實驗一水質(zhì)的微生物檢測

水微生物檢測南華大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與放射衛(wèi)生實驗教學(xué)中心教學(xué)對象：高等醫(yī)學(xué)院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學(xué)生實驗課時：8學(xué)時課程類型：專業(yè)實驗課課程要求：必修每組人數(shù)：2人實驗?zāi)康呐c要求掌握水樣采集規(guī)則及注意事項。熟悉常用水衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)。熟悉菌落總數(shù)、大腸菌群的測定方法及檢測意義。學(xué)會對所檢測的水樣作綜合分析。水微生物檢測的意義水體的微生物污染問題日趨嚴(yán)重。在各種水體，特別是污染水體中存在有大量的有機物質(zhì)，適于各種微生物的生長。水體中微生物污染的來源：土壤，以及人類、動物的排泄物污染。水體中少數(shù)致病微生物（主要來自人或動物的糞便污染）可導(dǎo)致某些腸道傳染病傳播。水微生物檢測可用于評價水質(zhì)情況，預(yù)報水質(zhì)的污染趨勢，以保證水質(zhì)的衛(wèi)生安全。在實際工作中，對水質(zhì)衛(wèi)生質(zhì)量的評價和控制，是無法對水體中各種可能存在的致病微生物一一進行檢測。一般選擇有代表性的一種或一類微生物作為指示菌，通過對指示菌的檢測，來了解水體是否受到過的微生物污染，是否有腸道病原微生物存在的可能。水微生物的檢測指標(biāo)菌落總數(shù)(aerobicbacterialcount)是指1ml水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長的細(xì)菌菌落的總數(shù)。檢測意義：作為一般性污染的指標(biāo)，即評價被檢樣品的微生物污染程度和安全性。水樣菌落總數(shù)越多，說明水被微生物污染程度越嚴(yán)重，病原微生物存在的可能性越大，但不能說明污染的來源。水質(zhì)微生物的檢測指標(biāo)總大腸菌群(coliformbacteria)是指一群需氧及兼性厭氧的，37℃生長時能使乳糖發(fā)酵，在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。檢測意義：作為糞便污染的指標(biāo)。水樣總大腸菌群數(shù)的含量，表明水被糞便污染的程度，而且間接地表明有腸道致病菌存在的可能。實驗內(nèi)容水樣采集；菌落總數(shù)的測定；總大腸菌群的測定。一、水樣采集采樣原則所采集的樣品具有代表性。采樣容器：選擇硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待測組分；不與待測組分發(fā)生反應(yīng)。保證從采樣到分析期間，樣品各組分的濃度不發(fā)生改變。必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證在運送、貯存過程中不受污染。自來水水水樣：先將自來來水龍頭頭用火焰焰燒灼3min滅滅菌，再開放放水龍頭頭使水流流5min（（經(jīng)常用用水的水水龍頭放放水1～3min）后，，采集水水樣于無菌錐形形瓶，約占瓶容量量80%，以便搖搖勻水樣樣。水源水水水樣：選有代表性的的地點及可疑地地方，一一般距水面下下10～15cm采樣。采樣后后，將瓶塞蓋好好，再從從水中取取出。注意事項嚴(yán)格無菌操操作。做好標(biāo)記：采得水樣樣后應(yīng)立即即記錄水樣樣名稱、地地點、時間間等項目。。從速送檢。水樣從采采集到檢驗驗不應(yīng)超過過2h，在在0～4℃℃下保存不不應(yīng)超過24h。二、菌落總總數(shù)的測定定—平板菌菌落計數(shù)法法（一）生活活飲用水[器材與試試劑]無菌1ml吸管1支支/組，無無菌平皿3個/組，，營養(yǎng)瓊脂脂。[方法]水樣搖勻20~25次，使細(xì)細(xì)菌分散。。傾注培養(yǎng)：無菌吸取取1ml水水樣分別置置于2個空平皿皿，另一個作作空白對照。再傾注15ml瓊瓊脂（約45℃）于于平皿中旋旋轉(zhuǎn)，混勻勻待瓊脂凝凝固后倒置37℃24h。菌落計數(shù)：用肉眼或或放大鏡檢檢查，計數(shù)數(shù)平皿內(nèi)菌菌落數(shù)目。。[結(jié)果分析析與報告]計算平均菌落數(shù)數(shù)：報告方式：：菌落總數(shù)數(shù)(cfu/ml)。cfu：colonyformingunits當(dāng)檢樣的菌菌落數(shù)為l~100時，按實實有數(shù)報告告；大于100時，，采用二位位有效數(shù)字字報告。國家標(biāo)準(zhǔn)（（GB5749-2006））規(guī)定生活活飲用水菌菌落總數(shù)每每毫升不得得超過100個。（二）水源源水[器材與試試劑]無菌1ml吸管6支支/組，無無菌10ml吸管1支/組。。無菌平皿9個/組，，營養(yǎng)瓊脂脂。90ml滅滅菌鹽水1瓶（內(nèi)置適量量玻璃珠）），9ml滅菌鹽水管3支支。[方法]稀釋水樣：無菌吸10ml混勻勻水樣注入入90ml滅菌水瓶瓶中,混勻勻成1:10水樣。。取1:10水樣1ml注入9ml滅菌菌試管中混混勻成1:100水水樣。同法法稀釋成1:1000,1:10000水樣樣。[方法]傾注培養(yǎng)：用1ml無無菌吸管吸吸取2~3個適適當(dāng)濃度的的稀釋液1ml,分分別注入無無菌平皿中中，每個稀稀釋度應(yīng)同同時做2個個平皿，另另取一平皿皿作空白對對照。再做做傾注培養(yǎng)養(yǎng)(方法同同飲用水)。菌落計數(shù)：方法同飲飲用水。菌落總數(shù)測測定[結(jié)果分析析與報告]計算不同稀釋度度的平均菌落落數(shù)：稀釋度的選選擇和菌落總數(shù)數(shù)報告方式式：首先選擇平平均菌落在在30～300之間間者進行計計算。計算方法和和報告方式式如表1所所示。表1稀釋釋度選擇及及菌落總數(shù)數(shù)報告方式式例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩稀釋度菌落總數(shù)之比

