生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件

InstituteofModernSeparationScience

生物大分子的色譜分離技術(shù)

及應(yīng)用白泉教授

西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所InstituteofModernSeparationScience,NorthwestUniversity,KeyLabofModernSeparationScienceinShaanxiProvince,KeyLaboratoryofSyntheticandNaturalFunctionalMoleculeChemistryofMinistryofEducation,Xi’an,710069,ChinaInstituteofModernSeparation1第一節(jié)反相高效液相色譜

HighPerformanceReversed-PhaseLiquidChromatography(RPLC)第一節(jié)反相高效液相色譜

HighPerformance2一、RPLC的特點(diǎn)1、具有分離效果好，分析速度快，檢測(cè)靈敏高，重復(fù)性好，易于直接定量而后實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。2、采用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，比鹽水體系易從樣品中除去有機(jī)溶劑，后處理比較方便。3、比其他幾類HPLC法分辨率高，同樣長(zhǎng)的柱子，它分離蛋白質(zhì)的數(shù)目較其他方法多。4、若蛋白使用此方法不失活時(shí)，RPLC是除去熱源非常有效的方法，也是分離純化非常有效的工具。如IL-2,-IFN和胰島素等純化中常用RPLC。即使是蛋白質(zhì)在分離后無生物活性，仍可進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。它也是蛋白質(zhì)氨基酸序列分析前處理非常有效的工具。一、RPLC的特點(diǎn)1、具有分離效果好，分析速度快，檢測(cè)靈敏高3二、缺點(diǎn)1、固定相疏水性過強(qiáng)，極易造成蛋白質(zhì)的構(gòu)象不變化,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活。2、流動(dòng)相采用有機(jī)溶劑和低pH，也可使蛋白質(zhì)的活性降低，對(duì)蛋白質(zhì)易污染。3、有機(jī)溶劑有毒，對(duì)環(huán)境易造成污染，且有機(jī)溶劑不易除去。二、缺點(diǎn)1、固定相疏水性過強(qiáng)，極易造成蛋白質(zhì)的構(gòu)象不變化,而4四、保留機(jī)理四、保留機(jī)理5疏溶劑化理論認(rèn)為溶質(zhì)或蛋白質(zhì)在RPLC上進(jìn)行分離時(shí)，與生物膜中的流動(dòng)鑲嵌結(jié)構(gòu)(Fluidmosaticmodel)有某些相似之處。在這個(gè)模型中，蛋白質(zhì)的非極性區(qū)與膜中的類脂部分(相當(dāng)于反相色譜填料的配體)相鄰，而蛋白質(zhì)的極性部分則暴露于含水的環(huán)境中(相當(dāng)于流動(dòng)相)。既蛋白質(zhì)在RPLC分離過程中，疏水效應(yīng)起著重要的作用。疏溶劑化理論認(rèn)為溶質(zhì)或蛋白質(zhì)在RPLC上進(jìn)行6這個(gè)締合產(chǎn)物可用圖5-1表示。當(dāng)非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)分子中的非極性部分引入到極性的流動(dòng)相時(shí)，分子中的非極性部分總是趨向與其它非極性部分蔟集一起，這樣可以減少與極性溶劑的接觸面積，使體系能量最低，這是由于圖中黑箭頭所示的疏溶劑力的緣故。流動(dòng)相的表面張力越高，這中束縛力就越強(qiáng)。相反，若溶質(zhì)分子中有極性官能團(tuán)存在時(shí)，則和極性溶劑的作用力(空箭頭所示)增加，不利于與固定相的締合。這個(gè)締合產(chǎn)物可用圖5-1表示。當(dāng)非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)分子中的非極7五、固定相1、基質(zhì)剛性基質(zhì)：硅膠、玻璃球等半剛性基質(zhì)：交聯(lián)聚苯乙烯聚合物等軟基質(zhì)：瓊脂糖，Sepherose,Sepherdex要求：粒度：5-10m孔徑：小分子：<100A大分子：200~500A五、固定相1、基質(zhì)82、配體

非極性化合物C2,C4,C8,C18等，苯環(huán)長(zhǎng)鏈烷烴隨著碳數(shù)的增大，疏水性增大，保留值增大。對(duì)不易保留的物質(zhì)，采用長(zhǎng)鏈；對(duì)易保留的物質(zhì)，可用短鏈。長(zhǎng)鏈由于空間位阻，鍵合密度小。鏈長(zhǎng)，可掩蓋硅羥基。2、配體9生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件10生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件11六、流動(dòng)相1、要求在210nm-280nm的紫外吸收要小。溶劑要容易除去。峰形要窄。高的生物活性和質(zhì)量回收率。價(jià)格低，毒性小。選擇性好。六、流動(dòng)相1、要求12生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件132、常用有機(jī)溶劑：甲醇，正丙醇，異丙醇，乙腈，四氫呋喃等3、離子對(duì)試劑：三氟醋酸，磷酸，甲酸作用：與蛋白質(zhì)形成離子對(duì)使其在有機(jī)溶劑中溶解。抑制硅膠鍵合相留下的硅羥基對(duì)蛋白質(zhì)的二次吸附。2、常用有機(jī)溶劑：14七、洗脫方式小分子：等濃度洗脫生物大分子：梯度洗脫1、A液：H2O+0.1%TFAB液:H2O+甲醇+0.1%TFA2、A液：H2O+0.1%TFAB液:H2O+乙腈+0.1%TFA3、A液：H2O+0.1%TFAB液:H2O+正丙醇+0.1%TFA4、A液：6mol/L甲酸+H2OB液:4mol/L甲酸+H2O+72%(V/V)異丙醇洗脫劑強(qiáng)度增加七、洗脫方式小分子：等濃度洗脫1、A液：H2O+0.15八、影響分離條件的因素pH離子強(qiáng)度與離子對(duì)試劑有機(jī)溶劑表面活性劑溫度流速八、影響分離條件的因素pH162.離子強(qiáng)度與離子對(duì)試劑當(dāng)pH值被設(shè)定后,緩沖液中的離子強(qiáng)度也常用來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的保留。增加離子強(qiáng)度，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與鍵合相間的疏水作用。在多數(shù)情況下，較高的離子強(qiáng)度(>0.2)可使蛋白質(zhì)有較好的分辨率和回收率，降低離子強(qiáng)度會(huì)引起峰形變寬，分辨率降低。但有些蛋白質(zhì)如卵蛋白及磷酸化酶B在低離子強(qiáng)度時(shí)收率反而提高。2.離子強(qiáng)度與離子對(duì)試劑當(dāng)pH值被設(shè)定后,緩沖液中的離子強(qiáng)度17緩沖液中的鹽和酸除了起緩沖作用外,還通過離子對(duì)的形成改變蛋白質(zhì)的表面極性,從而影響蛋白質(zhì)的保留性和選擇性。例如在低pH時(shí),蛋白質(zhì)的帶正電荷功能團(tuán)與帶負(fù)電荷的反離子形成離子對(duì)復(fù)合物。這種復(fù)合物具有與蛋白質(zhì)本身完全不同的色譜性質(zhì)。如果反離子是疏水的(如三氟乙酸根或七氟丁酸根)，則使形成的復(fù)合物的保留時(shí)間增加。如果反離子是親水的(如磷酸根或甲酸根)，則使復(fù)合物的保留時(shí)間減少。實(shí)際上蛋白質(zhì)保留時(shí)間的改變還涉及離子對(duì)對(duì)硅醇基的作用。在C3柱上分離牛血清蛋白和-乳球蛋白，在其他色譜條件相同情況下，如用離子對(duì)試劑七氟丁酸，這兩種蛋白質(zhì)在幾分鐘內(nèi)就可分開，但如改用三氟乙酸，則兩者就分不開。緩沖液中的鹽和酸除了起緩沖作用外,還通過離子對(duì)的形成改變蛋白18生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件193.有機(jī)溶劑通過疏水作用結(jié)合在反相柱上的蛋白質(zhì)需要有機(jī)溶劑把它洗脫下來，因此有機(jī)溶劑的選擇是改變大拿比值保留性質(zhì)的重要手段之一。較常用的溶劑有乙腈和丙醇，不常用的有甲醇、乙醇、二氧六環(huán)及四氫呋喃等。對(duì)蛋白質(zhì)而言，疏水性較大的丙醇是個(gè)較好的溶劑，因?yàn)楸枷疵摰鞍踪|(zhì)的濃度比其它溶劑低，因而減少了蛋白質(zhì)變性及失活的可能性。適當(dāng)使用一種以上的有機(jī)溶劑如異丙醇-丁醇、乙腈-異丙醇等可進(jìn)一步降低有機(jī)溶劑總濃度并改變分辨率及回收率。3.有機(jī)溶劑通過疏水作用結(jié)合在反相柱上的蛋白質(zhì)需要有機(jī)溶劑205.溫度蛋白質(zhì)在RPLC分離過程中構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，這也與溫度有關(guān)。提高柱溫往往可以改變蛋白質(zhì)的保留時(shí)間和收率，但必須考慮到提高柱溫也會(huì)引起蛋白質(zhì)的不可逆變性和失活，因此蛋白質(zhì)分離一般得在室溫或低溫下進(jìn)行。5.溫度蛋白質(zhì)在RPLC分離過程中構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，這也與溫21生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件226.流速由于蛋白質(zhì)的分子大，擴(kuò)散慢，所以較低流速有利于提高分辨率。6.流速由于蛋白質(zhì)的分子大，擴(kuò)散慢，所以較低流速有利于提高23九、應(yīng)用重組人IL-2的純化重組人-IFN蛋白質(zhì)氨基酸組成的測(cè)定酶活性的測(cè)定胰島素的純化九、應(yīng)用重組人IL-2的純化24生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件25生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件26生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件27生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件28生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件29生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件30生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件31生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件32生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件33生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件34生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件35生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件36生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件37圖8-10在RPLC中兩種流動(dòng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分離圖a.甲醇-水-TFA體系b.醋酸-水體系圖8-10在RPLC中兩種流動(dòng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分離圖38第二節(jié)離子交換液相色譜

