細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件

細(xì)胞原代培養(yǎng)課時細(xì)胞原代培養(yǎng)課時1（優(yōu)選）細(xì)胞原代培養(yǎng)課時（優(yōu)選）細(xì)胞原代培養(yǎng)課時1.細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則（1）準(zhǔn)入制度

一、無菌培養(yǎng)基本技術(shù)在本室工作的實驗人員應(yīng)嚴(yán)格遵守本室工作守則，外來人員在進(jìn)入凈化室工作之前，必須接受培訓(xùn)；沒有經(jīng)過培訓(xùn)的人員不得單獨進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室工作；進(jìn)入培養(yǎng)后要保持安靜，不得大聲喧嘩。1.細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則一、無菌培養(yǎng)基本技術(shù)在本室工（2）安全制度細(xì)胞必須注意安全用電；謹(jǐn)慎使用酒精燈，不能在有明火的情況下加、換酒精；實驗人員自覺維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對室內(nèi)的儀器如CO2孵箱等要經(jīng)常注意機器運轉(zhuǎn)情況，發(fā)現(xiàn)問題及時檢修或報告請人檢修；離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；對不符合凈化室安全規(guī)定的行為主動報告主管老師。

（2）安全制度安全??！安全！?。?）.衛(wèi)生消毒制度一般情況下細(xì)胞間每日消毒一次（包括緩沖間），方法為紫外線消毒（每次30分鐘至1小時）一次，另外每周用10％乳酸在緊閉門窗下熏蒸30分鐘；實驗完畢應(yīng)及時清理所用物品，注意臺面整潔；及時清洗所用隔離衣，并高壓滅菌后存放于指定位置；除實驗必須的用品外，其它物品不得帶入細(xì)胞室；細(xì)胞室內(nèi)所用儀器及附屬設(shè)備均應(yīng)在指定范圍內(nèi)使用，不得隨意轉(zhuǎn)移地點，以便他人順利使用；細(xì)胞室實施值日生負(fù)責(zé)制，值班人員負(fù)責(zé)檢查室內(nèi)是否保持清潔整齊，督促違反規(guī)定者改正錯誤。（3）.衛(wèi)生消毒制度細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件（4）出入制度細(xì)胞培養(yǎng)室共有兩個緩沖間，進(jìn)入每個緩沖間必須更換指定消毒的拖鞋；穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；人員流動：原則為進(jìn)出細(xì)胞室應(yīng)按次序開、關(guān)門，只有將前面打開的門關(guān)閉后才允許打開下一個門，出入線路絕對不能逆行，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。物品流動：所有進(jìn)出細(xì)胞培養(yǎng)室的物品均應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行；物品進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；人員進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室后，關(guān)閉紫外燈，打開傳遞窗內(nèi)側(cè)門，取出物品；物品出室次序與以上進(jìn)室次序相反，但不需紫外線照射。（4）出入制度無菌間細(xì)胞室緩沖間無菌間細(xì)胞室緩沖間2.細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)

體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。2.細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個細(xì)胞/mL；細(xì)胞生長密度不高時，不能急于傳代。培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng);因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。半懸浮生長細(xì)胞傳代（293細(xì)胞）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材消化后組織不僅要盡量使消化液失活，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。影響胰蛋白酶作用的主要因素需及時傳代

傳不傳代及何時傳代

根據(jù)

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征去除無用組織和避免干燥；有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptictechnique)培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)

無菌(asepsis)無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptictechnique)Termstoremember對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會?！九囵B(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒?！静僮饕跋尽繜o菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件

原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！鞠词趾椭b】原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；然后紫外線消毒30min。需及時傳代

傳不傳代及何時傳代

根據(jù)

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。主要的克隆方法有5種細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性;含義:包含

①原代培養(yǎng)實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長繁殖；2、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代長期培養(yǎng)時，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長；原則上和外科手術(shù)相同。25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；成纖維細(xì)胞其貼壁過程快，能在短時間內(nèi)完成附著過程，而上皮細(xì)胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。

在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。培養(yǎng)瓶滴管、試管、吸管【火焰消毒】進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。在

進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。【操作】進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件二、原代培養(yǎng)

Primaryculture概念

從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前的時期，一個特征性的必然的生長階段。完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過渡和適應(yīng)過程，恢復(fù)了分裂增殖與生長發(fā)育的能力。1.細(xì)胞原代培養(yǎng)概論二、原代培養(yǎng)Primaryculture含義:包含

