流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件

流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。

原理：以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微粒)的性狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytomet1流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介

流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀（FlowCytom2流式細(xì)胞儀特點(diǎn)單細(xì)胞懸液或生物顆粒

分析速度高多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)流式細(xì)胞儀特點(diǎn)單細(xì)胞懸液或生物顆粒分析速度高多參數(shù)精度高3流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細(xì)胞儀既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀4BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur特點(diǎn)：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定自動(dòng)化程度高操作簡(jiǎn)便使用壽命長(zhǎng)配備1-2根激光細(xì)胞分選速度慢，主要用于細(xì)胞分析臺(tái)式機(jī)

雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur特點(diǎn)：臺(tái)式機(jī)5FACSAriaⅢ科研型分選流式細(xì)胞儀特點(diǎn)：分辨率高選配多種波長(zhǎng)和類型激光器可將感興趣細(xì)胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析FACSAriaⅢ科研型分選流式細(xì)胞儀特點(diǎn)：6FACSVantageDiVa科研型（大型機(jī)）特點(diǎn)：多數(shù)字化適用用各類細(xì)胞分選4路分選FACSVantageDiVa科研型（大型機(jī)）特點(diǎn)：7BeckmanCoulter流式細(xì)胞儀EpicsXL單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500單激光或雙激光五色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分選型BeckmanCoulter流式細(xì)胞儀EpicsXL單8第一節(jié)

流式細(xì)胞儀－結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)第一節(jié)

流式細(xì)胞儀－結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)9液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)10液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)。鞘液鞘液細(xì)胞流激光照射點(diǎn)流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液11APC（紅色，660nm）RNaseA細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用前向散射光(forwardscatter,FSC);實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)假三維圖和三維圖BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。光電倍增管(photomultiplier,PMT)細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。光電檢測(cè)器(photodetector)FACSVantageDiVa光信號(hào)的類型：DNA流式檢測(cè)的主要指標(biāo)將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)APC（紅色，660nm）液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)12進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不13光學(xué)系統(tǒng)激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。光學(xué)系統(tǒng)激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。14光學(xué)原理散射信號(hào)與熒光信號(hào)光學(xué)原理散射信號(hào)與熒光信號(hào)15熒光信號(hào)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。發(fā)射波長(zhǎng)(熒光波長(zhǎng))Emissionwavelength激發(fā)波長(zhǎng)Excitationwavelength＜熒光信號(hào)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再16流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件17LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統(tǒng)：濾光片LongpassShort18電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)19電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。前置放大電路將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：光電檢測(cè)器20光電檢測(cè)器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管光電檢測(cè)器(photodetector)光電二極管(phot21光信號(hào)的類型：散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號(hào)自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。流式細(xì)胞分析的信息——光信號(hào)檢測(cè)光信號(hào)的類型：流式細(xì)胞分析的信息——光信號(hào)檢測(cè)22PE（黃色，575nm）常用同型抗體對(duì)照收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)封閉：血清和同型抗體EpicsXL單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。APC（紅色，660nm）假三維圖和三維圖FACSAriaⅢGallios三激光十色，分析型雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。是細(xì)胞的固有參數(shù)。通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合原理：以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微粒)的性狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。流式細(xì)胞的基本信息:“形態(tài)”P(pán)E（黃色，575nm）流式細(xì)胞的基本信息:“形態(tài)”23散射光的作用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片散射光的作用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)24流式細(xì)胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合流式細(xì)胞的主要信息:FluorescenceFL1最常用的標(biāo)25Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-綠色FL2-黃色、橙色FL3-紅色FL4-紅色488FL1BP530/30515-545nmFITC（綠色，520nm）FL2BP585/42564-606nmPE（黃色，575nm）FL3670LP﹥670nmPE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（紅色）635FL4BP661/16653-669nmAPC（紅色，660nm）Forwardscatter(FSC)488FL1BP26流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件27流式常見(jiàn)圖形(HistogramPlot)適用于：?jiǎn)螀?shù)分析DNA倍體分析抗原表達(dá)分析流式常見(jiàn)圖形(HistogramPlot)適用于：?jiǎn)螀?shù)28流式常見(jiàn)圖形(DotPlot)散點(diǎn)圖偽彩圖流式常見(jiàn)圖形(DotPlot)散點(diǎn)圖偽彩圖29假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC→CD45→CD14→假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-H30等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞31設(shè)門(mén)與數(shù)據(jù)分析門(mén)(Gate，簡(jiǎn)寫(xiě)G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語(yǔ)，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過(guò)程實(shí)際上就是選門(mén)和設(shè)門(mén)的過(guò)程。橢圓形圓形設(shè)門(mén)與數(shù)據(jù)分析門(mén)(Gate，簡(jiǎn)寫(xiě)G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要32十字門(mén)線性門(mén)十字門(mén)線性門(mén)33流式分選