(Ionexchangechromatography,IEC)第二節(jié)離子交換液相色譜

(Ionexchangech39一、離子交換過程1、陰離子交換劑硅膠-R+Y-+X-

硅膠-R+X-+Y-2、陽離子交換劑硅膠-R-Y++X+

硅膠-R-X++Y+一、離子交換過程1、陰離子交換劑40二、特點(diǎn)流動(dòng)相為鹽水體系，操作條件比RPLC溫和，蛋白在IEC分離時(shí)多以活性狀態(tài)存在。IEC流動(dòng)相價(jià)格比RPLC便宜，且易處理，對(duì)試劑純度要求相對(duì)較低。蛋白質(zhì)在IEC時(shí)依蛋白質(zhì)與配體間靜電作用力不同而達(dá)到分離的，與RPLC的疏水作用力不同，蛋白質(zhì)與配體作用溫和。IEC與RPLC分離效果相差不太大，兩種分離方法可互為補(bǔ)充。IEC質(zhì)量負(fù)載非常高，一般每克填料可達(dá)50-200mg的蛋白質(zhì)。IEC既可使用pH梯度也可使用鹽梯度洗脫蛋白質(zhì)，使這種方法具有更高的適用性和靈活度。二、特點(diǎn)流動(dòng)相為鹽水體系，操作條件比RPLC溫和，蛋白在IE41三、保留機(jī)理1、靜電作用模型離子交換過程主要是由靜電作用控制的，其保留次序取決于配體與蛋白質(zhì)間的靜電作用力大小。作用力的保留時(shí)間長(zhǎng)，作用力小的保留時(shí)間短。蛋白質(zhì)與配體間的靜電作用力可用庫(kù)侖定律來描述：F=Q1Q2/r2這里Q1和Q2表示作用離子的點(diǎn)電荷,為介電常數(shù)，r為兩點(diǎn)電荷的距離。蛋白質(zhì)與固定相之間不是點(diǎn)電荷的作用，但它們?nèi)匀豢梢越频厥褂蒙鲜絹砻枋觥Ｈ?、保留機(jī)理1、靜電作用模型42在IEC上分離蛋白質(zhì)時(shí)，IEC固定相的配體表面要吸附一層相反電荷的離子來保持其電中性，從而形成了雙電層，如圖4-9所示。雙電層厚度直接正比于配體的密度。蛋白質(zhì)表面帶有電荷也呈現(xiàn)出相同的性質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在交換過程中遇到固定相的雙電層時(shí)，蛋白質(zhì)表面和固定相表面的離子會(huì)重新分布，即原先吸附在兩個(gè)表面的離子被排除，蛋白質(zhì)和配體吸附在一起。要從離子交換劑上解吸附蛋白質(zhì)，必須增加與蛋白質(zhì)所帶電荷相同離子的離子強(qiáng)度。

在IEC上分離蛋白質(zhì)時(shí)，IEC固定相的配體表面要吸附一層相反43蛋白質(zhì)所帶電荷的多少，是由蛋白質(zhì)分子的酸性和堿性氨基酸殘基共同決定的。在酸性條件下，堿性氨基酸殘基被電離，而羧基電離被抑制，蛋白質(zhì)獲得凈的正電荷；與之相反，在堿性條件下，羧基被電離，氨基被中和，蛋白質(zhì)獲得凈的負(fù)電荷。而在中間某個(gè)pH時(shí)蛋白質(zhì)的凈電荷為零，此時(shí)的pH值稱之為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。pH=pI，由于不帶電荷，蛋白質(zhì)在IEC上不保留。pH>pI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，它將在陰離子交換柱上保留，在陽離子交換柱上不保留。pH<pI，蛋白質(zhì)帶正電荷，它將在陽離子交換柱上保留。蛋白質(zhì)所帶電荷的多少，是由蛋白質(zhì)分子的酸性44生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件45生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件46表6-1Kopaciewicz在HPIEC上研究蛋白質(zhì)保留行為時(shí)所用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量蛋白質(zhì)pIM.W.OVA(蛋清)4.743,500大豆胰蛋白酶4.521,100BSA4.98,5.97,5.1869,000-乳球蛋白(牛奶)5.1335,000-淀粉酶6.055,000伴清蛋白(蛋清)6.0,6.3,6.677,000-葡萄苷酶7.365,150(兩個(gè)亞基)碳酸酐酶(牛紅細(xì)胞)7.330,375肌紅蛋白(馬心)6.9,7.317,500免疫球蛋白(雌馬)7.7150,000核糖核酸酶(牛胰臟)8.7,8.813,500-糜蛋白酶原-A(牛胰臟)8.8,9.2,9.625,000細(xì)胞色素-c(馬心)9.0,9.412,200溶菌酶1113,930表6-1Kopaciewicz在HPIEC上研究蛋白質(zhì)保47五、固定相 固定相配體的密度、性質(zhì)以及顆粒和孔徑大小對(duì)蛋白質(zhì)的分離都有影響。常用的離子交換基團(tuán)：WAX:-NH2,-NHR,-NRR’SAX:-NR3+,-N+WCX:-COOHSCX:-SO3H,-PO4H2五、固定相 固定相配體的密度、性質(zhì)以及顆粒和孔徑大小對(duì)蛋白質(zhì)48陽離子交換基強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂陽離子交換基強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，49陰離子交換基強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素陰離子交換基強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素50生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件51Ion-ExchangechromatographyIfpHmobilephase=7.2

