輔酶 I NAD (H)含量檢測(cè)試劑盒（WST 顯色法）說(shuō)明書(shū)- 微量法UPLC-MS-6008

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途！-上海液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有限公司第第頁(yè)輔酶INAD(H)含量檢測(cè)試劑盒（WST顯色法）說(shuō)明書(shū)貨號(hào)：UPLC-MS-6008規(guī)格：100T/48S產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系工作人員。

微量法試劑名稱(chēng)規(guī)格保存條件酸性提取液液體25mL×1瓶2-8℃保存堿性提取液液體25mL×1瓶2-8℃保存試劑一液體6mL×1瓶2-8℃保存試劑二液體2mL×1瓶2-8℃保存試劑三液體4mL×1瓶2-8℃保存試劑四液體0.9mL×1支-20℃保存試劑五液體15mL×1瓶2-8℃保存NAD標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1支-20℃保存NADH標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1支-20℃保存溶液的配制：1NAD標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.5mL2μmol/mL。-202周。2、NADH標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.4mL蒸餾水，即2μmol/mL。-20℃可以保存2周。產(chǎn)品說(shuō)明：II又稱(chēng)煙酰胺腺嘌呤二核NADH（I）NADHATP。NAD(H)在機(jī)體內(nèi)有重要的生理意義，與物質(zhì)代謝、能量代謝、抗細(xì)胞衰老、抗氧I含量降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或衰亡。NAD+NADH1-mPMS作用下，WST-1NADH反應(yīng)，產(chǎn)生formazan450nmNAD+NADHWST-1檢測(cè)。Ethanol+NAD+

AlcoholDehydrogenase

Acetaldehyde+H++NADHNADH+WST-1+1-mPMS Formazan（450nm）注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。需自備的儀器和用品：可見(jiàn)分光光度計(jì)//孔板、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）1、血清（漿）中NAD+和NADH的提取：NAD+0.1mL（血漿0.5mL5min(冰浴冷卻后，10000g，4℃10min200μL200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g4℃離心10min，取上清，冰上待測(cè)。NADH0.1mL血清（血漿），0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)10000g，4℃10min200μL200μL4℃離心10min，取上清，冰上待測(cè)。2、組織中NAD+和NADH的提?。篘AD+的提?。?.1g0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失10000g，4℃200μL200μL10000g4℃離心10min，取上清，冰上待測(cè)。NADH的提?。?.1g0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失10000g，4℃200μL200μL勻，10000g4℃離心10min，取上清，冰上待測(cè)。3NAD和NADH的提?。篘AD+的提?。?000.5mL酸性（30次5min()，；冰浴冷卻后，10000g，4℃10min200μL200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g4℃離心10min，取上清，冰上待測(cè)。NADH的提?。?000.5mL堿性提取液，超聲波破碎（200W，超30次，煮沸5min(10000g，4℃200μL200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g4℃離心10min，取上清，冰上待測(cè)。二、測(cè)定步驟1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。2NAD+1.250.6250.31250.156250.0780.0390.01950nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0nmol/mL即空白管。3AH10250.31250.156250.0780nmol/mL0nmolmL即空白管。4、稀釋表（附于說(shuō)明書(shū)最后）5、在EP管中按順序加入下列試劑：試劑名稱(chēng)（μL）對(duì)照管（A1）測(cè)定管（A2）標(biāo)準(zhǔn)管（A標(biāo)）上清液1010標(biāo)準(zhǔn)品--10試劑五100--試劑一505050試劑二151515試劑三303030試劑四777充分混勻，室溫避光反應(yīng)1h試劑五-100100450nmA2ΔANADHA2ΔANAD標(biāo)A標(biāo)-ANADHΔANADH標(biāo)A標(biāo)’-A（1-2次，每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）三、NAD+和NADH含量計(jì)算1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：NAD+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x1，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y1，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定代入方程得到x1（nmol/mL）。NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)ΔA′代入方程得到x2（nmol/mL）。2、NAD+和NADH含量計(jì)算（一）NAD+含量計(jì)算按液體體積計(jì)算：NAD+含量(nmol/mL）x1×（V提取+V血清）÷V血清=11×x1NAD+(nmol/mgprot）x1×V提取÷(V提取×Cpr)=x1CprNAD+含量(nmol/g質(zhì)量）=x1×V提取÷W=x1÷W按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：NAD+含量(nmol/104cell）=x1×V提取÷500=0.002×x1（二）NADH含量計(jì)算按液體體積計(jì)算：NADH含量(nmol/mL）=x2×（V提取+V血清）÷V血清=11×x2NADH(nmol/mgprot）=x2×V提取÷(V提取×Cpr)=x2÷CprNADH含量(nmol/g質(zhì)量）=x2×V提取÷W=x2÷W按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：NADH含量(nmol/104cell）=x2×V提取÷500=0.002×x2V提取：加入