕危海鳥類樣帶觀測記錄表 113表A.21文昌魚現(xiàn)場采樣記錄表 114表A.22文昌魚種群結構室內(nèi)分析記錄表 114表A.23濱海濕地植物調(diào)査記錄表 115表A.24海水中病原性弧菌檢測記錄表 116表A.25海洋病毒記錄表 117111IV學兔兔IV學兔兔標準下載IV學兔兔IV學兔兔標準下載HY/T147.5—2013TOC\o"1-5"\h\z表A.26魚類淋巴囊腫病毒檢測記錄表 118表A.27生物毒性檢驗現(xiàn)場采樣記錄表 119表A.28發(fā)光細菌急性毒性測定試驗記錄表 120表A.29發(fā)光細菌法測定環(huán)境毒性的分級標準 120表A.30藻類毒性試驗記錄表 121表A.31百分率與概率單位換算表 122表A.32藻類毒性試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計換算登記表 123表A.33 海洋生物毒性試驗記錄表 124表A.34海洋生物毒性試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計換算登記表 125表A.35端足類毒性試驗生物結果記錄表 ?. 126表A.36端足類毒性試驗物理結果記錄表 127表A.37端足類毒性試驗生物結果統(tǒng)計表 128表B.1細菌（真菌）測試片直接計數(shù)表 130表B.2細菌測試片MPN計數(shù)表 131表C.1被檢樣品中細菌最可能數(shù)（MPN）表 132HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載HY/T147《海洋監(jiān)測技術規(guī)程》分為七個部分： 第1部分:海水；——第2部分:沉積物；——第3部分:生物體；——第4部分:海洋大氣；——第5部分:海洋生態(tài)；——第6部分:海洋水文、氣象與海冰；一第7部分:衛(wèi)星遙感技術方法。本部分為HY/T147的第5部分。本部分按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本部分由國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心提出。本部分由全國海洋標準化技術委員會(SAC/TC283)歸口。本部分起草單位：國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心、國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心、國家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測中心、國家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測中心。本部分主要起草人:韓庚辰、樊景鳳、馬永安、姜文博、張振冬、林鳳翱、李洪波、梁斌、許道艷、邵魁雙、李冬梅、劉永健、劉述錫、袁秀堂、閆啟侖、柳圭澤、王立俊、劉長安、馮志權、王真良、劉娜、于占國、黃楚光、髙陽、李秀芹、韋桂秋、易斌、肖瑜璋、陳嘉輝、李海濤、熊小飛、董燕紅、吳施衛(wèi)、盧楚謙、程祥圣、劉材材、孫亞偉、秦玉濤、李益云、夏永健、樊立靜、紀煥紅、黃輝、郜鈞璋、忻丁豪、宋晨瑤、崔文林、齊衍萍、張琪、王泰森、主小清、李欽亮、趙升、孫蓓蓓、張清波。海洋監(jiān)測技術規(guī)程

第5部分：海洋生態(tài)1范圍HY/T147的本部分規(guī)定了海洋生物生態(tài)的樣品采集、試驗、分析、資料整理等方法的技術要求。