Thenchargeoftheproteins:(-)(-)(+)(+)--++++++++------++++++++++++Anionexchangecolumn=+chargedIon-ExchangechromatographyIf52IncreasedsaltconcentrationIon-Exchangechromatography--+++++++--Na+Na+Na+Na+Na+Na+++++++Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-++++++------Na+Na+Na+IncreasedsaltconcentrationIo53生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件54生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件55目前有兩種離子交換填料在國(guó)際上被認(rèn)為是較好的：一是Monobeads系列，它是通過化學(xué)改性使高聚物基質(zhì)微球具有親水性，然后再接上季胺基團(tuán)或磺酸基團(tuán)制成具有大的孔結(jié)構(gòu)和中度交換容量的陰陽離子交換劑MonoQ和MonoS。這種系列填料對(duì)于生物大分子樣品有非常好的分離度、回收率、負(fù)載量和穿透性，其應(yīng)用非常廣泛。二是TSKgelPW系列，它們是以親水性高聚物為基質(zhì)的填料，也是一中大孔度、小顆粒、中度交換容量的離子交換劑，應(yīng)用也非常廣泛。目前有兩種離子交換填料在國(guó)際上被認(rèn)為是較好的：一是M56三、非多孔填料這些填料同前面所講的反相填料一樣，特別適合于蛋白質(zhì)的快速分離。它包括無機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)兩部分。無機(jī)基質(zhì)仍以硅膠為主，有機(jī)基質(zhì)可供選擇的余地較大，有親水性高聚物基質(zhì)、交聯(lián)聚苯乙烯基質(zhì)、交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)。目前已有許多商品出售。用于分析用的非多孔填料一般粒度為幾個(gè)m，顆粒小而均勻，分析速度快，分離度、柱效和樣品的回收率高，特別適合于分離具有生物活性的蛋白質(zhì)。三、非多孔填料這些填料同前面所講的反相填料一樣，特57生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件582、pHpH值的變化既可改變蛋白質(zhì)的凈電荷還可以影響配體的電離程度，造成蛋白質(zhì)在HPIEC上的保留產(chǎn)生不同的改變，從而的大分離。因此，在HPIEC上可以通過改變pH來獲得選擇性地分離。使用pH梯度分離蛋白質(zhì)時(shí)，pH是采用增加還是減小的方式進(jìn)行并沒有規(guī)律可循，只能通過實(shí)驗(yàn)來摸索。2、pHpH值的變化既可改變蛋白質(zhì)的凈電荷還可以影響59生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件60使用HPIEC分離蛋白質(zhì)時(shí)，通常流動(dòng)相的pH值高于或低于pI一個(gè)pH單位。即pH>pI+1或pH<pI-1。pH值遠(yuǎn)離的越多，蛋白質(zhì)的保留值就越大。當(dāng)pH遠(yuǎn)離pI2-3個(gè)單位時(shí)，多數(shù)蛋白質(zhì)的保留時(shí)間對(duì)pH作圖就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)。此時(shí)再想通過增加pH值來獲得大的保留值意義就不大了。從理論上講，可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)pH值，在這個(gè)pH時(shí)，欲分離蛋白脂的保留時(shí)間與其它不同，若此時(shí)pH值對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性無影響，就可以認(rèn)為此時(shí)的pH值就是最佳分離條件。但此點(diǎn)必須通過實(shí)驗(yàn)才能得到。使用HPIEC分離蛋白質(zhì)時(shí)，通常流動(dòng)相的pH值高于或61３、洗脫方式在HPIEC上分離蛋白質(zhì)，常常用改變鹽濃度的濃度梯度方式，在低的鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)與配體結(jié)合，隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)依次被洗脫下來。３、洗脫方式在HPIEC上分離蛋白質(zhì)，常常用改變鹽濃度的濃62梯度洗脫主要是通過改變梯度洗脫時(shí)間來選擇比較好的分離效果。梯度時(shí)間延長(zhǎng)，分離度增加，但同時(shí)又使峰形變寬，造成檢測(cè)的靈敏度降低。從另一方面來講，梯度時(shí)間太長(zhǎng)，蛋白質(zhì)在柱子上的停留時(shí)間增加，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并不太好，因此，梯度時(shí)間的選擇要適中。梯度洗脫主要是通過改變梯度洗脫時(shí)間來選擇比較好的分離效果。梯635、溫度溫度常常造成蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，其結(jié)果會(huì)造成蛋白質(zhì)表面的電荷重新分布，從而影響蛋白質(zhì)的保留值。溫度的改變也可用來改變蛋白質(zhì)的選擇性。5、溫度溫度常常造成蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，其結(jié)果會(huì)造成蛋白質(zhì)表面646、添加劑在HPIEC上分離蛋白質(zhì)時(shí)，有許多蛋白質(zhì)的溶解度較低，造成柱子的負(fù)載較低。為了克服上述缺點(diǎn)，常加入一些添加劑來增加蛋白質(zhì)的溶解度。非離子去垢劑和兩性離子去垢劑在HPIEC上常常被使用。6mol/L脲既可用來溶解蛋白質(zhì)也可使蛋白質(zhì)解離。有機(jī)溶劑乙二醇、乙醇和丙酮在HPIEC上有時(shí)也被用來溶解蛋白質(zhì)。當(dāng)然添加劑出來增加蛋白質(zhì)溶解度外，還可以改善分離的選擇性。6、添加劑在HPIEC上分離蛋白質(zhì)時(shí)，有許多蛋白質(zhì)的65 為了在HPIEC上獲得一個(gè)好的分離結(jié)果，可通過改變以下條件來獲得最佳分離結(jié)果：調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度選擇最佳pH改變鹽的種類或抗衡離子，改進(jìn)選擇性。調(diào)整梯度洗脫時(shí)間用添加劑來調(diào)整選擇性。 為了在HPIEC上獲得一個(gè)好的分離結(jié)果，可通過改變以下條件66七、應(yīng)用1、腫瘤壞死因子(TNF)2、膜蛋白3、血紅蛋白4、單克隆抗體5、TGF---半乳糖苷酶七、應(yīng)用1、腫瘤壞死因子(TNF)67生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件68生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件69生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件70生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件71生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件72生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件73生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件74生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件75第三節(jié)高效疏水相互作用色譜

HighPerformanceHydrophobicInteractionChromatography(HPHIC)第三節(jié)高效疏水相互作用色譜

HighPerforman76一、歷史1961年，Gillam等使用苯甲酰二乙氨基乙基纖維素對(duì)核酸進(jìn)行了分離。1972年Er-Z等將不同鏈長(zhǎng)的,-二胺同系物鍵合在瓊脂糖上，以不同pH值的鹽溶液作為流動(dòng)相分離和純化了糖原磷酸化酶。1973年Hjerter明確提出了靠疏水基團(tuán)的疏水力進(jìn)行色譜分離的概念。80年代初期，由于硅膠基質(zhì)的應(yīng)用，HIC才得以迅速發(fā)展，成為HPHIC。一、歷史1961年，Gillam等使用苯甲酰二乙氨基乙基77二、定義用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相分離生物大分子的液相色譜法叫做疏水相互作用色譜法。二、定義用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為78三、特點(diǎn)溶質(zhì)保留過程有一個(gè)與其他色譜相反的溫度系數(shù)，即溫度增加，保留時(shí)間增長(zhǎng)。在相對(duì)高的鹽濃度下吸附于固定相，而在低鹽濃度時(shí)洗脫下來。固定相疏水基團(tuán)的極性大于HPRPC。三、特點(diǎn)溶質(zhì)保留過程有一個(gè)與其他色譜相反的溫度系數(shù)，即溫79生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件801、疏溶劑化理論Melander和Horvath根據(jù)Sinanogh和Abdulman的空穴理論，考慮溶質(zhì)與疏水配體之間通過疏水相互作用二形成絡(luò)合物，形成絡(luò)合物過程的推動(dòng)力來自于蛋白質(zhì)分子所具有的減少與水接觸非極性表面的傾向，此過程造成自由能的降低。這時(shí)，自由能的變化除和蛋白質(zhì)與配體作用的空穴生成自由能Gocav、靜電作用自由能Goes、范德華作用自由能Govdw有關(guān)外，還與蛋白質(zhì)和配體與溶劑作用自由能Gored、無溶劑存在時(shí)蛋白質(zhì)與配體Goassc有關(guān)。1、疏溶劑化理論Melander和Horvath根據(jù)Sina81Ink’=Km-Sm式中Km和S為常數(shù)，m為鹽的質(zhì)量摩爾濃度。當(dāng)用lnk’對(duì)鹽濃度m作圖時(shí)應(yīng)得一條直線。Km為截距，表示當(dāng)鹽的質(zhì)量摩爾濃度為0時(shí)，即純水中的lnk’值。S為斜率，是一個(gè)與蛋白質(zhì)和配體作用的接觸面積有關(guān)的常數(shù)。在高鹽濃度下,每種自由能變?cè)谝欢l件下都正比于鹽的質(zhì)量摩爾濃度,在壓力P和溫度T恒定的條件下(由于R為普適氣體常數(shù),為柱相比),上述關(guān)系可簡(jiǎn)化為:Ink’=Km-Sm式中Km和S為常數(shù)，m82在鹽的水溶液中，鹽的質(zhì)量摩爾濃度與溶液的表面張力成正比。因此，在溶液中加入鹽后，溶液的表面張力就會(huì)增加，這樣便會(huì)導(dǎo)致體系的自由能增加，有利于蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)與配體之間的接觸。