電荷式分選超聲振動(dòng)器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板流式分選電荷式分選lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)34第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用分析群體細(xì)胞所需時(shí)間短多參數(shù)分析定性或定量第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用分析群體細(xì)胞35流式應(yīng)用常見(jiàn)范圍細(xì)胞大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列等細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、PH、Ca++、細(xì)胞活性等流式應(yīng)用常見(jiàn)范圍細(xì)胞大小36將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體光信號(hào)的類型：PI被用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。460500540PE（黃色，575nm）當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur光電二極管(photodiode)將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞ExcitationwavelengthAPC（紅色，660nm）光信號(hào)的類型：APC（紅色，660nm）處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。

樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液

標(biāo)記熒光抗體檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計(jì)學(xué)分析繼續(xù)培養(yǎng)將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。樣品單細(xì)胞37實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉

封閉：血清和同型抗體實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化38細(xì)胞染色染色要求：特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群非特異反應(yīng)水平低抗體效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本使用特異的單克隆抗體最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體采用適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照物抗體最適滴度細(xì)胞染色染色要求：39抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子：PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原

FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原間接標(biāo)記：適用范圍廣,biotin-avidin不適合弱抗原的檢測(cè)抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體40實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)空白對(duì)照：ALL陰性對(duì)照：評(píng)估非特異反應(yīng)水平，界定陰性范圍

常用同型抗體對(duì)照單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照）多色分析：陰性對(duì)照（或同型對(duì)照），單陽(yáng)性對(duì)照

（用于儀器校正），補(bǔ)償調(diào)整管陽(yáng)性對(duì)照：確定抗原表達(dá)正常時(shí)的抗原表達(dá)強(qiáng)度和百分含量。（特別在檢測(cè)陰性時(shí)）實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)空白對(duì)照：ALL41流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)細(xì)胞周期分析細(xì)胞凋亡分析流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)42淋巴細(xì)胞表面抗原分析樣本來(lái)源新鮮抗凝全血PBMC單克隆熒光抗體染色溶血洗細(xì)胞固定上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面抗原分析樣本來(lái)源43淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析樣本來(lái)源新鮮抗凝全血PBMC細(xì)胞表面抗體染色溶血、固定細(xì)胞打孔細(xì)胞內(nèi)抗體染色上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析樣本來(lái)源44細(xì)胞周期分析：G1MG2SQuiescentcellsG0細(xì)胞周期分析：G1MG2SQuiescentcellsG045處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二46FITC（綠色，520nm）第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。假三維圖和三維圖單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照）光電倍增管(photomultiplier,PMT)側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)超聲振動(dòng)器(15-100kHz)側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。Forwardscatter(FSC)熒光分子：PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（紅色）DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。FITC（綠色，520nm）47流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件48樣品制備

1000rpm5分鐘收集2X106個(gè)細(xì)胞PBS漂洗兩次

70%酒精4度固定過(guò)夜收集固定的細(xì)胞PBS漂洗PBS懸浮細(xì)胞2.5μl10μg/μlRNaseA37℃消化1小時(shí)過(guò)300目細(xì)胞篩50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)，1000rpm5分鐘離心兩次混勻，室溫靜止5分鐘上機(jī)樣品制備1000rpm5分鐘PBS漂洗70%酒精收49DNA流式檢測(cè)的主要指標(biāo)DNA含量:ploidy：細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量

DI：測(cè)定標(biāo)本的G0/G1期細(xì)胞DNA含量與同種系正常細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞DNA含量的比值，表示細(xì)胞倍體性PI：增殖細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例CV：G0/G1期細(xì)胞DNA含量變異系數(shù)DNA流式檢測(cè)的主要指標(biāo)DNA含量:50AnnexinVAssay