本部分適用于近岸、近海、遠海海域的生物生態(tài)的監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB3097海水水質(zhì)標準GB4789.4-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗GB4789.30—2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗GB4789.38食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)GB/T12763.1海洋調(diào)查規(guī)范第1部分：總則GB/T12763.6—2007海洋調(diào)查規(guī)范第6部分:海洋生物調(diào)查GB17378.3海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分:樣品采集、貯存與運輸GB17378.5海洋監(jiān)測規(guī)范第5部分:沉積物分析GB17378.7—2007海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分:近海污染生態(tài)調(diào)査和生物監(jiān)測GB18668海洋沉積物質(zhì)量GB19489實驗室生物安全通用要求海洋災害調(diào)査技術規(guī)范第3部分:海洋生態(tài)災害調(diào)查3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。1浮游生物plankton缺乏發(fā)達的運動器官，沒有或僅有微弱的運動能力，懸浮在水層中，常隨水流移動的生物。包括浮游植物和浮游動物兩大類。浮游生物依個體的大小可分為以下幾種類型：粒徑小于2的稱微微型浮游生物(picoplankton)；粒徑為2pm?20p.m的稱微型浮游生物(nanoplankton)；粒徑為20pm?200fj.m的稱小型浮游生物(microplankton或netplankton)；粒徑為200pm?2000ptm的稱中型浮游生物(mesoplankton);粒徑為2000fzm~20mm之間的，稱為大型浮游生物(macroplankton)；粒徑大于20mm的稱巨型浮游生物(megaplankton)?此夕卜，魚類浮游生物(ichthyoplankton)即為魚卵和仔稚魚。[GB/T12763.6—2007,定義3.10]3.2距離抽樣distancesampling利用不同距離和生境內(nèi)的鳥類辨識技術，在一定范圍或距離內(nèi)估算鳥類數(shù)量，收集生態(tài)種群數(shù)據(jù)。HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載抽樣方法包括樣點法和樣帶法。3.3樣點法pointcount在一定時間內(nèi)，觀察者于固定的觀察點對鳥類進行觀察計數(shù)的方法，可以用于估計鳥類種群的相對密度，也可與距離估測結合計算絕對密度。該方法適用于調(diào)査高度可見的、鳴叫的以及在廣闊生境中的鳥種，一般用于調(diào)査雀形目鳥類。3.4樣帶法linetransect在一定時間內(nèi)，觀察者沿固定的線路行進，并對線路兩側所見到的鳥類進行觀察計數(shù)的方法，行進方式在陸地上可以是沿樣帶行走、駕車，在海上可行船，或在空中飛行。該方法適用于調(diào)查髙度開放生境中的鳥類，也適用于調(diào)查離開海岸的海鳥和水鳥。3.5微生物源示蹤microbialsourcetracking以某些具有代表性的微生物作為示蹤因子，對環(huán)境樣品中的污染物質(zhì)進行跟蹤溯源的監(jiān)測技術。3.6基因指紋圖譜庫genefingerprintlibrary將獨有的基因片段作為特異性的指紋標記，用以判斷基因來源而構建的比對用數(shù)據(jù)庫。3.7沉積物毒性檢驗sedimenttoxicitytest通過將試驗生物直接暴露于沾污沉積物的方法來確定沉積物中污染物質(zhì)的生物效應。3.8加標spiked在實驗室通過在清潔沉積物或海水中按一定濃度加入一種或幾種具有潛在毒性化學物質(zhì)的過程。3.9上覆水overlyingwater沉積物毒性檢驗試驗中加人試驗容器里面固相沉積物上面的試驗海水。4浮游病毒總數(shù)一染色計數(shù)法1適用范圍本方法適用于海水中浮游病毒的豐度檢測。4.2方法原理熒光染料SYBRGreenI與病毒核酸嵌合，在熒光顯微鏡藍色光激發(fā)下呈針扎狀、亮綠色。根據(jù)顆粒大小分辨浮游病毒。