這個(gè)模型只適用于對(duì)蛋白質(zhì)有強(qiáng)的鹽析作用而無特異作用的鹽。在鹽的水溶液中，鹽的質(zhì)量摩爾濃度與溶液的表面張力成正83鹽析鹽：減小蛋白質(zhì)的溶解度，增加其穩(wěn)定性。鹽溶鹽：增加蛋白質(zhì)的溶解度，減小其穩(wěn)定性。鹽析鹽：減小蛋白質(zhì)的溶解度，增加其穩(wěn)定性。84鹽KSCNNH4NO3NH4Cl

NaClNa2HPO4(NH4)2SO4Na2SO2

0.450.851.391.442.022.162.73

鹽溶鹽

鹽析鹽

對(duì)于那些具有特異性作用的鹽，如MgCl,CaCl以及具有鹽溶鹽性的鹽，如KBr,胍,SCN-等，將不遵守這個(gè)規(guī)律。另外，在流動(dòng)相中存在著有機(jī)添假劑如蔗糖和表面活性劑等時(shí)，其結(jié)果也不能用此方程來描述。鹽KSCNNH4NO3NH4Cl85三、填料基質(zhì)配體合成三、填料基質(zhì)861、基質(zhì)軟基質(zhì)：瓊脂糖Sepharose，葡聚糖Sephadex硬基質(zhì)：硅膠silica，擴(kuò)孔玻璃，聚合物基質(zhì)1、基質(zhì)軟基質(zhì)：瓊脂糖Sepharose，葡聚糖Seph87生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件882、配體

配體大多數(shù)是一些含N或O原子的中等疏水性的有機(jī)基團(tuán)。

HPHIC上，填料對(duì)蛋白質(zhì)的作用強(qiáng)弱主要取決于配體的性質(zhì)和密度。蛋白質(zhì)的保留值與配體中烷基碳鏈長(zhǎng)度成正比，烷基鏈越長(zhǎng)，保留值越大。配體的密度除影響填料的疏水特性外，還會(huì)影響柱容量。填料的配體密度增大或配體碳鏈長(zhǎng)度的增加都增強(qiáng)了填料的疏水性；而增加配體的極性組分比例則能減小配體的疏水性。所以，選擇合適的配體是HPHIC的一個(gè)關(guān)鍵。2、配體配體大多數(shù)是一些含N或O原子的中等疏水性89生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件90生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件91四、影響分離的因素離子強(qiáng)度鹽添加劑固定相的疏水特性pH值溫度填料孔徑四、影響分離的因素離子強(qiáng)度922、鹽鹽的種類對(duì)洗脫能力的影響可以從兩個(gè)方面來說明。一是用鹽的摩爾表面張力增量來定量說明對(duì)保留的影響，鹽的摩爾表面張力增量大，則蛋白質(zhì)在HPHIC中保留值也大。二是各種鹽和離子破壞水的有序排列的能力，這種能力的大小即洗脫效率的順序是與Hofmeister系列一致的。洗脫能力依次為KSCN>CaCl2>NH4Cl>NaCl>(NH4)2SO4>Na2SO4

許多高濃度的鹽溶液對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)是無害的。園二色譜實(shí)驗(yàn)表明，無論3mol/LNaCl或是1mol/LNa2SO4都不改變牛血清白蛋白和卵清蛋白的構(gòu)象。某些離子如SO42-可以提高蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性，同時(shí)能使蛋白質(zhì)溶解度下降，對(duì)蛋白質(zhì)有鹽析效應(yīng)，使蛋白質(zhì)與固定相的疏水作用增強(qiáng)，這些鹽或離子洗脫能力較弱；但有些離子如Ca2+,SCN-等能降低蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性，使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的變性，同時(shí)也能提高蛋白質(zhì)的溶解度，有鹽溶效應(yīng)，這些鹽或離子的洗脫能力較強(qiáng)。2、鹽鹽的種類對(duì)洗脫能力的影響可以從兩個(gè)方面來說明。93生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件94按照鹽析效應(yīng)和洗脫能力，可將離子和鹽排列如下順序：負(fù)離子：PO43-,SO42-,CH3COO-,Cl-,Br-,NO3-,ClO4-,I-，SCN-正離子:(CH3)N+，NH4+,K+,Na+,Li+,Mg2+,Ca2+,Ba2+鹽：