（建議用于懸浮細(xì)胞）AnnexinVAssay

51在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，一旦發(fā)生細(xì)胞凋亡，可以從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)迅速翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，使得PS暴露在細(xì)胞膜表面。在Ca2+存在時(shí)，AnnexinV與PS有很高的親和力，可與之迅速結(jié)合。PS外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂、DNA片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得AnnexinV與PS的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測(cè)標(biāo)志事件。PI被用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。壞死細(xì)胞可以同時(shí)與annexinV-FITC和PI結(jié)合顯色，而PI則被排除在活細(xì)胞(FITC陰性)和早期凋亡細(xì)胞(FITC陽(yáng)性)之外。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，一旦發(fā)生細(xì)52AnnexinV-FITC/PI雙染色法雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞雙陽(yáng)：晚期凋亡細(xì)胞PI單陽(yáng)：壞死細(xì)胞AnnexinV-FITC/PI雙染色法雙陰：活細(xì)胞53PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。AnnexinV-FITCPI活細(xì)胞早期凋亡晚期凋亡壞死細(xì)胞裸核PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI54流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件55進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不56收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)APC（紅色，660nm）處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。FACSVantageDiVaForwardscatter(FSC)收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)流式細(xì)胞分析的信息——光信號(hào)檢測(cè)PI被用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。光電倍增管(photomultiplier,PMT)流式細(xì)胞分析的信息——光信號(hào)檢測(cè)FACSAriaⅢ適用于高速分選和多色分析超聲振動(dòng)器(15-100kHz)等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。FACSVantageDiVaSidescatter(SSC)最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。AnnexinV-FITC/PI雙染色法進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。前置放大電路將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：光電檢測(cè)器57Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-綠色FL2-黃色、橙色FL3-紅色FL4-紅色488FL1BP530/30515-545nmFITC（綠色，520nm）FL2BP585/42564-606nmPE（黃色，575nm）FL3670LP﹥670nmPE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（紅色）635FL4BP661/16653-669nmAPC（紅色，660nm）Forwardscatter(FSC)488FL1BP58等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞59流式分選

電荷式分選超聲振動(dòng)器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板流式分選電荷式分選lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)60第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用分析群體細(xì)胞所需時(shí)間短多參數(shù)分析定性或定量第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用分析群體細(xì)胞61

樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液

標(biāo)記熒光抗體檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計(jì)學(xué)分析繼續(xù)培養(yǎng)樣品單細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)62細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、PH、Ca++、細(xì)胞活性等雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞460500540FITC（綠色，520nm）Gallios三激光十色，分析型將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)?？贵w效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本460500540特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉ploidy：細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量PE（黃色，575nm）流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).光電檢測(cè)器(photodetector)淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（FSC）；激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照）最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體假三維圖和三維圖（用于儀器校正），補(bǔ)償調(diào)整管光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。FACSAriaⅢ細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等460500540AnnexinV-FITC/PI雙染色法將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。PE（黃色，575nm）FACSAriaⅢ單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照）PE（黃色，575nm）APC（紅色，660nm）收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照）實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉

封閉：血清和同型抗體細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、PH、Ca++、細(xì)胞活性等當(dāng)代63流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。

原理：以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微粒)的性狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytomet64流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介

流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀（FlowCytom65流式細(xì)胞儀特點(diǎn)單細(xì)胞懸液或生物顆粒

分析速度高多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)流式細(xì)胞儀特點(diǎn)單細(xì)胞懸液或生物顆粒分析速度高多參數(shù)精度高66流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細(xì)胞儀既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀67BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur特點(diǎn)：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定自動(dòng)化程度高操作簡(jiǎn)便使用壽命長(zhǎng)配備1-2根激光細(xì)胞分選速度慢，主要用于細(xì)胞分析臺(tái)式機(jī)

雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur特點(diǎn)：臺(tái)式機(jī)68FACSAriaⅢ科研型分選流式細(xì)胞儀特點(diǎn)：分辨率高選配多種波長(zhǎng)和類型激光器可將感興趣細(xì)胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析FACSAriaⅢ科研型分選流式細(xì)胞儀特點(diǎn)：69FACSVantageDiVa科研型（大型機(jī)）特點(diǎn)：多數(shù)字化適用用各類細(xì)胞分選4路分選FACSVantageDiVa科研型（大型機(jī)）特點(diǎn)：70BeckmanCoulter流式細(xì)胞儀EpicsXL單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500單激光或雙激光五色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分選型BeckmanCoulter流式細(xì)胞儀EpicsXL單71第一節(jié)