①原代培養(yǎng)實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長繁殖；

②原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細(xì)胞繁殖的“代”數(shù)；

③原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液。含義:包含

①原代培養(yǎng)實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿特點(1)性質(zhì)

①性狀似體內(nèi)，可表達(dá)某些形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能,更能代表活體細(xì)胞最接近在體時的情況；

②細(xì)胞異質(zhì)性細(xì)胞成分混雜，除目的細(xì)胞之外，

其它各種細(xì)胞還存在；

③細(xì)胞活躍移動，分裂不旺盛；

④相互依賴性強，獨立生存能力差,不易單個培養(yǎng)。特點特點(2)發(fā)展過程:調(diào)整組成

原代培養(yǎng)的產(chǎn)生選擇

結(jié)果:形成相對均一的細(xì)胞系選擇第一步:形成原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)

組織塊:能遷移出的細(xì)胞

消化分散:操作中能生存、附著，能懸浮生存。

特點特點發(fā)展過程選擇第二步:

時間數(shù)小時后至鋪滿

(匯合confluence)

變化數(shù)小時后至進(jìn)一步選擇中

3種情況:能增殖

能存活

不能存活

細(xì)胞類型繼續(xù)改變,至鋪滿

特點發(fā)展過程經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；待孔內(nèi)細(xì)胞增至500-600個時進(jìn)行分離培養(yǎng)。實驗完畢應(yīng)及時清理所用物品，注意臺面整潔；待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個克隆的細(xì)胞群體。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞分散開。內(nèi)臟和實體瘤的取材血液細(xì)胞的取材物品進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；應(yīng)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗人員自覺維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對室內(nèi)的首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長，為了保證實驗結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實驗，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實驗研究的重要一步。消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。更能代表活體細(xì)胞最接近在體時的情況；此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。雞（鴨）鳥類胚胎組織取材如腫瘤突變細(xì)胞通過此方法建立細(xì)胞系。特點發(fā)展過程選擇第三步:

時間鋪滿后

(可用于生長區(qū)域已被利用)

變化通過密度抑制

密度依賴性敏感的細(xì)胞(如正常細(xì)胞)

密度依賴性敏感低的細(xì)胞(如永生性細(xì)胞)經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可特點發(fā)展過程需及時傳代

傳不傳代及何時傳代

根據(jù)

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征特點發(fā)展過程2.原代細(xì)胞的取材

人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。2.原代細(xì)胞的取材人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的（1）取材的基本要求取材要注意新鮮和保鮮，取材部位準(zhǔn)確；應(yīng)嚴(yán)格無菌，盡快培養(yǎng)；防止機械損傷；去除無用組織和避免干燥；應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等；作好記錄。（1）取材的基本要求細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件（2）各類組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實體瘤的取材血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動物組織取材人胚體組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材（2）各類組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2－4平方厘米。內(nèi)臟和實體瘤的取材內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實體瘤的取材血液細(xì)胞的取材血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時應(yīng)注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材

嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動物組織取材①鼠胚組織取材首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。動物組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件3.原代細(xì)胞的分離和制作人或動物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來。(1)懸浮細(xì)胞的分離方法?組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。3.原代細(xì)胞的分離和制作(1)懸浮細(xì)胞的分離方法(2)實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。A.機械分散法方法:特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。(2)實體組織材料的分離方法B.消化分離法組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。B.消化分離法酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞分散開。酶消化分離法影響胰蛋白酶作用的主要因素

細(xì)胞類型酶的活力酶的濃度溫度pH無機鹽離子消化時間影響胰蛋白酶作用的主要因素膠原酶（CollagenaseCollagenase）消化法膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。膠原酶（CollagenaseCollagenase）消化細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件C.消化分離法的操作步驟剪切加液漂洗消化棄去消化液漂洗機械分散C.消化分離法的操作步驟根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。另外對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性;消化分離法的操作步驟實驗完畢應(yīng)及時清理所用物品，注意臺面整潔；待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個細(xì)胞/mL；根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種消化分離法的注意事項(2)原代細(xì)胞的維持穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；在倒置顯微鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)；離心法傳代離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng);首次傳代應(yīng)注意以下幾點：有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。謹(jǐn)慎使用酒精燈，不能在有明火的情況下加、換酒D.消化分離法的注意事項組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。消化后組織不僅要盡量使消化液失活，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作4.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細(xì)胞最接近和最能反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細(xì)胞分化等實驗研究。4.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法(1)組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長。(1)組織塊培養(yǎng)法4.過程：4.過程：細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件（2）消化培養(yǎng)法（2）消化培養(yǎng)法（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法（4）器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)；器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。（4）器官培養(yǎng)三、