KH2PO4,Na2HPO4,(NH4)2SO4,KAC,NaAC,NaCl,NaNO3,Na2SO4,

鹽析作用增強(qiáng)洗脫能力增強(qiáng)由上述可知，選擇合適的鹽對(duì)分離后蛋白質(zhì)的活性和分離效果都很重要。在HPHIC中，(NH4)2SO4、NH4AC、磷酸鹽和氯化鈉等都是常用的鹽，其中(NH4)2SO4應(yīng)用最為廣泛，其主要原因?yàn)槿芙舛却?，?duì)蛋白質(zhì)活性影響小，鹽析能力強(qiáng)。按照鹽析效應(yīng)和洗脫能力，可將離子和鹽排列如下順序：鹽析作用增953、添加劑在流動(dòng)相中添加少量乙二醇、尿素、蔗糖等物質(zhì)，降低流動(dòng)相的極性可以使蛋白質(zhì)保留作用減弱。表面活性劑也常被用來作為流動(dòng)相的添加物，它可以改變蛋白質(zhì)的保留性質(zhì)。在添加這些物質(zhì)時(shí)要注意它們對(duì)樣品活性的影響。3、添加劑在流動(dòng)相中添加少量乙二醇、尿素、蔗糖等964、固定相的疏水特性在HPHIC中，首先固定相要具有明顯的疏水特性，對(duì)蛋白質(zhì)的作用盡可能不附帶靜電引力，范德華力和氫鍵等；另外其表面疏水基團(tuán)的密度又要適中，一般較反相色譜固定相低10-100倍，呈弱疏水性，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附為中等強(qiáng)度，密度太高會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生不可逆吸附。4、固定相的疏水特性在HPHIC中，首先固定相要具有97Fig.2.ChromatogramsoflysozymefromfourkindsofHPHICwithvarioushydrophobicitiescolumns(4.0mmI.D.×100mm).1,PEG-400;2,PEG-600;3,PEG-800;4,phenylgroup.Exceptflowrateofmobilephasebeing1.0mL/min,theotherchromatographicconditionsarethesameasthatshowninfig.1(b).AUFS:0.08.Samplesize:20mL5.0mg/mLlysozymeandfinalconcentrationincollectedfractionwas0.10mg/mL.Fig.2.Chromatogramsoflysoz98Fig.3.ChromatogramsoffourproteinsfromthreekindsofHPHICwithacomparablehydrophobicitybutdifferentligands.(a)PEG-600;(b)THFA;(c)phenylgroup.1,Cytochrome-C;2,myoglobin;3,lysozyme;4,a-chymotrypsin.AUFS:0.08.Theconcentrationofeachproteinwas5.0mg/mL.Theabsoluteamountsofthemare:40,30,15and30mgfor1,2,3,and4andtheirfinalconcentrationsare0.133,0.100,0.075and0.10mg/mL,respectively.Exceptflowrateofmobilephasebeing0.8mL/min,theotherchromatographicconditionsarethesameasthatindicatedinfig.2.Fig.3.Chromatogramsoffour996、溫度對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，在一定范圍內(nèi)，溫度升高會(huì)增大保留值，但同時(shí)易使溶解度變小，生活活性降低。所以HPHIC一般在相對(duì)穩(wěn)定的室溫或低于室溫下操作。溫度增加，蛋白質(zhì)內(nèi)部更多的疏水基團(tuán)暴露到蛋白質(zhì)的外部，使之與配體的作用增強(qiáng)，保留時(shí)間增加，但不同的蛋白質(zhì)對(duì)溫度的穩(wěn)定性選擇性。6、溫度對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，在一定范圍內(nèi)，溫度升高會(huì)100五、蛋白質(zhì)在HPHIC與HPIEC保留行為的比較柱子的類型是決定蛋白質(zhì)保留行為的關(guān)鍵，不同類型的色譜柱對(duì)蛋白質(zhì)保留順序影響很大。蛋白質(zhì)在HPHIC和HPIEC柱上的保留順序見下面的結(jié)果，由此可以看出，打那筆直在兩類柱上的保留順序完全不同。這些不同主要是柱子類型不同所造成。當(dāng)然，鹽也會(huì)部分地影響蛋白質(zhì)的保留順序，但相對(duì)于柱子類型不同造成的變化來講則很小。HPHIC：-糜蛋白酶原-A>-淀粉酶>溶菌酶>OVA>BSA>肌紅蛋白>細(xì)胞色素-cHPIEC:溶菌酶>-淀粉酶>細(xì)胞色素-c>-糜蛋白酶原-A>BSA>OVA>肌紅蛋白五、蛋白質(zhì)在HPHIC與HPIEC保留行為的比較柱子101蛋白質(zhì)在理想的HPHIC柱上保留時(shí)應(yīng)該只與蛋白質(zhì)與柱子間的疏水作用力有關(guān)，但在實(shí)際上，往往有不同程度的偏離。在HPHIC上除了疏水作用力外，還有靜電作用力存在。為了避免這種作用力對(duì)疏水作用力影響過多，常限制HPHIC在高的鹽濃度下使用，即鹽的濃度一般要大于0.5mol/L。蛋白質(zhì)在理想的HPHIC柱上保留時(shí)應(yīng)該只與蛋白質(zhì)與柱102蛋白質(zhì)在HPIEC上的分離是靠蛋白質(zhì)與填料之間的靜電作用力不同來實(shí)現(xiàn)的，為了證實(shí)疏水作用力的存在，通常加入一些極性有機(jī)溶劑如乙二醇、異丙醇和乙腈等。通過觀察保留值減少的程度來證明疏水作用在HPIEC對(duì)蛋白質(zhì)保留貢獻(xiàn)的大小。以上結(jié)果說明蛋白質(zhì)在HPHIC和HPIEC柱上進(jìn)行分離時(shí)，疏水作用力和靜電作用力同時(shí)存在，它們共同控制著蛋白質(zhì)的保留，只是在HPHIC上以疏水作用力為主，在HPIEC上以靜電作用力為主。當(dāng)然這兩種作用力的大小在不同類型的色譜上是有所區(qū)別的。蛋白質(zhì)在HPIEC上的分離是靠蛋白質(zhì)與填料之間的靜電作用力不103六、蛋白質(zhì)在HPHIC和HPRPC上保留行為的比較1、流動(dòng)相RPLC的流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的洗脫能力強(qiáng)而水最差，而在HPHIC中水的洗脫最強(qiáng)，鹽溶液最差。鹽水極性有機(jī)溶劑HPHICRPLC洗脫能力小大因此在RPLC中有時(shí)常加入一些鹽瀨增加蛋白質(zhì)的保留，在HPHIC加入一些有機(jī)溶劑來減弱蛋白質(zhì)與配體間的疏水作用，使蛋白質(zhì)更易洗脫。六、蛋白質(zhì)在HPHIC和HPRPC上保留行為的比較1、流動(dòng)相1042、柱子配基HPHICHPRPC極性非極性相間多為非極性配體配體密度低配體密度高疏水性弱疏水性強(qiáng)配體鏈較長(zhǎng)配體鏈有長(zhǎng)有短2、柱子配基1053、溫度

隨著溫度的增加，蛋白質(zhì)在HPHIC上的保留值增大，而在反相色譜上的保留減小，二者受溫度的影響是相反的。3、溫度106生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件107生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件108生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件109六、應(yīng)用-IFN-IFN單克隆抗體IL-2六、應(yīng)用-IFN110生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件111生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件112生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件113生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件114第四節(jié)高效親合色譜

HighPerformanceAffinityChromatography

(HPAFC)第四節(jié)高效親合色譜

HighPerformance115二、定義親合色譜是基于分離物與配體間特異的生物親合作用來分離生物大分子的一種色譜技術(shù)。二、定義親合色譜是基于分離物與配體間特異的生物親合作用來116三、特點(diǎn)其它幾類色譜的作用機(jī)理與HPAFC不同。HPAFC是基于配體與分離物間的特異性親合作用，分離選者性強(qiáng)，效果好，純化倍數(shù)比其它幾類色譜高。其它幾類色譜除HPHIC外，即可用于分離小分子，也可用于分離生物大分子，而HPAFC僅適合于分離生物大分子。與其它幾類色譜不同，HPAC很少講板高和理論塔板數(shù)。因?yàn)檫@些理論在HPAFC上無意義。HPAC柱子的專用性強(qiáng)。三、特點(diǎn)其它幾類色譜的作用機(jī)理與HPAFC不同。HPAFC是117四、缺點(diǎn)柱子的專用性強(qiáng)，成本高，有時(shí)易產(chǎn)生不可逆的吸附造成分離無失活，分離的動(dòng)力學(xué)過程慢，柱子壽命短，在制備填料時(shí)對(duì)制備技術(shù)要求高。四、缺點(diǎn)柱子的專用性強(qiáng)，成本高，有時(shí)易產(chǎn)生不可逆的吸附造成分118五、作用機(jī)理蛋白質(zhì)在HPAC上的分離主要以來于配體與分離物間的識(shí)別，而這種識(shí)別作用符合所謂的鎖匙作用模型和誘導(dǎo)作用模型，具有高度的生物選擇性。L+E=LEK1為平衡常數(shù)，[L]s是配體的表面濃度，[LE]s是溶質(zhì)結(jié)合配體的濃度，[E]m表示溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度。當(dāng)在比較低的溶質(zhì)濃度時(shí)，而且假定L與E的結(jié)合符合線性吸附方式，[L]s－[LE]s可近似認(rèn)為等于[L]s。五、作用機(jī)理蛋白質(zhì)在HPAC上的分離主要以來于配體119

溶質(zhì)的保留與配體密度和分離物之間的特異親合作用常數(shù)有關(guān)，平衡常數(shù)越大，其越難洗脫；配體密度越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。使用HPAFC分離生物大分子時(shí)，親合平衡常數(shù)變化范圍可以從102到1015M-1(單位為1/mol)。溶質(zhì)的保留與配體密度和分離物之間的特異親合作用常數(shù)有關(guān)，120生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件121生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件122AffinitychromatographyMakesuseofspecificbindinginteractionsbetweenmolecules1-Incubatecrudesamplewiththeimmobilizedligand2-Washawaynonboundsamplecomponentsfromsolidsupport3-EluteAffinitychromatographyMakesu123六、固定相載體空間臂配體HPAFC填料的基本組成１、核心問題親合色譜固定相的合成較困難，有較高的要求。主要是因?yàn)橛H合色譜固定相由三部分組成。六、固定相載體空間臂配體HPAFC填料的基本組成１、核心問題124