4.3儀器設備儀器設備應符合以下要求：a）落射熒光顯微鏡；?b）抽濾裝置:包括濾器、支架、抽濾瓶和真空泵；c） 襯墊濾膜：醋酸纖維濾膜，直徑25mm,孔徑0.45Mm、0.8pm；d） 氧化鋁濾膜:直徑25mm，孔徑0.02Mm;e）離心管：5mL?15mL，用5%HC1溶液浸泡1d以上，經(jīng)0.02濾膜過濾的蒸餾水漱洗并高壓滅菌；D無色指甲油。4.4試劑及其配制試劑及其配制要求如下：a） 戊二醛溶液：市售分析純級；b） SYBRGreenI：市售，冷凍暗保存；c） 10%p-苯二胺儲備液:避光冷凍保存；d） PBS甘油儲備液：將50%的PBSC8.5gNaCl,2.2gNa2HPO4,0.15gNaH2PO4,l000mL蒸餾水，pH值為7.5）和體積分數(shù)為50%的甘油混合，冷藏保存。4.5樣品采集與處理樣品采集詳細信息記錄于表A.10取水樣15mL?50mL置于滅菌離心管中，加固定劑戊二醛溶液至終濃度為0.5%；避光冷藏保存，應在7d內(nèi)分析；超低溫（一80C）避光保存，宜在30d內(nèi)分析完畢。4.6分析步驟分析步驟如下：a） 濾器裝配：長期未用的濾器應先裝好濾器和抽濾裝置，用經(jīng)0.02 濾膜過濾的高壓滅菌蒸餾水加滿濾筒并抽濾清洗2次?3次（當天使用的濾器，在各個樣品測定前用同樣方法清洗一次，清洗時不應取下襯墊濾膜）；卸下濾筒在襯墊濾膜上放置氧化鋁濾膜，裝配好濾筒。b） 配制染色劑：取出SYBRGreenI,用經(jīng)0.02Mm濾膜過濾的無菌去離子水按1:10稀釋，操作應在弱光環(huán)境中進行，未用完的染色劑應立即避光冷凍保存。c） 配制熒光保護劑工作液：取10%的〆苯二胺儲備液，化霜、搖勻后吸取10ML與990PBS甘油儲備液混合，制成工作液。d） 加樣：加人0.1mL?2mL樣品（視野病毒數(shù)控制在200個以下），若樣品量少于1mL則應加入經(jīng)0.02 濾膜過濾的超純水稀釋至1mL，再加樣。e） 抽濾：在負壓15kPa~20kPa條件下，把樣品抽濾至干。f） 染色：用移液器吸取97.5經(jīng)0.02濾膜過濾的無菌去離子水，滴入干凈的無菌塑料培養(yǎng)皿，再加人2.5 10%的SYBRGreen1染色劑工作液（染色劑濃度為0.25%），取下氧化鋁濾膜，將膜的非載樣面放在培養(yǎng)皿的染色液上，冰浴、避光染色15min。g） 制片：染色后，取出濾膜，吸干濾膜背面及邊緣的液滴，把濾膜緊貼于滅菌載玻片上（載樣面朝上），加30mL熒光保護劑，加上蓋玻片，濾膜上下兩面均不應有氣泡，用無色指甲油密封蓋玻片四周，制片可冷凍保存30d。h） 計數(shù)：在熒光顯微鏡藍色濾光片、油鏡下觀測，病毒顆粒呈針扎狀、亮綠色，細菌亦呈亮綠色，但其亮度強于病毒顆粒，且菌體比病毒顆粒大得多。隨機選取至少20個視野，計算病毒顆粒數(shù)。記錄總數(shù)不少于300個病毒顆粒。4.7記錄和計算記錄將記錄和計算結果記入表A.2中。3HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013(1)學兔兔學兔兔標準下載HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013(1)學兔兔學兔兔標準下載4.7.2豐度計算浮游病毒豐度以個/mL表示。按式（1）計算樣品病毒豐度：式中：N——樣品病毒豐度，單位為個每毫升（個/mL）；N.——各視野平均病毒數(shù)，單位為個；S——濾膜實際過濾面積，單位為平方厘米（cm2）；S（——顯微鏡視野面積，單位為平方厘米（cm2）；f——固定劑終濃度；V——過濾樣品量，單位為毫升（mL）。4.8注意事項注意事項如下：a） 樣品宜保存在低溫黑暗條件下；b） 操作過程中所涉及的容器、器皿均應事先滅菌；c） 為減少誤差，觀測視野應大于20個，且病毒總計數(shù)應大于300個，保證足夠的視野數(shù)；d） 未用完的10%/）-苯二胺儲備液應立即冷凍保存，但累計凍、融不應超過3次；如果儲備液呈棕色，應棄之不用并重新配制；e） 測定時應做空白對照，空白制片中每個視野不應出現(xiàn)3個以上病毒。5沉積物中病毒總數(shù)——染色計數(shù)法1適用范圍本方法適用于海洋表層沉積物中病毒的豐度測定。