流式細(xì)胞儀－結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)第一節(jié)

流式細(xì)胞儀－結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)72液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)73液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)。鞘液鞘液細(xì)胞流激光照射點(diǎn)流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液74APC（紅色，660nm）RNaseA細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用前向散射光(forwardscatter,FSC);實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)假三維圖和三維圖BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。光電倍增管(photomultiplier,PMT)細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。光電檢測(cè)器(photodetector)FACSVantageDiVa光信號(hào)的類型：DNA流式檢測(cè)的主要指標(biāo)將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)APC（紅色，660nm）液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)75進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不76光學(xué)系統(tǒng)激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。光學(xué)系統(tǒng)激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。77光學(xué)原理散射信號(hào)與熒光信號(hào)光學(xué)原理散射信號(hào)與熒光信號(hào)78熒光信號(hào)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。發(fā)射波長(zhǎng)(熒光波長(zhǎng))Emissionwavelength激發(fā)波長(zhǎng)Excitationwavelength＜熒光信號(hào)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再79流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件80LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統(tǒng)：濾光片LongpassShort81電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)82電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。前置放大電路將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：光電檢測(cè)器83光電檢測(cè)器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管光電檢測(cè)器(photodetector)光電二極管(phot84光信號(hào)的類型：散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號(hào)自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。流式細(xì)胞分析的信息——光信號(hào)檢測(cè)光信號(hào)的類型：流式細(xì)胞分析的信息——光信號(hào)檢測(cè)85PE（黃色，575nm）常用同型抗體對(duì)照收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)封閉：血清和同型抗體EpicsXL單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。APC（紅色，660nm）假三維圖和三維圖FACSAriaⅢGallios三激光十色，分析型雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。是細(xì)胞的固有參數(shù)。通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合原理：以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微粒)的性狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。流式細(xì)胞的基本信息:“形態(tài)”P(pán)E（黃色，575nm）流式細(xì)胞的基本信息:“形態(tài)”86散射光的作用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片散射光的作用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)87流式細(xì)胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合流式細(xì)胞的主要信息:FluorescenceFL1最常用的標(biāo)88Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-綠色FL2-黃色、橙色FL3-紅色FL4-紅色488FL1BP530/30515-545nmFITC（綠色，520nm）FL2BP585/42564-606nmPE（黃色，575nm）FL3670LP﹥670nmPE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（紅色）635FL4BP661/16653-669nmAPC（紅色，660nm）Forwardscatter(FSC)488FL1BP89流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件90流式常見(jiàn)圖形(HistogramPlot)適用于：?jiǎn)螀?shù)分析DNA倍體分析抗原表達(dá)分析流式常見(jiàn)圖形(HistogramPlot)適用于：?jiǎn)螀?shù)91流式常見(jiàn)圖形(DotPlot)散點(diǎn)圖偽彩圖流式常見(jiàn)圖形(DotPlot)散點(diǎn)圖偽彩圖92假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC→CD45→CD14→假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-H93等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞94設(shè)門(mén)與數(shù)據(jù)分析門(mén)(Gate，簡(jiǎn)寫(xiě)G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語(yǔ)，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過(guò)程實(shí)際上就是選門(mén)和設(shè)門(mén)的過(guò)程。橢圓形圓形設(shè)門(mén)與數(shù)據(jù)分析門(mén)(Gate，簡(jiǎn)寫(xiě)G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要95十字門(mén)線性門(mén)十字門(mén)線性門(mén)96流式分選

電荷式分選超聲振動(dòng)器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板流式分選電荷式分選lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)97第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用分析群體細(xì)胞所需時(shí)間短多參數(shù)分析定性或定量第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用分析群體細(xì)胞98流式應(yīng)用常見(jiàn)范圍細(xì)胞大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列等細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、PH、Ca++、細(xì)胞活性等流式應(yīng)用常見(jiàn)范圍細(xì)胞大小99將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體光信號(hào)的類型：PI被用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。460500540PE（黃色，575nm）當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出BD公司產(chǎn)品

FACSCalibur光電二極管(photodiode)將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞ExcitationwavelengthAPC（紅色，660nm）光信號(hào)的類型：APC（紅色，660nm）處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。

樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液

標(biāo)記熒光抗體檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計(jì)學(xué)分析繼續(xù)培養(yǎng)將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。樣品單細(xì)胞100實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉

封閉：血清和同型抗體實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化101細(xì)胞染色染色要求：特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群非特異反應(yīng)水平低抗體效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本使用特異的單克隆抗體最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體采用適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照物抗體最適滴度細(xì)胞染色染色要求：102抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子：PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原

FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原間接標(biāo)記：適用范圍廣,biotin-avidin不適合弱抗原的檢測(cè)抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體103實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)空白對(duì)照：ALL陰性對(duì)照：評(píng)估非特異反應(yīng)水平，界定陰性范圍

常用同型抗體對(duì)照單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照）多色分析：陰性對(duì)照（或同型對(duì)照），單陽(yáng)性對(duì)照

（用于儀器校正），補(bǔ)償調(diào)整管陽(yáng)性對(duì)照：確定抗原表達(dá)正常時(shí)的抗原表達(dá)強(qiáng)度和百分含量。（特別在檢測(cè)陰性時(shí)）實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)空白對(duì)照：ALL104流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)細(xì)胞周期分析細(xì)胞凋亡分析流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)105淋巴細(xì)胞表面抗原分析樣本來(lái)源新鮮抗凝全血PBMC單克隆熒光抗體染色溶血洗細(xì)胞固定上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面抗原分析樣本來(lái)源106淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析樣本來(lái)源新鮮抗凝全血PBMC細(xì)胞表面抗體染色溶血、固定細(xì)胞打孔細(xì)胞內(nèi)抗體染色上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析樣本來(lái)源107細(xì)胞周期分析：G1MG2SQuiescentcellsG0細(xì)胞周期分析：G1MG2SQuiescentcellsG0108處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二109FITC（綠色，520nm）第二節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。假三維圖和三維圖單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照）光電倍增管(photomultiplier,PMT)側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)超聲振動(dòng)器(15-100kHz)側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。Forwardscatter(FSC)熒光分子：PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（紅色）DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。FITC（綠色，520nm）110流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件111樣品制備

1000rpm5分鐘收集2X106個(gè)細(xì)胞PBS漂洗兩次

70%酒精4度固定過(guò)夜收集固定的細(xì)胞PBS漂洗PBS懸浮細(xì)胞2.5μl10μg/μlRNaseA37℃消化1小時(shí)過(guò)300目細(xì)胞篩50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)，1000rpm5分鐘離心兩次混勻，室溫靜止5分鐘上機(jī)樣品制備1000rpm5分鐘PBS漂洗70%酒精收112DNA流式檢測(cè)的主要指標(biāo)DNA含量:ploidy：細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量

DI：測(cè)定標(biāo)本的G0/G1期細(xì)胞DNA含量與同種系正常細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞DNA含量的比值，表示細(xì)胞倍體性PI：增殖細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例CV：G0/G1期細(xì)胞DNA含量變異系數(shù)DNA流式檢測(cè)的主要指標(biāo)DNA含量:113AnnexinVAssay

（建議用于懸浮細(xì)胞）AnnexinVAssay

114在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，一旦發(fā)生細(xì)胞凋亡，可以從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)迅速翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，使得PS暴露在細(xì)胞膜表面。在Ca2+存在時(shí)，AnnexinV與PS有很高的親和力，可與之迅速結(jié)合。PS外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂、DNA片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得AnnexinV與PS的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測(cè)標(biāo)志事件。PI被用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。壞死細(xì)胞可以同時(shí)與annexinV-FITC和PI結(jié)合顯色，而PI則被排除在活細(xì)胞(FITC陰性)和早期凋亡細(xì)胞(FITC陽(yáng)性)之外。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，一旦發(fā)生細(xì)115AnnexinV-FITC/PI雙染色法雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞雙陽(yáng)：晚期凋亡細(xì)胞PI單陽(yáng)：壞死細(xì)胞AnnexinV-FITC/PI雙染色法雙陰：活細(xì)胞116PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。AnnexinV-FITCPI活細(xì)胞早期凋亡晚期凋亡壞死細(xì)胞裸核PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI117流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理課件118進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。進(jìn)樣速率控制通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不119收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)APC（紅色，660nm）處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。FACSVantageDiVaForwardscatter(FSC)收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)流式細(xì)胞分析的信息——光信號(hào)檢測(cè)PI被用來(lái)區(qū)分存活的