在合成HPAFC填料時(shí)，應(yīng)記住以下幾個(gè)原則：合成的方法要有重現(xiàn)性，不改變配體的結(jié)合常數(shù)、選擇性或洗脫物與配體間的解離常數(shù)，配體鍵合在基質(zhì)上后，所有鍵合配體的結(jié)合常數(shù)要盡可能均勻；填料要有盡可能小的非特異性吸附，分離機(jī)理和化學(xué)穩(wěn)定性要保持不變；配體的密度要滿足要求。在合成HPAFC填料時(shí)，應(yīng)記住以下幾個(gè)原則：125２、配體所選擇的配體應(yīng)與被分離的蛋白質(zhì)間有一種特異性的生物親合作用。抗原antigens，底物substrates，抑制劑inhibitors，變構(gòu)因子allostericeffectors，協(xié)助因子cofactors，核苷酸nucleutides，激素hormones，酶enzymes，抗體antibodies，核酸nucleosides，半抗原h(huán)apten，受體receptors，合成染料syntheticdyes，糖sugars。２、配體所選擇的配體應(yīng)與被分離的蛋白質(zhì)間有一種特異性的生126特異性配體只針對(duì)單一的物質(zhì)進(jìn)行特異的結(jié)合而與其它物質(zhì)不作用?？贵w－抗原，抗生素蛋白－生物素，激素－受體，蛋白－受體這類配體的選擇性高，使用方便，但為數(shù)較少，其特異性常隨分離條件發(fā)生變化，因此，對(duì)不同的分離對(duì)象為獲得特異性配體，常常需要通過大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。特異性配體127通用性配體通用性配體在一定條件下可與一類或幾種生物分子作用，這種配體一般為小分子。具有容量高，花費(fèi)低等突出優(yōu)點(diǎn)。另外，通過改善吸附和洗脫條件，可以彌補(bǔ)通用性配體親合色譜特異性較差的缺點(diǎn)。三嗪染料，金屬螯合、組氨酸、核苷酸等。通用性配體128生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件1291、三嗪染料

三嗪染料是多環(huán)芳香族的硫化物，含有三嗪反應(yīng)基團(tuán)，與基質(zhì)的連接很容易，有許多官能團(tuán)可以和蛋白質(zhì)進(jìn)行作用，在分離時(shí)與蛋白質(zhì)作用包括離子交換、疏水和電荷轉(zhuǎn)移等。在一定的pH和離子強(qiáng)度下，染料與蛋白質(zhì)表面殘基上的電荷和疏水性差別等綜合因素造成蛋白質(zhì)對(duì)染料的選擇性吸附。染料對(duì)蛋白質(zhì)的作用機(jī)理還不清楚。1、三嗪染料130生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件131生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件1322、金屬螯合配體金屬螯合配體是利用過渡金屬如Fe2+,Ni2+,Cu2+和Zn2+等能與電子供給體N，S和O等原子以配位鍵連接。用亞氨二乙酸類螯合劑與重金屬離子作用，生成帶有多個(gè)配位基的金屬螯合物。這類螯合物在水溶液中與水分子高度溶劑化，具有活潑的羥基和由鹽產(chǎn)生的活性基團(tuán)。這些與基質(zhì)連接的金屬螯合物上的配價(jià)位點(diǎn)就是生物分子的吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在溶液中由溶劑分子或陰離子占據(jù)。因此，在制備連接基質(zhì)的螯合物配體時(shí)要綜合考慮兩個(gè)因素。即配價(jià)金屬的穩(wěn)定性和金屬螯合物的配價(jià)位點(diǎn)。不同吸附位點(diǎn)的螯合物對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性和容量也不相同。金屬螯合物與蛋白質(zhì)的作用主要通過靜電吸附、配價(jià)鍵結(jié)合和共價(jià)鍵結(jié)合三種方式進(jìn)行作用。2、金屬螯合配體133生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件134Commonlyusedaffinitycolumns:Ni2+bindstopolyHistines(example6xHis)Specificantibodies(anti-Flagtag)glutathionebindstoGSTProteinAorGbindsantibodiesAffinitychromatographyCommonlyusedaffinitycolumns135Ni-NTAcolumnsThehighaffinityoftheNi-NTAresinsfor6xHis-taggedproteinsorpeptidesisdueto:1-thestrengthwithwhichtheseionsareheldtotheNTAresinNTAhasatetradentatechelatinggroupthatoccupiesfourofsixsitesinthenickelcoordinationsphereNi-NTAcolumnsThehighaffinit1362-thespecificityoftheinteractionbetweenhistidineresiduesandimmobilizednickelions2-thespecificityoftheinte137生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件1383、外源凝集素ConA是外源性凝集素，對(duì)糖蛋白具有強(qiáng)的親合力，因此可以從混合溶液中將糖蛋白分離出來。4、核苷酸AMP對(duì)脫氫酶具有良好的親合力，可以用來分離脫氫酶及其同功酶。5、組氨酸組氨酸也是一個(gè)很好的通用配體。在氨基酸中組氨酸具有很過獨(dú)特的性質(zhì)，如它的疏水性很弱，由于咪唑環(huán)使其電子轉(zhuǎn)移的可能性很小，其pK值范圍寬，具有不對(duì)稱的碳原子等。這些性質(zhì)決定了組氨酸能以多種形式與蛋白質(zhì)進(jìn)行作用，而且當(dāng)適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)與基質(zhì)作用后，還會(huì)出現(xiàn)與蛋白質(zhì)特異的偶極誘導(dǎo)作用。現(xiàn)在已有很多實(shí)驗(yàn)證明組氨酸與蛋白質(zhì)的作用主要涉及靜電吸附和疏水作用兩方面。此類親合色譜柱已有商品柱出售。3、外源凝集素139C、間隔臂在一些情況下，配體可以直接連在基質(zhì)上，但大多數(shù)情況下，由于載體的幾何位阻常常限制分離物與配體的結(jié)合，尤其是當(dāng)配體為小分子，分離物為大分子時(shí)更為嚴(yán)重。為了使配體能與分離物的作用位點(diǎn)起作用，通常在配體和載體中間加入一定長(zhǎng)度的有機(jī)基團(tuán)，即間隔臂(spacerarm)。C、間隔臂在一些情況下，配體可以直接連在基質(zhì)上，但大多數(shù)140生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件141生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件142間隔臂的長(zhǎng)度和合成方法的選擇必須認(rèn)真考慮，臂太長(zhǎng)，自身返折，使有效長(zhǎng)度比自身更短；太短又達(dá)不到目的，因此，長(zhǎng)度要合適，一般為10-20A。另外，具有親水性，可減弱對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。對(duì)于一個(gè)理想的間隔臂，它應(yīng)該長(zhǎng)度合適，對(duì)分離物不進(jìn)行非特異的吸附(即不能帶太多的電荷和不能有太強(qiáng)的疏水性)，無外加的活性吸附點(diǎn)，有連接配體和載體的雙功能反應(yīng)基團(tuán)。間隔臂的長(zhǎng)度和合成方法的選擇必須認(rèn)真考慮，臂太長(zhǎng)，自身返143七、洗脫過程當(dāng)分離物與配體間的結(jié)合常數(shù)較小時(shí)(102~104M-1)，在等濃度洗脫下，使用洗脫能力弱的流動(dòng)相就可能使分離物獲得分離。但對(duì)于結(jié)合常數(shù)大的蛋白質(zhì)，卻很難洗脫，為了使之洗脫，必須設(shè)法較少分離物與配體間的結(jié)合常數(shù)，以便使k’保持在一個(gè)合適的位置和獲得一個(gè)合適的洗脫峰形。一般有兩種方法可以用來洗脫較強(qiáng)結(jié)合的物質(zhì)，即生物選擇性(競(jìng)爭(zhēng))洗脫和非選擇性洗脫。七、洗脫過程當(dāng)分離物與配體間的結(jié)合常數(shù)較小時(shí)(102144特異性洗脫方法的選擇生物選擇性洗脫可使用等濃度、梯度、分段洗脫和脈沖洗脫方式。等濃度的生物選擇性洗脫適合于配體與蛋白質(zhì)間作用較快的動(dòng)力學(xué)過程。梯度洗脫在HPAFC上分離較寬范圍的配體與蛋白質(zhì)具有不同親合力物質(zhì)是有用的。脈沖洗脫方式(pulsedelution)應(yīng)用較為廣泛，其洗脫方式為當(dāng)樣品負(fù)載于柱上后，再脈沖地注入濃的競(jìng)爭(zhēng)劑。這種方式比梯度或分段洗脫(stepchange)更方便。一次脈沖洗脫或許并不能將樣品完全洗掉，這就需要第二、第三次地進(jìn)行重復(fù)洗脫。一次不能被完全洗掉的原因與動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)。低的流速有利于蛋白質(zhì)的完全洗脫，流速越低，一次洗脫掉樣品的量越高。特異性洗脫方法的選擇145停流洗脫(stopped-flowelution)停流洗脫認(rèn)為是脈沖洗脫應(yīng)用的擴(kuò)展，該技術(shù)通過停止流動(dòng)相的流動(dòng)，讓脈沖進(jìn)入柱子的競(jìng)爭(zhēng)劑在柱中多停留幾分鐘，以保證樣品在一次脈沖洗脫中可以完全洗脫，而且讓峰形變的窄一點(diǎn)。在實(shí)際過程中，停流洗脫實(shí)驗(yàn)過程可以采用以下的方式進(jìn)行。生物特異性洗脫技術(shù)和條件的選擇既依賴于分離的目的，同樣也依賴于生物特異性作用的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)過程。熱力學(xué)作用(K1和Kc1)可以告訴所需競(jìng)爭(zhēng)劑的濃度，生物特異性作用在HPAFC分離中相對(duì)較慢，溶質(zhì)從結(jié)合點(diǎn)上解吸附的時(shí)間對(duì)選擇洗脫方式時(shí)是一個(gè)重要的因素。停流洗脫(stopped-flowelution)146生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件147生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件148非選擇性洗脫非選擇性洗脫使用的流動(dòng)相可以非特異地破壞配體與溶質(zhì)間的結(jié)合。普通非特異洗脫涉及改變流動(dòng)相pH、離子強(qiáng)度、加入一些離液序列的試劑(脲、KSCN)等或有機(jī)試劑。這些修飾劑(modifiers)或許造成配體或溶質(zhì)的失活，或簡(jiǎn)單地破壞配體和蛋白質(zhì)間的離子、靜電或疏水作用。如高濃度鹽常常用來減弱庫(kù)侖作用力、有機(jī)溶劑用來調(diào)整氫鍵和疏水作用，使蛋白質(zhì)與配體間的作用力減弱。非特異性洗脫條件的選擇主要基于大量的實(shí)踐。非選擇性洗脫149優(yōu)點(diǎn)是溶質(zhì)解吸的動(dòng)力學(xué)限制可以被克服；當(dāng)被分離的競(jìng)爭(zhēng)試劑不易獲得時(shí)，非特異性洗脫就提供了一個(gè)非常有用的洗脫方式。缺點(diǎn)：１、它不僅僅可能將結(jié)合或不結(jié)合的物質(zhì)分離，一個(gè)比較明智的方法是選擇作用強(qiáng)度適中不使分離物失活的條件來作為洗脫劑。２、劇烈的非特異性洗脫條件常常造成溶質(zhì)或配體結(jié)構(gòu)不可逆的改變，分離高活性蛋白質(zhì)時(shí)更應(yīng)進(jìn)行仔細(xì)地考慮。優(yōu)點(diǎn)是溶質(zhì)解吸的動(dòng)力學(xué)限制可以被克服；當(dāng)被分離的競(jìng)爭(zhēng)試劑不易150對(duì)于兩個(gè)生物大分子間的作用，如Ab-Ag，受體-蛋白質(zhì)，其作用與酶與底物之間的作用非常相似，符合鑰匙作用和誘導(dǎo)作用模型，這就要求在合成填料時(shí)盡可能保持生物配體的結(jié)構(gòu)不變。對(duì)于兩個(gè)生物大分子間的作用，如Ab-Ag，受體-蛋白151免疫親和層析：將蛋白質(zhì)抗體偶聯(lián)到免疫親和柱可用于抗原蛋白的純化；凝集素親和層析：凝集素是一大類能專一性和糖類和糖復(fù)合物結(jié)合的蛋白質(zhì)，固定化凝集素可用于糖蛋白純化；染料親和層析：有多種染料可與各種類型的酶結(jié)合，又不受酶的作用，可用于多種蛋白的分離。親和層析中的三大通用技術(shù)免疫親和層析：將蛋白質(zhì)抗體偶聯(lián)到免疫親和柱可用于抗原蛋白的純152在各種表達(dá)載體上都帶有各種標(biāo)簽蛋白，如GST-tag、His-tag、V5-tag等，它們不僅可用于鑒定蛋白表達(dá)與否，更可用于與之相連的目標(biāo)蛋白的純化；通過免疫親和層析技術(shù)，只需一步，即可純化帶有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白。親和層析是基因工程中最常用的純化技術(shù)在各種表達(dá)載體上都帶有各種標(biāo)簽蛋白，如GST-tag、His153凝集素親合色譜(Lectinaffinitychromatography)Lectinsaresugar-bindingproteinswithtremendousexperimentalutilitybecauseoftheirspecificinteractionswithglycoconjugates.Lectinaffinitycolumnsareespecaillyusefulforpurifyingmembraneproteinsandsecretoryproteins,whicharefrequentlyglycosylated.凝集素親合色譜(Lectinaffinitychroma154生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件155生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件156八、金屬螯合親合色譜(Immobilizedmetal-ion-affinitychromatography,IMAC)八、金屬螯合親合色譜(Immobilizedmetal-i157生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件158生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件159生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件160生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件161九、應(yīng)用九、應(yīng)用162生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件163生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件164生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件165第五節(jié)高效體積排阻色譜