細(xì)胞的原代培養(yǎng)和維持1.原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)：

靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)三、細(xì)胞的原代培養(yǎng)和維持細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系5.如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株和細(xì)胞系？多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株A.靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性;細(xì)胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L;培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng);小牛血清濃度為10%-80%;應(yīng)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮;待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。A.靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求B.懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求（以血液細(xì)胞培養(yǎng)為例）

原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細(xì)胞；短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行；細(xì)胞濃度可在5-8×109/L范圍內(nèi)進(jìn)行分瓶實驗；長期培養(yǎng)時，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長；一般每隔3天需半量換液一次；細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時才能進(jìn)行。B.懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求（以血液細(xì)胞培養(yǎng)為例）(2)原代細(xì)胞的維持貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，未達(dá)到飽和密度，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液。懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法。(2)原代細(xì)胞的維持離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；5ml/孔接種于培養(yǎng)板，6－12h后觀察標(biāo)記含單個細(xì)胞的孔。人員流動：原則為進(jìn)出細(xì)胞室應(yīng)按次序開、關(guān)門，只有將前面打開的門關(guān)閉后才允許打開下一個門，出入線路絕對不能逆行，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。去除無用組織和避免干燥；懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求（以血液細(xì)胞培養(yǎng)為例）消化分離法的操作步驟（1）細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長的細(xì)胞系。嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。物品進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)；穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；②原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細(xì)胞繁殖的“代”數(shù)；首次傳代應(yīng)注意以下幾點：吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機械損傷。雞（鴨）鳥類胚胎組織取材取材要注意新鮮和保鮮，取材部位準(zhǔn)確；對不符合凈化室安全規(guī)定的行為主動報告主管老師。2、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；2、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代首次傳代應(yīng)注意以下幾點：

細(xì)胞生長密度不高時，不能急于傳代。原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時間。吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機械損傷。首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。首次傳代應(yīng)注意以下幾點：根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。半懸浮生長細(xì)胞傳代（293細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。3、傳代培養(yǎng)的方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種3、傳代培養(yǎng)的方法貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；用D-Hank’s液洗兩遍；加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培養(yǎng)瓶，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，可見到細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大時迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離消化液；加培養(yǎng)液中止消化；吸取適量細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)內(nèi)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；消化傳代的步驟消化傳代的步驟細(xì)胞消化過程鏡下觀察細(xì)細(xì)胞消化的最佳程度細(xì)胞消化的最佳程度四、原代細(xì)胞的純化和克隆體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長，為了保證實驗結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實驗，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實驗研究的重要一步。四、原代細(xì)胞的純化和克隆1.細(xì)胞的純化細(xì)胞的純化分為自然純化：長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞，最后留下生長優(yōu)勢旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。如腫瘤突變細(xì)胞通過此方法建立細(xì)胞系。人工純化：利用人為手段造成某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。主要有以下5種方法。Hela

cell1.細(xì)胞的純化Helacell（1）細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長的細(xì)胞系。（2）酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開，達(dá)到純化的目的。另外對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。Epitheliumcellfibroblast（1）細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出（3）機械刮除法

原代培養(yǎng)時,如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上?？刹捎脵C械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域，（3）機械刮除法經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等；離心法傳代離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。應(yīng)嚴(yán)格無菌，盡快培養(yǎng)；離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；消化分離法的操作步驟原代培養(yǎng)時,如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。選擇第三步:

時間鋪滿后

(可用于生長區(qū)域已被利用)

變化通過密度抑制

密度依賴性敏感的細(xì)胞(如正常細(xì)胞)