5.2方法原理見4.205.3儀器設備儀器設備應符合以下要求：a)箱式采泥器；b)超聲波清洗儀；c)離心機，轉(zhuǎn)速不低于1000r/mind)旋渦振蕩器；e)分析天平：感量士0.01g；f)無菌勺；g)其他儀器設備見4.3。5.4試劑及其配制焦磷酸鈉；其他試劑見4.4。HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載5.5樣品采集處理5.5.1泥樣采集樣品采集如下：a） 用箱式采泥器采集未受干擾的沉積物；b） 用無菌勺取上層2cm的泥沙樣兩份（1g?10g）置于50mL離心管內(nèi)，并稱重記錄泥沙重量；c） 加人經(jīng)0.02 氧化鋁膜過濾的戊二醛滅菌海水溶液4mL（終濃度2%）,冷藏保存直到分析。5.5.2樣品處理樣品處理如下：a） 用焦磷酸鈉（終濃度5mmol/L）萃取樣品，劇烈搖動混勻，孵化15min?30min；b） 樣品離心管外圍用碎冰包圍，置于超聲波清洗儀分散處理3次，每次1min，間隔30s；c） 用旋渦振蕩器振動樣品1min，于1000r/min條件下離心1min；d） 取上清液置于一80*€超低溫冷凍保存，直至豐度檢測。5.6分析步驟見4.6。5.7記錄和計算5.7.1豐度計算沉積物中病毒豐度以個/g表示。按式（2）計算樣品病毒豐度：式中：N——樣品含病毒豐度數(shù)，單位為個每克（個/g）;N.——各視野平均病毒數(shù)，單位為個；S——濾膜實際過濾面積，單位為平方厘米（cm2）；S,——顯微鏡視野面積，單位為平方厘米（cm2）；f——固定劑終濃度；M——樣品濕重重量，單位為克（g）。結果記錄把記錄和計算結果記人表A.2中。5.8注意事項注意事項如下：a） 泥樣宜是上層2cm以上的泥樣；b） 超聲波處理泥樣時，應冰浴，防止溫度升高;c） 其他見4.8。HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載HY/T147.5—2013HY/T147.5—2013學兔兔學兔兔標準下載6弧菌總數(shù)一平板計數(shù)法按《海洋災害調(diào)查技術規(guī)范第3部分:海洋生態(tài)災害調(diào)查》的要求執(zhí)行。7腸球菌——最大可能數(shù)法（MPN）和濾膜法按《海洋災害調(diào)查技術規(guī)范第3部分:海洋生態(tài)災害調(diào)查》的要求執(zhí)行。8糞大腸菌群一測試片法1適用范圍本方法適用于海水、海洋沉積物和海洋魚、蝦、蟹、貝、藻類等生物樣品中糞大腸菌群的快速檢驗。本方法包括直接計數(shù)法與最大可能數(shù)（mostprobablenumber,簡稱MPN）計數(shù)法，當兩種方法所獲結果發(fā)生矛盾時，以直接計數(shù)法為仲裁方法。8.2直接計數(shù)法1方法原理大腸菌群測試片是一種預先制備好的培養(yǎng)基，含有紫羅蘭紅膽汁（VRB）培養(yǎng)基、冷水可溶性凝膠和氯化三苯四氮唑（TTC）指示劑等，可增強大腸菌群菌落的計數(shù)效果。同時該培養(yǎng)基系統(tǒng)表面覆蓋的膠膜可截留發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生的氣體，因此紅色菌落周圍有氣泡形成。44.5X：土0.5T培養(yǎng)24h士2h后計數(shù)周圍有氣泡的紅色菌落數(shù)，即為糞大腸菌群數(shù)，亦稱耐髙溫大腸菌群數(shù)。8.2.2儀器設備儀器設備應符合以下要求：a） 超凈工作臺；b） 恒溫培養(yǎng)箱：44.5C土0.5c） 干熱灰菌箱；d） 冰箱：2°C~5°C；e） 髙壓蒸汽滅菌器；f） 便攜式冷藏箱；g） 天平或電子秤：感量0.1g；h） 無菌錐形瓶：150mL；i） 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm；j） 無菌試管：180mmX18mm；k） 無菌采水瓶、擊開式采水器；l） 無菌刀、勺子、剪子、鑷子等；m） 大腸菌群測試片壓板：1mL,5mL；n） 移液器及其吸頭或無菌吸管lmL、10mL;o） 75%酒精棉球；P）采泥器；q） 一次性無菌乳膠手套；r） —次性無菌塑料袋；s） 采集貝類的耙子、刮刀；t） 采集網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類、甲殼類的手撈網(wǎng)；u） 滅菌玻璃研缽或均質(zhì)器（旋刀式或拍擊式）；v） 放大鏡、菌落計數(shù)器或菌落自動判讀儀。