HighPerformanceSizeExclusionChromatography(SEC)第五節(jié)高效體積排阻色譜

HighPerformance166Size-exclusionchromatographySize-exclusionchromatography167Size-exclusionchromatographyAbsorbanceat280isusedtoidentifyprotein-containingfractions.Youcanalsoperformanenzymespecificassay.Size-exclusionchromatographyA168生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件169生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件170生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件171生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件172要根據(jù)待分離物質(zhì)的分子量，選擇特定的凝膠過濾基質(zhì)；凝膠過濾層析不僅可用于親水性分子的分離，也可用于疏水性分子的分離，當(dāng)用于疏水性分子分離時(shí)，該類層析往往被稱為“凝膠通透層析”；凝膠過濾層析可提供樣品的分子量信息；凝膠過濾的上樣量一般在柱床體積的1～5％；凝膠過濾的樣品濃度越大越好，但一般不要超過100mg/ml。凝膠過濾的注意事項(xiàng)要根據(jù)待分離物質(zhì)的分子量，選擇特定的凝膠過濾基質(zhì)；凝膠過濾的173九、應(yīng)用粗分離除鹽測(cè)量分子量九、應(yīng)用粗分離174生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件175生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件176生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件177生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件178生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件179生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件180第六節(jié)多維色譜

(Multi-dimesionalliquidchromatography,MDLC)