密度依賴性敏感低的細(xì)胞(如永生性細(xì)胞)吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機械損傷。多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。吸取適量細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。吸取適量細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。長期培養(yǎng)時，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長；滅菌(sterilization)經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.（4）反復(fù)貼壁法成纖維細(xì)胞其貼壁過程快，能在短時間內(nèi)完成附著過程，而上皮細(xì)胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號（5）電烙篩選法在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，可用烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。（5）電烙篩選法2.細(xì)胞的克隆化細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，即從細(xì)胞群體中分離出一個細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個克隆，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株。2.細(xì)胞的克隆化主要的克隆方法有5種毛細(xì)管克隆法有限稀釋克隆法平皿克隆分離法軟瓊脂克隆分離法單細(xì)胞顯微克隆法主要的克隆方法有5種（1）毛細(xì)管克隆法：

將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個細(xì)胞/mL；取10mL稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm，長為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（30～50只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中；在倒置顯微鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)；在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個克隆的細(xì)胞群體。（1）毛細(xì)管克隆法：（2）有限稀釋克隆法：取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺盼藍(lán)染色計數(shù)，測定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）。消化法制備低密度細(xì)胞懸液（1－2個/ml），0.5ml/孔接種于培養(yǎng)板，6－12h后觀察標(biāo)記含單個細(xì)胞的孔。待孔內(nèi)細(xì)胞增至500-600個時進(jìn)行分離培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。待克隆長至孔底面的1/3～1/2時，可用消化法將96孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移至24孔板中進(jìn)行擴大培養(yǎng)。（2）有限稀釋克隆法：細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/（3）平皿克隆分離法：

將對數(shù)生長期細(xì)胞制備單個細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。將上述細(xì)胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃5%CO2下培養(yǎng)1周或更長。若有明顯的克隆形成時方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：（3）平皿克隆分離法：細(xì)胞原代培養(yǎng)課時細(xì)胞原代培養(yǎng)課時78（優(yōu)選）細(xì)胞原代培養(yǎng)課時（優(yōu)選）細(xì)胞原代培養(yǎng)課時1.細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則（1）準(zhǔn)入制度

一、無菌培養(yǎng)基本技術(shù)在本室工作的實驗人員應(yīng)嚴(yán)格遵守本室工作守則，外來人員在進(jìn)入凈化室工作之前，必須接受培訓(xùn)；沒有經(jīng)過培訓(xùn)的人員不得單獨進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室工作；進(jìn)入培養(yǎng)后要保持安靜，不得大聲喧嘩。1.細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則一、無菌培養(yǎng)基本技術(shù)在本室工（2）安全制度細(xì)胞必須注意安全用電；謹(jǐn)慎使用酒精燈，不能在有明火的情況下加、換酒精；實驗人員自覺維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對室內(nèi)的儀器如CO2孵箱等要經(jīng)常注意機器運轉(zhuǎn)情況，發(fā)現(xiàn)問題及時檢修或報告請人檢修；離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；對不符合凈化室安全規(guī)定的行為主動報告主管老師。

（2）安全制度安全??！安全?。。?）.衛(wèi)生消毒制度一般情況下細(xì)胞間每日消毒一次（包括緩沖間），方法為紫外線消毒（每次30分鐘至1小時）一次，另外每周用10％乳酸在緊閉門窗下熏蒸30分鐘；實驗完畢應(yīng)及時清理所用物品，注意臺面整潔；及時清洗所用隔離衣，并高壓滅菌后存放于指定位置；除實驗必須的用品外，其它物品不得帶入細(xì)胞室；細(xì)胞室內(nèi)所用儀器及附屬設(shè)備均應(yīng)在指定范圍內(nèi)使用，不得隨意轉(zhuǎn)移地點，以便他人順利使用；細(xì)胞室實施值日生負(fù)責(zé)制，值班人員負(fù)責(zé)檢查室內(nèi)是否保持清潔整齊，督促違反規(guī)定者改正錯誤。（3）.衛(wèi)生消毒制度細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件（4）出入制度細(xì)胞培養(yǎng)室共有兩個緩沖間，進(jìn)入每個緩沖間必須更換指定消毒的拖鞋；穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；人員流動：原則為進(jìn)出細(xì)胞室應(yīng)按次序開、關(guān)門，只有將前面打開的門關(guān)閉后才允許打開下一個門，出入線路絕對不能逆行，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。物品流動：所有進(jìn)出細(xì)胞培養(yǎng)室的物品均應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行；物品進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；人員進(jìn)入層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室后，關(guān)閉紫外燈，打開傳遞窗內(nèi)側(cè)門，取出物品；物品出室次序與以上進(jìn)室次序相反，但不需紫外線照射。（4）出入制度無菌間細(xì)胞室緩沖間無菌間細(xì)胞室緩沖間2.細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)