8.2.3試劑和測試片試劑和測試片如下：a） 生理鹽水：參見附錄B;b） 髙靈敏度大腸菌群測試片；c） 大腸菌群測試片。8.2.4樣品采集與預處理1海水樣品海水樣品的采集和預處理如下：a） 采集：根據(jù)需要使用擊開式采水器和無菌采水瓶采取表層或其他水層海水樣品100mL~200mL，并立即冷藏保存，24h內(nèi)送回實驗室進行檢驗分析，細菌（真菌）計數(shù)表要求記錄采樣時間、現(xiàn)場水溫、鹽度等參見附錄B；b） 預處理:無菌移取海水樣品5mL至裝有45mL無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10—1稀釋樣品；依此類推，無菌移取1CT1稀釋樣品5mL至裝有45mL無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成1（T2稀釋樣品。2.4.2沉積物樣品沉積物樣品的采集和預處理如下：a） 采集：用無菌刀先刮去采泥器采取的表層沉積物表面，再用無菌勺根據(jù)需要挖取約100g~200g沉積物樣品并裝入無菌塑料袋中，擠出袋內(nèi)空氣，將袋口扎好，做好標簽，再將此袋和做好的標簽一起放人另一個無菌袋中。將外層袋內(nèi)空氣擠出、袋口扎好，冷藏保存，24h內(nèi)送回實驗室進行檢驗分析，細菌（真菌）計數(shù)表要求記錄采樣時間、現(xiàn)場水溫、鹽度等參見附錄B；b） 預處理：用無菌不銹鋼勺無菌移取表層沉積物樣品5g至裝有45mL無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10_：稀釋樣品；再無菌移取1CT1沉積物稀釋樣品5mL至裝有45mL無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10—2稀釋樣品；依此類推，可以制備10一3稀釋樣品。2.4.3生物樣品生物樣品的采集和預處理程序如下，a）采集：1）采集貽貝、牡蠣等附著性貝類，首先將刮刀用酒精棉球消毒，然后用刮刀將貽貝或牡蠣從附著物上采集下來。再帶好一次性消毒手套隨機選取無機械損傷的活貝樣品于無菌塑料袋中，每個樣品根據(jù)需求和采集對象的規(guī)格，采集5個?30個（能剖出10g?80g鮮重貝肉）即可。擠出袋內(nèi)空氣，將袋口扎好，做好標簽，再將此袋和做好的標簽一起放人另一個無菌袋中。將外層袋內(nèi)空氣擠出、袋口扎好，冷藏保存，24h內(nèi)送回實驗室進行檢驗分析。2） 采集文蛤、雜色蛤、四角蛤蜊等底埋性貝類，首先將耙貝類耙子用酒精棉球消毒，耙取底埋貝類，然后再戴好一次性消毒手套將耙出的貝類樣品采集到無菌塑料袋中。把樣品裝人無菌袋中，做好標簽、扎好袋口，做好記錄，樣品及時冷藏保存。3） 采集浮筏養(yǎng)殖的海帶、裙帶菜等大型藻類樣品，首先將剪取樣品的剪刀用酒精棉球消毒，然后再戴好一次性消毒手套剪取大型藻類樣品并裝人無菌塑料袋中，做好標簽、記錄，樣品及時冷藏保存。4） 采集網(wǎng)箱養(yǎng)殖的魚類、甲殼類樣品，首先將撈取樣品的手抄網(wǎng)用紫外線消毒，然后再戴好一次性消毒手套撈取養(yǎng)殖的魚類、甲殼類樣品，并裝入無菌塑料袋中，做好標簽、記錄，樣品及時冷藏保存。上述各種生物樣品采集的同時細菌（真菌）計數(shù)表要求記錄采樣時間、現(xiàn)場水溫、鹽度等參見附錄B。所有生物樣品都應在24h內(nèi)送回實驗室進行檢驗分析。b）預處理:無菌剖（剪）取生物樣品5g，并剪碎至無菌玻璃研缽中，無菌研磨成肉糜后加人45mL無菌生理鹽水，充分稀釋，制備成1CT1稀釋樣品；再無菌移取10_*稀釋樣5mL至裝有45mL無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成1CT2稀釋樣;依此類推，可以制備i（r3、i（r4稀釋樣品。8.2.5檢驗操作程序檢驗操作程序如圖1所示。圖1