第六節(jié)多維色譜

(Multi-dimesionall181目標(biāo)蛋白質(zhì)其它特征…等電點(diǎn)分子大小帶電狀況疏水性目標(biāo)蛋白的特征相對(duì)分子質(zhì)量目標(biāo)蛋白質(zhì)其它特征…等電點(diǎn)分子大小帶電狀況疏水性目標(biāo)蛋白的特182根據(jù)以上信息，首先進(jìn)行第一維分離,然后將第一維餾分再進(jìn)行第二維分離。為了得到最大的分離效率,必須注意以下兩點(diǎn):1.理想情況下,各維應(yīng)具有完全不同的分離機(jī)制;2.高維的分離速度應(yīng)快于低維的分離速度,以避免已分開的組分在高維分離中重新混合。根據(jù)以上信息，首先進(jìn)行第一維分離,然后將第一183Giddings理論多維色譜的總峰容量(P)等于每一維的峰容量(Pi)的乘積。P=P1×P2×P3······假如兩種分離系統(tǒng)都有100的峰容量,那么良好的二維系統(tǒng)理論上可產(chǎn)生10000的峰容量。Giddings理論多維色譜的總峰容量(184Giddings指出峰容量的提高程度和樣品組分分布的有序程度有著密切的關(guān)系。與一維分離模式相比,多維分離技術(shù)的最大特點(diǎn)是可極大地提高峰容量。樣品維數(shù)(sampledimen-sionality)Giddings指出峰容量的提高程度和樣品組分分布185只有當(dāng)這兩個(gè)維數(shù)相等時(shí),才能充分發(fā)揮多維系統(tǒng)的分離能力。樣品維數(shù)大于系統(tǒng)維數(shù)：→組分的峰分布是無序的,會(huì)限制分離的效果。樣品維數(shù)小于系統(tǒng)維數(shù)：→盡管組分的峰分布是有序的,但多維系統(tǒng)的高峰容量的性能并沒有得到發(fā)揮。只有當(dāng)這兩個(gè)維數(shù)相等時(shí),才能充分發(fā)揮多維系統(tǒng)的分離1861.多維高效液相色譜(HPLC)3.多維高效液相色譜-毛細(xì)管電泳(HPLC-CE)2.多維毛細(xì)管電泳(CE)常見的多維色譜分析法1.多維高效液相色譜(HPLC)3.多維高效液相色譜-毛187多維高效液相色譜(HPLC)即是將分離機(jī)理不同而又相互獨(dú)立的兩支色譜柱串聯(lián)起來構(gòu)成的分離系統(tǒng)。樣品經(jīng)過第一維的色譜柱進(jìn)入接口中,通過濃縮、捕集或切割后被切換進(jìn)入第二維色譜柱及檢測(cè)器中。在一維分離系統(tǒng)中不能完全分離的組分,可能在二維系統(tǒng)中得到更好的分離,分離能力、分辨率得到極大的提高。

以二維液相色譜為例：多維高效液相色譜(HPLC)即是將分離機(jī)理不188189

蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)多維液相色譜189蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)多維液相色譜1892DLiquidChromatography與傳統(tǒng)2-DE相比多維液相色譜系統(tǒng)最突出的優(yōu)點(diǎn)是:(1)快速,靈敏,便于自動(dòng)化,能夠滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究高通量的要求。(2)對(duì)蛋白質(zhì)全組分進(jìn)行分析時(shí)的歧視效應(yīng)大大減小。2DLiquidChromatography與傳統(tǒng)2-D190ElectrosprayElectrospray191LC/IonTrapLC/IonTrap192ApproachforProteomeAnalysis193

DigestionProteinMixturePeptideMixtureSamplepreparationSeparationIonizationMassSpectrometryInformatics2DGelNano-HPLCElectrosprayApproachforProteomeAnalysis193194

Bottom-up

Forhigh-throughputproteomicsDigestionwithanenzymeProteins+PeptidesRPLCPeptidesSeparationTop-down

forintactproteinsMSMS/MSIdentifyproteinDeduceprimarystructureMSMS/MSIdentifyproteinDeduceprimarystructureEspeciallyforpost-translationModification(PTMs)RPLCProteins+peptidesSeparationEndogenous

proteins+peptidesNano-HPLCSeparationforProteomics194Bottom-upForhigh-throu194MudPITTrypsin+proteinsp53IEX-HPLCRP-HPLCMudPITTrypsinp53IEX-HPLCRP-HPL195InstituteofModernSeparationScience

生物大分子的色譜分離技術(shù)

及應(yīng)用白泉教授

西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所InstituteofModernSeparationScience,NorthwestUniversity,KeyLabofModernSeparationScienceinShaanxiProvince,KeyLaboratoryofSyntheticandNaturalFunctionalMoleculeChemistryofMinistryofEducation,Xi’an,710069,ChinaInstituteofModernSeparation196第一節(jié)反相高效液相色譜

HighPerformanceReversed-PhaseLiquidChromatography(RPLC)第一節(jié)反相高效液相色譜

HighPerformance197一、RPLC的特點(diǎn)1、具有分離效果好，分析速度快，檢測(cè)靈敏高，重復(fù)性好，易于直接定量而后實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。2、采用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，比鹽水體系易從樣品中除去有機(jī)溶劑，后處理比較方便。3、比其他幾類HPLC法分辨率高，同樣長(zhǎng)的柱子，它分離蛋白質(zhì)的數(shù)目較其他方法多。4、若蛋白使用此方法不失活時(shí)，RPLC是除去熱源非常有效的方法，也是分離純化非常有效的工具。如IL-2,-IFN和胰島素等純化中常用RPLC。即使是蛋白質(zhì)在分離后無生物活性，仍可進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。它也是蛋白質(zhì)氨基酸序列分析前處理非常有效的工具。一、RPLC的特點(diǎn)1、具有分離效果好，分析速度快，檢測(cè)靈敏高198二、缺點(diǎn)1、固定相疏水性過強(qiáng)，極易造成蛋白質(zhì)的構(gòu)象不變化,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活。2、流動(dòng)相采用有機(jī)溶劑和低pH，也可使蛋白質(zhì)的活性降低，對(duì)蛋白質(zhì)易污染。3、有機(jī)溶劑有毒，對(duì)環(huán)境易造成污染，且有機(jī)溶劑不易除去。二、缺點(diǎn)1、固定相疏水性過強(qiáng)，極易造成蛋白質(zhì)的構(gòu)象不變化,而199四、保留機(jī)理四、保留機(jī)理200疏溶劑化理論認(rèn)為溶質(zhì)或蛋白質(zhì)在RPLC上進(jìn)行分離時(shí)，與生物膜中的流動(dòng)鑲嵌結(jié)構(gòu)(Fluidmosaticmodel)有某些相似之處。在這個(gè)模型中，蛋白質(zhì)的非極性區(qū)與膜中的類脂部分(相當(dāng)于反相色譜填料的配體)相鄰，而蛋白質(zhì)的極性部分則暴露于含水的環(huán)境中(相當(dāng)于流動(dòng)相)。既蛋白質(zhì)在RPLC分離過程中，疏水效應(yīng)起著重要的作用。疏溶劑化理論認(rèn)為溶質(zhì)或蛋白質(zhì)在RPLC上進(jìn)行201這個(gè)締合產(chǎn)物可用圖5-1表示。當(dāng)非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)分子中的非極性部分引入到極性的流動(dòng)相時(shí)，分子中的非極性部分總是趨向與其它非極性部分蔟集一起，這樣可以減少與極性溶劑的接觸面積，使體系能量最低，這是由于圖中黑箭頭所示的疏溶劑力的緣故。流動(dòng)相的表面張力越高，這中束縛力就越強(qiáng)。相反，若溶質(zhì)分子中有極性官能團(tuán)存在時(shí)，則和極性溶劑的作用力(空箭頭所示)增加，不利于與固定相的締合。這個(gè)締合產(chǎn)物可用圖5-1表示。當(dāng)非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)分子中的非極202五、固定相1、基質(zhì)剛性基質(zhì)：硅膠、玻璃球等半剛性基質(zhì)：交聯(lián)聚苯乙烯聚合物等軟基質(zhì)：瓊脂糖，Sepherose,Sepherdex要求：粒度：5-10m孔徑：小分子：<100A大分子：200~500A五、固定相1、基質(zhì)2032、配體

非極性化合物C2,C4,C8,C18等，苯環(huán)長(zhǎng)鏈烷烴隨著碳數(shù)的增大，疏水性增大，保留值增大。對(duì)不易保留的物質(zhì)，采用長(zhǎng)鏈；對(duì)易保留的物質(zhì)，可用短鏈。長(zhǎng)鏈由于空間位阻，鍵合密度小。鏈長(zhǎng)，可掩蓋硅羥基。2、配體204生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件205生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件206六、流動(dòng)相1、要求在210nm-280nm的紫外吸收要小。溶劑要容易除去。峰形要窄。高的生物活性和質(zhì)量回收率。價(jià)格低，毒性小。選擇性好。六、流動(dòng)相1、要求207生物大分子的色譜分離技術(shù)及應(yīng)用(西北大學(xué)現(xiàn)代分離研究所)課件2082、常用有機(jī)溶劑：甲醇，正丙醇，異丙醇，乙腈，四氫呋喃等3、離子對(duì)試劑：三氟醋酸，磷酸，甲酸作用：與蛋白質(zhì)形成離子對(duì)使其在