菌落總數(shù)(cfu／m1)

報告方式(cfu／m1)10-110-210-312345678136527602890150多不可計27多不可計01642952713046501l305020466085135120—1.62.22————164003775027100150051300027030500<1×1016000或1.6×10438000或3.8×10427000或2.7×1041500或1.5×103510000或5.1×105270或2.7×10231000或3.1×104<10由表2可判判定水質(zhì)被被污染的程程度。表2一般般水源水中中菌落總數(shù)數(shù)與水清潔潔程度的關(guān)關(guān)系水的類別最清潔水清潔水不太清潔水不清潔水極不清潔水菌落總數(shù)

cfu／m110~100100~10001000~1000010000~100000＞100000[注意事項項]菌落總數(shù)測測定中，應(yīng)應(yīng)選擇合適的的稀釋度進行。（生活飲飲用水，國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)規(guī)定每毫升升不得超過過100個個，因此可可以直接吸吸取1毫升升到平板進進行培養(yǎng)））各稀釋管、、相應(yīng)平皿皿做好標(biāo)記。包括：水水樣名稱、、稀釋度、、時間、小小組。嚴(yán)格無菌操操作。進行水樣樣稀釋時，，每一稀釋釋度均需更更換吸管。。傾注時，要要注意營養(yǎng)瓊瓊脂的溫度度。傾入瓊脂后后要混勻，待瓊脂凝凝固后倒置培養(yǎng)。三、總大腸腸菌群的測測定