體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。2.細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個細(xì)胞/mL；細(xì)胞生長密度不高時，不能急于傳代。培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng);因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。半懸浮生長細(xì)胞傳代（293細(xì)胞）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材消化后組織不僅要盡量使消化液失活，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。影響胰蛋白酶作用的主要因素需及時傳代

傳不傳代及何時傳代

根據(jù)

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征去除無用組織和避免干燥；有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptictechnique)培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)

無菌(asepsis)無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptictechnique)Termstoremember對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。【操作野消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件

原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。【洗手和著裝】原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；然后紫外線消毒30min。需及時傳代

傳不傳代及何時傳代

根據(jù)

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。主要的克隆方法有5種細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性;含義:包含

①原代培養(yǎng)實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長繁殖；2、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代長期培養(yǎng)時，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長；原則上和外科手術(shù)相同。25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；成纖維細(xì)胞其貼壁過程快，能在短時間內(nèi)完成附著過程，而上皮細(xì)胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。

在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。培養(yǎng)瓶滴管、試管、吸管【火焰消毒】進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。在

進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換?！静僮鳌窟M(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件二、原代培養(yǎng)

Primaryculture概念

從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前的時期，一個特征性的必然的生長階段。完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過渡和適應(yīng)過程，恢復(fù)了分裂增殖與生長發(fā)育的能力。1.細(xì)胞原代培養(yǎng)概論二、原代培養(yǎng)Primaryculture含義:包含

①原代培養(yǎng)實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長繁殖；

②原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細(xì)胞繁殖的“代”數(shù)；

③原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液。含義:包含

①原代培養(yǎng)實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿特點(1)性質(zhì)

①性狀似體內(nèi)，可表達(dá)某些形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能,更能代表活體細(xì)胞最接近在體時的情況；

②細(xì)胞異質(zhì)性細(xì)胞成分混雜，除目的細(xì)胞之外，

其它各種細(xì)胞還存在；

③細(xì)胞活躍移動，分裂不旺盛；

④相互依賴性強，獨立生存能力差,不易單個培養(yǎng)。特點特點(2)發(fā)展過程:調(diào)整組成

原代培養(yǎng)的產(chǎn)生選擇

結(jié)果:形成相對均一的細(xì)胞系選擇第一步:形成原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)

組織塊:能遷移出的細(xì)胞

消化分散:操作中能生存、附著，能懸浮生存。

特點特點發(fā)展過程選擇第二步:

時間數(shù)小時后至鋪滿

(匯合confluence)

變化數(shù)小時后至進(jìn)一步選擇中

3種情況:能增殖

能存活

不能存活

細(xì)胞類型繼續(xù)改變,至鋪滿

特點發(fā)展過程經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；待孔內(nèi)細(xì)胞增至500-600個時進(jìn)行分離培養(yǎng)。實驗完畢應(yīng)及時清理所用物品，注意臺面整潔；待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個克隆的細(xì)胞群體。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞分散開。內(nèi)臟和實體瘤的取材血液細(xì)胞的取材物品進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；應(yīng)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗人員自覺維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對室內(nèi)的首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長，為了保證實驗結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實驗，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實驗研究的重要一步。消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。更能代表活體細(xì)胞最接近在體時的情況；此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。雞（鴨）鳥類胚胎組織取材如腫瘤突變細(xì)胞通過此方法建立細(xì)胞系。特點發(fā)展過程選擇第三步:

時間鋪滿后

(可用于生長區(qū)域已被利用)

變化通過密度抑制

密度依賴性敏感的細(xì)胞(如正常細(xì)胞)

密度依賴性敏感低的細(xì)胞(如永生性細(xì)胞)經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可特點發(fā)展過程需及時傳代

傳不傳代及何時傳代

根據(jù)

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征特點發(fā)展過程2.原代細(xì)胞的取材

人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。2.原代細(xì)胞的取材人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的（1）取材的基本要求取材要注意新鮮和保鮮，取材部位準(zhǔn)確；應(yīng)嚴(yán)格無菌，盡快培養(yǎng)；防止機械損傷；去除無用組織和避免干燥；應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等；作好記錄。（1）取材的基本要求細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件（2）各類組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實體瘤的取材血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動物組織取材人胚體組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材（2）各類組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2－4平方厘米。內(nèi)臟和實體瘤的取材內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實體瘤的取材血液細(xì)胞的取材血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時應(yīng)注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材

嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動物組織取材①鼠胚組織取材首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。動物組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件3.原代細(xì)胞的分離和制作人或動物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來。(1)懸浮細(xì)胞的分離方法?組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。3.原代細(xì)胞的分離和制作(1)懸浮細(xì)胞的分離方法(2)實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。A.機械分散法方法:特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。(2)實體組織材料的分離方法B.消化分離法組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。B.消化分離法酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞分散開。酶消化分離法影響胰蛋白酶作用的主要因素

細(xì)胞類型酶的活力酶的濃度溫度pH無機鹽離子消化時間影響胰蛋白酶作用的主要因素膠原酶（CollagenaseCollagenase）消化法膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。膠原酶（CollagenaseCollagenase）消化細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件C.消化分離法的操作步驟剪切加液漂洗消化棄去消化液漂洗機械分散C.消化分離法的操作步驟根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。另外對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性;消化分離法的操作步驟實驗完畢應(yīng)及時清理所用物品，注意臺面整潔；待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個細(xì)胞/mL；根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種消化分離法的注意事項(2)原代細(xì)胞的維持穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；在倒置顯微鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)；離心法傳代離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)。培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng);首次傳代應(yīng)注意以下幾點：有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。謹(jǐn)慎使用酒精燈，不能在有明火的情況下加、換酒D.消化分離法的注意事項組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。消化后組織不僅要盡量使消化液失活，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作4.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細(xì)胞最接近和最能反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細(xì)胞分化等實驗研究。4.原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法(1)組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長。(1)組織塊培養(yǎng)法4.過程：4.過程：細(xì)胞原代培養(yǎng)課時課件（2）消化培養(yǎng)法（2）消化培養(yǎng)法（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法（4）器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)；器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。（4）器官培養(yǎng)三、

細(xì)胞的原代培養(yǎng)和維持1.原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持(1)原代細(xì)胞培養(yǎng)：

靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)三、細(xì)胞的原代培養(yǎng)和維持細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系5.如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株和細(xì)胞系？多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株A.靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性;細(xì)胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L;培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng);小牛血清濃度為10%-80%;應(yīng)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮;待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。A.靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求B.懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求（以血液細(xì)胞培養(yǎng)為例）

原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細(xì)胞；短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行；細(xì)胞濃度可在5-8×109/L范圍內(nèi)進(jìn)行分瓶實驗；長期培養(yǎng)時，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長；一般每隔3天需半量換液一次；細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時才能進(jìn)行。B.懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求（以血液細(xì)胞培養(yǎng)為例）(2)原代細(xì)胞的維持貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時，未達(dá)到飽和密度，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液。懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法。(2)原代細(xì)胞的維持離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；5ml/孔接種于培養(yǎng)板，6－12h后觀察標(biāo)記含單個細(xì)胞的孔。人員流動：原則為進(jìn)出細(xì)胞室應(yīng)按次序開、關(guān)門，只有將前面打開的門關(guān)閉后才允許打開下一個門，出入線路絕對不能逆行，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。去除無用組織和避免干燥；懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求（以血液細(xì)胞培養(yǎng)為例）消化分離法的操作步驟（1）細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長的細(xì)胞系。嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。物品進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時，應(yīng)先打開傳遞窗外側(cè)門，將物品放入傳遞窗，關(guān)閉傳遞窗外側(cè)門，打開紫外燈照射15分鐘；操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)；穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行離開細(xì)胞室；②原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細(xì)胞繁殖的“代”數(shù)；首次傳代應(yīng)注意以下幾點：吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機械損傷。雞（鴨）鳥類胚胎組織取材取材要注意新鮮和保鮮，取材部位準(zhǔn)確；對不符合凈化室安全規(guī)定的行為主動報告主管老師。2、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。離開凈化室必須斷開必要的儀器電源；2、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代首次傳代應(yīng)注意以下幾點：

細(xì)胞生長密度不高時，不能急于傳代。原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時間。吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機械損傷。首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。首次傳代應(yīng)注意以下幾點：根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。半懸浮生長細(xì)胞傳代（293細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。3、傳代培養(yǎng)的方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種3、傳代培養(yǎng)的方法貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；用D-Hank’s液洗兩遍；加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培養(yǎng)瓶，在倒置顯微