—多多管發(fā)酵法法分為三步：：初發(fā)酵試驗驗平板分離復(fù)發(fā)酵證實實試驗初發(fā)酵試驗驗：采用乳糖蛋蛋白胨培養(yǎng)養(yǎng)液37℃℃培養(yǎng)24h，觀察察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。平板分離：對陽性管培培養(yǎng)物，接接種于品紅紅亞硫酸鈉鈉培養(yǎng)基或或伊紅美藍(lán)藍(lán)培養(yǎng)基，，觀察菌落特征，并進行革蘭氏染色色和鏡檢。復(fù)發(fā)酵證實實試驗：對典型和可可疑菌落，，接種于乳乳糖蛋白胨胨培養(yǎng)液，，進行復(fù)發(fā)發(fā)酵證實試驗，并根據(jù)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)所附檢檢數(shù)表報告告結(jié)果。產(chǎn)氣初發(fā)酵、復(fù)復(fù)發(fā)酵試驗驗結(jié)果大腸菌群EMB上菌菌落特征大腸菌群革革蘭染色形形態(tài)（一）生活活飲用水[器材與試試劑]2瓶50ml三倍濃濃縮的乳糖糖蛋白胨培培養(yǎng)液（內(nèi)有導(dǎo)管）,10支5ml三倍濃縮縮的乳糖蛋蛋白胨培養(yǎng)養(yǎng)液（內(nèi)有導(dǎo)管）,10ml吸管1支,100ml量量筒1支。。EMB，革革蘭染液等等。[方法]初步發(fā)酵試試驗：接種水樣總總量為300ml（（100ml2份份，10ml10份，12支發(fā)酵酵管）。37℃培培養(yǎng)24h。平板分離：將產(chǎn)酸產(chǎn)氣氣及只產(chǎn)酸酸不產(chǎn)氣(發(fā)酵乳糖)管接種EMB,37℃培培養(yǎng)24h，取典型型菌落作革革蘭氏染色色鏡檢。復(fù)發(fā)酵試驗驗：革蘭氏染色色鏡檢為革蘭陰性無無芽胞桿菌菌，取該菌接接種于普通通濃度乳糖糖蛋白胨(每管接1~3個菌菌落),37℃培培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即證明有有大腸桿菌菌的存在。。產(chǎn)酸產(chǎn)氣報告為大腸腸菌群陽性性[結(jié)果分析析與報告]根據(jù)證實有有大腸菌群群存在的陽陽性管（瓶瓶）數(shù)，查查接種水樣總總量為300ml檢檢數(shù)表（表3）。。報告每升水水樣中中的大大腸菌菌群數(shù)數(shù)（MPN值值，，MostProbableNumber，最最大可可能數(shù)數(shù)法））。國家標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)（（GB5749-2006））規(guī)定定生活活飲用用水大大腸菌菌數(shù)每每升不不得超超過3個。。表3大大腸腸菌群群數(shù)檢檢數(shù)表表接種水水樣總總量300ml（100ml2份，，10ml10份份））10ml水量的陽性管數(shù)100ml水量的陽性管數(shù)012每升水樣中大腸菌群數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)0l2345678910＜33711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230＞230（二））水源源水[器材材與試試劑]1ml吸管管3支支/組組，10ml吸吸管1支/組，，10ml普通通發(fā)酵酵管（（內(nèi)有有導(dǎo)管管）3支/組，，5ml三三倍發(fā)發(fā)酵管管（內(nèi)內(nèi)有導(dǎo)導(dǎo)管））1支支/組組。EMB，革革蘭染染液等等。[方法法]稀釋水水樣：水樣做做1:10及1:100稀釋釋。方方法同同菌落落總數(shù)數(shù)測定定。初發(fā)酵酵試驗驗：接種水水樣總總量11.11ml，4支發(fā)發(fā)酵管管。取取10ml原水水樣注注入5ml三倍倍乳糖糖發(fā)酵酵管（（內(nèi)有有導(dǎo)管管）；；取1ml原水水樣、、1ml1:10及1:100稀釋釋水樣樣分別別注入入10ml普通通乳糖糖發(fā)酵酵管（（內(nèi)有有導(dǎo)管管），，37℃培培養(yǎng)24h。平板分分離與與復(fù)發(fā)發(fā)酵試試驗：同生活活飲用用水。。[結(jié)果果分析析與報報告]根據(jù)證證實有有大腸腸菌群群存在在的陽陽性管管（瓶瓶）數(shù)數(shù)，查查接種水水樣總總量為為11.11ml檢檢數(shù)表表（表4），，報告告每升升水樣樣中的的大腸腸菌群群數(shù)。。表4大大腸腸菌群群數(shù)檢檢數(shù)表表接種水水樣總總量11.11ml（10ml、、1ml、、0.1ml、0.01ml各各1份））接種水樣總量(ml)每升水樣中大腸菌群數(shù)1010.10.01－－－－－－－＋－－－＋－＋＋－－＋＋－＋－－－－＋＋－－－＋＋－＋＋－－－＋＋－＋地＋－＜９０９０９０９５１８０１９０２２０２３０２８０９２０９４０[注意意事項項]總大腸腸菌群群的測測定方方法，，由于于飲用用水和和水源源水可可能的的污染染程度度不同